摘要：【目的】分析100種植物中參與草酸乙酰化降解途徑的草酰-CoA合成酶（AAE3）、草酰-CoA脫羧酶（OCD）和甲酸脫氫酶（FDH）基因的密碼子偏好性及其影響因素，并分析其適配的異源表達(dá)受體，為揭示AAE3、OCD和FDH基因在植物中的遺傳修飾和進(jìn)化規(guī)律及提高其異源表達(dá)效率提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟\(yùn)用CodonW 1.4.2、CUSP及Python等軟件工具，通過(guò)PR2-plot分析、ENC-plot分析、相對(duì)同義密碼子使用量（RSCU）分析、中性繪圖分析及密碼子使用頻率比較分析，深入解析AAE3、OCD和FDH基因編碼區(qū)（CDS）序列的堿基組成特征、密碼子偏好及其主要影響因素、高頻密碼子、最優(yōu)密碼子及異源表達(dá)適配受體?！窘Y(jié)果】AAE3、OCD和FDH基因CDS序列在不同位置上GC含量差異較大，但三者均偏好使用以G/C結(jié)尾的密碼子。AAE3、OCD和FDH基因表達(dá)水平較低，且密碼子偏好性均較弱，偏好性排序：FDHgt;AAE3gt;OCD。在進(jìn)化過(guò)程中AAE3、OCD和FDH基因的密碼子偏好性主要受自然選擇的影響，突變壓力對(duì)其影響則較小。RSCU分析結(jié)果顯示，AAE3、OCD和FDH基因分別有31、26和27個(gè)高頻密碼子，分別有19、14和9個(gè)最優(yōu)密碼子，其中AAE3和FDH基因的最優(yōu)密碼子均以G/C結(jié)尾，而OCD基因的最優(yōu)密碼子中以G/C結(jié)尾的有8個(gè)，占最優(yōu)密碼子的57.14%。擬南芥和煙草可作為AAE3、OCD和FDH基因的異源表達(dá)適配受體，當(dāng)選擇大腸桿菌和釀酒酵母作為異源表達(dá)受體時(shí)，則需要優(yōu)化較多的密碼子（17～19個(gè)）?！窘Y(jié)論】AAE3、OCD和FDH基因在進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)出較相似的密碼子偏好特征，選擇異源表達(dá)受體時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮擬南芥和煙草。

關(guān)鍵詞：草酰-CoA合成酶；草酰-CoA脫羧酶；甲酸脫氫酶；密碼子偏好性；最優(yōu)密碼子

中圖分類號(hào)：S503.53文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）10-2990-13

Codon usage bias for genes involved in oxalate acetylation degradation pathway

LUO Yu1，LI Qi2，SHI Hui-neng2，YANG Hong-lei2，SONG Zhan-hua2，YANG Jian-li3，F(xiàn)AN Wei3*

（1College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China；2College of Resources and Environment，Yunan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China；3College of Landscape and Horticulture，Yunnan Agricultural University/Key Laboratory of VegetableBiology of Yunnan，Kunming，Yunnan 650201，China）

Abstract：【Objective】This study aimed to explore the condon preference of oxalyl-CoA synthase（AAE3），oxalyl-CoA decarboxylase（OCD）and formate dehydrogenase（FDH）genes involved in the oxalate acetylation degradation pathway among 100 plant species，as well as the factors that influenced condon preference，and analyzed their suitable heterologous expression receptors，which could provide scientific basis for understanding the genetic modification and evolution ofAAE3，OCD and FDH genes in plants，and for enhancing their heterologous expression efficiency.【Method】Comprehensively used CodonW 1.4.2，CUSP and Python softwares，through PR2-plot analysis，ENC-plot analysis，rela-tive synonymous codon usage（RSCU）analysis，neutral plot analysis and codon frequency comparison analysis，the base composition characteristics，codon preference and its main influencing factors，high-frequency codons，optimal codons and heterologous expression adaptation receptors of AAE3，OCD，and FDH coding sequences（CDS）were deeply eluci-dated.【Result】The GC content of the CDS sequences of AAE3，OCD and FDH genes varied greatly at different posi-tions，but they all preferred codon ending with G/C.The gene expression levels of AAE3，OCD and FDH genes were low，and the codon preference was weak，with the degree ofFDHgt;AAE3gt;OCD.During evolution，the codon preference of AAE3，OCD and FDH genes was mainly influenced by natural selection，with mutation pressure having little effect.RSCU analysis showed that AAE3，OCD and FDH genes had 31，26 and 27 high-frequency codons，and 19，14 and 9 op-timal codons respectively，among which the optimal codons ofAAE3 and FDH genes allendedin G/C，and 8 of the opti-mal codons of OCD gene ended in G/C，accounting for 57.14%of the optimal codons.Arabidopsis thaliana and Nico-tiana tabacum could serve as adaptive receptors for heterologous expression ofAAE3，OCD and FDH genes.When Esche-richia coli and Saccharomyces cerevisiae were selected as heterologous expression receptors，more codons（17-19）needed to be modified.【Conclusion】AAE3，OCD and FDH genes exhibit highly similar codon preference characteristics during evolutionary process，and the selection of heterologous expression receptors should prioritize A.thaliana and N.tabacum.

Key words：oxalyl-CoA synthase；oxalyl-CoA decarboxylase；formate dehydrogenase；codon preference；optimal codon

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31760584）；Fok Ying Tung Education Founda-tion for Young Teachers in Colleges and Universities（161100）

0引言

【研究意義】乙?；緩绞且粭l依賴于CoA和ATP的草酸降解途徑（Giovanelli and Tobin，1961）。草酸首先在草酰-CoA合成酶（Oxalyl-CoA synthase，AAE3）乙酰化作用下生成草酰-CoA，再經(jīng)過(guò)草酰-CoA脫羧酶（Oxalyl-CoA decarboxylase，OCD）生成甲酰-CoA，之后被甲酰-CoA水解酶（Formyl-CoA hydrolase）水解生成甲酸，最后在甲酸脫氫酶（For-mate dehydrogenase，F(xiàn)DH）作用下降解為CO2。目前，雖然已從許多植物中鑒定出編碼催化該途徑第1、2、4步的關(guān)鍵酶基因，但這些基因也同時(shí)存在于細(xì)菌和真菌等多種生物中，在基因進(jìn)化、表達(dá)效率及密碼子使用偏好性方面往往存在較大差異。密碼子偏好性（Codon usage bias）作為物種進(jìn)化的重要特征之一，廣泛存在于各種生物體的基因組中，且在編碼基因的非均衡使用和調(diào)控基因表達(dá)效率等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用（Brule and Grayhack，2017；Zhang et al.，2018）。因此，研究植物草酸乙酰化代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的密碼子偏好性不僅有助于解釋不同物種間或同一物種內(nèi)的基因進(jìn)化規(guī)律和突變規(guī)律，還對(duì)優(yōu)化基因表達(dá)、載體構(gòu)建和未知基因的功能解析具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】草酸是一種簡(jiǎn)單的低分子量二羧酸，作為碳代謝途徑的副產(chǎn)物廣泛存在于藻類、真菌、地衣和植物中。草酸在植物的許多生物學(xué)和代謝進(jìn)程中扮演著重要的作用，例如參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)pH和無(wú)機(jī)離子的穩(wěn)態(tài)（Osmond，1963；Nakata，2003）、螯合解毒活性鋁離子和鉛離子（Yang et al.，2000；Klug and Horst，2010）及防御病蟲(chóng)害（Korth etal.，2006）等。雖然植物中的草酸具有多方面有益作用，但當(dāng)細(xì)胞過(guò)多的積累或長(zhǎng)期暴露于強(qiáng)酸環(huán)境下則會(huì)導(dǎo)致一系列生理問(wèn)題的發(fā)生，包括干擾細(xì)胞膜完整性和線粒體代謝進(jìn)程、誘發(fā)金屬離子沉淀和自由基的形成等（Li etal.，2022b）。這就要求植物組織中的草酸水平必須被精細(xì)的調(diào)控才能維持合理的細(xì)胞代謝和健康。自然界中的細(xì)菌、真菌和植物已進(jìn)化出一系列的草酸降解方式，主要包括氧化、脫羧和乙酰化3種途徑（Li etal.，2022b），其中氧化（存在于細(xì)菌、真菌和單子葉植物）和脫羧（存在于細(xì)菌和真菌）途徑介導(dǎo)的草酸降解并不存在于雙子葉植物中。因此，乙?；緩降陌l(fā)現(xiàn)為調(diào)節(jié)植物中的草酸降解提供了一種替代途徑，從一定程度上彌補(bǔ)了植物調(diào)節(jié)草酸代謝功能。目前，關(guān)于植物草酸乙?；x途徑中的AAE3、OCD和FDH基因已在不同物種中被鑒定，并在提高植物耐鋁性（Han-son and Roje，2001；Wang et al.，2016，2018a；Lou et al.，2016b；He etal.，2023）、誘導(dǎo)植物真菌抗性（Fos-teretal.，2012）及促進(jìn)種子萌發(fā)、胚乳發(fā)育和籽粒品質(zhì)提高（Yang et al.，2018；Foster et al.，2021）等方面發(fā)揮重要作用。然而，當(dāng)這些基因在蛋白表達(dá)時(shí)的效率存在較大差異，會(huì)導(dǎo)致酶的催化活性高低不一（Km為81μmol/L～1.73 mmol/L）（Foster et al.，2016；Lou et al.，2016a；Peng et al.，2016；Xian et al.，2020；Li etal.，2022a）。例如番茄中SlAAE3-2基因（Solyc 06g035960.2.1）的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SlAAE3-1基因（Solyc03g025720.2.1）及其他已報(bào)道的AAE3基因表達(dá)量（Li etal.，2022a）。飯豆VuFDH（Km=121μmol/L）體外酶催化活性明顯高于番茄SlFDH（Km=2.087 mmol/L）（Lou et al.，2016b；He et al.，2023）。近年來(lái)，對(duì)不同植物中某一特定基因的密碼子偏好性探索已成為基因研究的熱點(diǎn)，并且利用密碼子優(yōu)化的外源基因已獲得了重組蛋白高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株（Agarwal et al.，2008；Jabeen et al.，2010）。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的cry1Ah基因與Cry1Ah蛋白靶向葉綠體相結(jié)合后，賦予煙草更強(qiáng)的抗蟲(chóng)能力（Li etal.，2013）；將ThIPK2基因的密碼子優(yōu)化后轉(zhuǎn)入普通小麥中，轉(zhuǎn)基因小麥的抗旱性顯著提高（Zhang et al.，2020）。此外，在不改變氨基酸序列的情況下，通過(guò)改變278個(gè)核苷酸，將GC含量降低到51.05%，紅景天UGT72B14蛋白表達(dá)量顯著提高4.8倍，且具有同樣高的活性，同時(shí)紅景天苷的產(chǎn)量提高了3.2倍（Xue et al.，2016）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于不同物種間基因堿基的差異限制了植物草酸乙酰化降解途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的效率?？赏ㄟ^(guò)密碼子優(yōu)化調(diào)控植物草酸乙?；x途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，提高植物中這些基因的表達(dá)效率，增強(qiáng)其酶的催化活性。但目前未見(jiàn)草酸乙?；到馔緩疥P(guān)鍵酶基因密碼子偏好性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)100種植物中AAE3、OCD和FDH基因的堿基組成特征、密碼子偏好性及其主要影響因素進(jìn)行分析，并篩選最優(yōu)密碼子和異源表達(dá)適配系統(tǒng)，為揭示植物草酸降解乙?；緩街嘘P(guān)鍵酶基因的遺傳修飾和進(jìn)化規(guī)律及在翻譯水平上提高其異源表達(dá)效率提供理論參考。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源及處理

從NCBI和Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索下載100種植物基因組的編碼區(qū)（CDS）序列，以番茄AAE3、OCD和FDH基因作為Query序列，檢索100種植物的AAE3、OCD和FDH基因序列信息。從獲得的CDS序列篩選出完整的CDS序列（同時(shí)具備起始密碼子和終止密碼子，且堿基數(shù)為3的整數(shù)倍），且CDS序列長(zhǎng)度大于300 bp，最后去除重復(fù)的序列（Gómez et al.，2020）。最終在100種植物中分別獲得AAE3（185個(gè)）、OCD（125個(gè)）和FDH（174個(gè)）基因CDS序列用于后續(xù)分析。100種植物包括81種雙子葉植物、9種單子葉植物、7種木蘭綱植物、1種苔綱植物、1種石松綱植物和1種真蘚植物綱，具體信息見(jiàn)表1。

從密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）下載大腸桿菌、擬南芥、本氏煙草和釀酒酵母4種模式生物的密碼子使用頻率數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.2密碼子相關(guān)參數(shù)計(jì)算

通過(guò)CodonW 1.4.2（http：//codonw.sourceforge.net/）、CUSP（http：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/）及Python分析CDS序列的密碼子使用情況。密碼子偏好使用參數(shù)標(biāo)包括GC含量、密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon adaptation index，CAI）、密碼子偏好性指數(shù)（Codon bias index，CBI）、同義密碼子第3位（A、T、G和C）的含量（A3s、T3s、G3s和C3s）、同義密碼子第3位的GC含量（GC3s）、密碼子有效個(gè)數(shù)（Effective number of codons，ENC）和相對(duì)同義密碼子使用量（Relative synonymous codon usage，RSCU）（張揚(yáng)等，2022）。其中，ENC是評(píng)價(jià)基因整體密碼子偏好性的重要參數(shù)，可反映密碼子家族中同義密碼子非均衡使用的偏好程度，當(dāng)ENClt;35.00，表示密碼子偏好性強(qiáng)；當(dāng)ENCgt;50.00，表示密碼子偏好性弱（Gómezetal.，2020）。此外，利用Python程序分別計(jì)算篩選出的AAE3、OCD和FDH基因平均GC含量及密碼子第1、2、3位的GC含量（GC1、GC2、GC3）（早浩龍等，2023）

1.3中性繪圖分析

突變壓力和自然選擇是影響密碼子偏好性的2個(gè)重要因素。分別計(jì)算100種植物中AAE3、OCD和FDH基因CDS序列的GC1和GC2平均值（GC12）。以GC12為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)作中性分析散點(diǎn)圖，對(duì)其進(jìn)行直線擬合分析，確定影響AAE3、OCD和FDH基因密碼子偏好性的主要因素。當(dāng)直線回歸斜率接近1，GC12與GC3相關(guān)性越高，即基因幾乎沿對(duì)角線分布，則密碼子偏好性主要受突變影響，反之則主要受自然選擇的影響（Zu et al.，2022）。

1.4 PR2-plot分析

PR2-plot是考察突變壓力和自然選擇對(duì)密碼子偏好性影響的方法之一。如果密碼子偏好性主要受突變壓力的影響，則A/T與G/C比例在基因或基因組的簡(jiǎn)并密碼子中是平衡的，若A/T與C/G比例相差過(guò)大，則密碼子偏好性可能受自然選擇及其他因素影響（李亞麒等，2023）。為避免密碼子第3位堿基A/T和G/C突變的不平衡，通過(guò)統(tǒng)計(jì)100種植物185個(gè)AAE3、125個(gè)OCD和174個(gè)FDH基因CDS序列的T3s、C3s、A3s和G3s，并以A3s/（A3s+T3s）為縱坐標(biāo)，G3s/（G3s+C3s）為橫坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，從而分析CDS序列中嘌呤和嘧啶間的相對(duì)關(guān)系（尹為治等，2020）。當(dāng)DNA 2條互補(bǔ)鏈之間存在堿基突變或選擇偏性時(shí)，則A3/（A3+T3）和G3/（G3+C3）的坐標(biāo)數(shù)值會(huì)偏離0.5的中心位置（甘穎等，2023）。

1.5 ENC-plot分析

利用ENC-plot分析除了堿基組成限制外是否還有其他因素影響密碼子偏好性。分別以100種植物中各基因GC3s為橫坐標(biāo)、ENC為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，并與ENC期望值進(jìn)行比較，ENC期望值=2+GC3s+29/［GC3s2+（1-GC3s）2］，ENC期望值代表密碼子偏好性僅受堿基組成的影響。如果每個(gè)CDS序列的真實(shí)ENC完全落在期望曲線（按ENC期望值公式繪制）上，或者落在更接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的區(qū)域內(nèi)，則GC3s可能是密碼子使用的唯一決定因素；若CDS序列的ENC真實(shí)值完全分布于期望曲線的上方，其密碼子偏好性僅受突變壓力影響；若CDS序列的ENC真實(shí)值完全分布于期望曲線的下方，密碼子偏好性僅受自然選擇影響（Novembre，2002）。

1.6 RSCU分析

為考察同義密碼子的偏好性，以RSCU表示特定密碼子在編碼對(duì)應(yīng)氨基酸的同義密碼子間的相對(duì)使用度（Wang et al.，2018b）。當(dāng)RSCUgt;1.00時(shí)，表示該密碼子使用度較高，偏好性較強(qiáng)；RSCUlt;1.00時(shí)，表示該密碼子使用度較低，偏好性較弱；當(dāng)RSCU=1.00時(shí)，表示該密碼子無(wú)偏好性（Sharp and Li，1986）。

1.7高頻密碼子和最優(yōu)密碼子確定

對(duì)CDS序列的ENC進(jìn)行排序，從兩極各選出5個(gè)基因作為高、低表達(dá)組，分別計(jì)算對(duì)應(yīng)的密碼子RSCU，所篩選高、低表達(dá)組內(nèi)對(duì)應(yīng)密碼子△RSCU之差gt;0.08時(shí)確定為高頻密碼子，并與整體密碼子的RSCU進(jìn)行結(jié)合比較。將△RSCUgt;0.08，且整體密碼子的RSCUgt;1.00（除起始密碼子、終止密碼子及色氨酸外）的高頻密碼子定義為最優(yōu)密碼子（尹為治等，2020；趙振寧等，2023）。

1.8 AAE3、OCD和FDH基因與模式生物間密碼子使用頻率比較分析

2個(gè)物種密碼子使用頻率（某密碼子個(gè)數(shù)占該物種編碼基因總密碼子個(gè)數(shù)的千分比）的比值是衡量不同物種間密碼子使用偏好性的重要指標(biāo)之一。當(dāng)2種物種密碼子使用頻率的比值≥2.0或≤0.5時(shí)（不等于0），表示這2種物種的密碼子偏好性較大，反之密碼子偏好性差異較小。為充分了解100種植物中AAE3、OCD和FDH基因密碼子偏好性，將其與擬南芥、煙草、大腸桿菌和釀酒酵母的密碼子使用頻率進(jìn)行比較（早浩龍等，2023）。通過(guò)在線程序CUSP計(jì)算密碼子使用頻率，在Excel 2019進(jìn)行各生物間密碼子使用頻率比較。

2結(jié)果與分析

2.1基因CDS序列堿基組成分析結(jié)果

通過(guò)CodonW 1.4.2、CUSP及Python對(duì)篩選出的185個(gè)AAE3、125個(gè)OCD和174個(gè)FDH基因CDS序列進(jìn)行堿基組成分析，結(jié)果如圖1所示。AAE3、OCD和FDH基因CDS序列的T3s分別為0.30、0.39、0.41，A3s分別為0.25、0.24和0.28，而C3s分別為0.35、0.26和0.28，G3s分別為0.32、0.32和0.28，表明AAE3、FDH和OCD基因密碼子第3位堿基均偏好使用G/C。

CAI反映了編碼某個(gè)蛋白的所有密碼子相對(duì)于這個(gè)基因均使用最優(yōu)密碼子的情況下的適應(yīng)系數(shù)。該值越大表示適應(yīng)性越強(qiáng)，其基因表達(dá)水平越高。AAE3、OCD和FDH基因的CAI分別為0.21、0.21和0.22，表明AAE3、OCD和FDH基因表達(dá)水平均較低。AAE3、OCD和FDH基因的ENC分別為28.36～61.00、41.16～60.05和33.51～61.00，平均值分別為54.67、52.26和53.34，其中ENCgt;50.00的CDS序列較多（表2），表明AAE3、OCD和FDH基因的密碼子偏好性均較弱，其偏好性排序?yàn)镕DHgt;AAE3gt;OCD。

AAE3、OCD和FDH基因的GC含量平均值分別為0.52、0.51和0.47，GC3s平均值分別為0.55、0.48和0.43。AAE3、OCD和FDH基因的CDS序列在不同位置上GC含量差異較大，GC1最高，分別為0.57、0.58和0.57，其次為GC3，分別為0.55、0.49和0.46，最低為GC2，分別為0.44、0.44和0.40，表明AAE3、OCD和FDH基因均偏好使用以G/C結(jié)尾的密碼子（表2）。

2.2高頻密碼子和最優(yōu)密碼子確定

利用CodonW 1.4.2程序?qū)?00種植物AAE3、OCD和FDH基因的CDS序列進(jìn)行RSCU分析，結(jié)果顯示，AAE3、OCD和FDH基因的高頻密碼子（RSCUgt;1.00）各有31、26和27個(gè)。對(duì)AAE3、OCD和FDH基因的ENC進(jìn)行排序，各選出兩極的5個(gè)基因（約10%）作為高、低表達(dá)基因庫(kù)，計(jì)算RSCU和△RSCU值，比較分析其最優(yōu)密碼子，結(jié)果如表3所示。高表達(dá)AAE3基因?yàn)镻vAAE3-1、PvAAE3-2、PhAAE3、OsAAE3和BdAAE3，低表達(dá)AAE3基因?yàn)镠uAAE3-1、PtAAE3-1、PeAAE3-1、PdAAE3-1和PdAAE3-2；高表達(dá)OCD基因?yàn)锳qcOCD、SvOCD、HuOCD、PvOCD和EgOCD，低表達(dá)OCD基因?yàn)镴rOCD、SmOCD1、SmOCD2、SmOCD3和SmOCD4；高表達(dá)FDH基因?yàn)镾vFDH2、SvFDH3、SbFDH2、ZmFDH2和CpuFDH4，低表達(dá)FDH基因?yàn)镮tFDH2、SmFDH1、SmFDH2、CpuFDH3和PjFDH。通過(guò)計(jì)算篩選出整體密碼子的RSCUgt;1.00且高低表達(dá)庫(kù)之差△RSCUgt;0.08的密碼子，最終確定AAE3、OCD和FDH基因的最優(yōu)密碼子分別有19、14和9個(gè)。其中，AAE3和FDH基因的最優(yōu)密碼子均以G/C結(jié)尾，占最優(yōu)密碼子的100.00%；OCD基因的最優(yōu)密碼子中以G/C結(jié)尾的有8個(gè)，占最優(yōu)密碼子的57.14%。上述結(jié)果表明AAE3、OCD和FDH基因在密碼子使用上對(duì)G/C有較強(qiáng)的偏好性，其中OCD基因的密碼子偏好性最弱。

2.3密碼子偏好性影響因素分析結(jié)果

利用PR2-plot分析AAE3、OCD和FDH基因的密碼子偏好性影響因素，結(jié)果如圖2所示。AAE3基因的大部分CDS序列位于圖中左下位置，說(shuō)明G/C和A/T使用頻率是不平衡的，其中Cgt;G、Tgt;A；OCD和FDH基因的大部分CDS序列位于圖中平面右下位置，說(shuō)明G/C和A/T使用頻率也是不平衡的，其中Ggt;C、Tgt;A，表明AAE3、OCD和FDH基因的密碼子偏好性不僅受突變壓力的影響，還受到自然選擇的影響。此外，AAE3基因中G和C含量主要分布在0.40～0.58的范圍，A和T含量主要分布在0.35～0.52的范圍；OCD基因中G和C含量主要分布在0.45～0.65的范圍，A和T含量主要分布在0.30～0.45的范圍；FDH中G和C含量主要分布在0.45～0.58的范圍，A和T含量主要分布在0.34～0.48的范圍，表明AAE3、OCD和FDH在嘌呤堿基和嘧啶堿基的使用上分別偏好使用以G/T結(jié)尾的密碼子。

ENC-plot分析結(jié)果（圖3）顯示，AAE3、OCD和FDH基因的大部分CDS序列位于期望曲線下方只有極少量數(shù)據(jù)點(diǎn)位于期望曲線上方，表明AAE3、OCD和FDH基因在進(jìn)化過(guò)程中密碼子偏好性的主要影響因素為自然選擇，其次為突變壓力及其他因素的影響，與PR2-plot分析結(jié)果一致。

通過(guò)中性繪圖分析GC12含量與GC3含量相關(guān)性，如圖4所示。絕大多數(shù)AAE3、OCD和FDH基因CDS序列分布在遠(yuǎn)離黑色虛線的兩側(cè)，進(jìn)一步表明AAE3、OCD和FDH的密碼子偏好性主要受自然選擇的影響。此外，由回歸斜率可知，突變壓力對(duì)AAE3、OCD和FDH基因影響均小于0.5且接近于0（絕對(duì)值），表明突變壓力對(duì)AAE3、OCD和FDH基因的密碼子偏好性影響較小，而自然選擇對(duì)其密碼子偏好性的影響較大。

2.4密碼子使用頻率比較分析結(jié)果

利用擬南芥、煙草、大腸桿菌和釀酒酵母4種模式生物的密碼子使用頻率與AAE3、OCD和FDH基因進(jìn)行比較分析，結(jié)果如圖5所示。AAE3基因使用偏差較大的密碼子分別有10、15、18和18個(gè)，與擬南芥的密碼子使用頻率差異最?。?0個(gè)），與其余3種模式生物的密碼子使用頻率差異較大；OCD基因使用偏差較大的密碼子分別有12、9、19和18個(gè)，其中與煙草的密碼子使用頻率差異最小（9個(gè)），與大腸桿菌的密碼子使用頻率差異最大（19個(gè)）；FDH基因與這4種模式生物密碼子使用偏差較大的密碼子分別有4、5、17和18個(gè)，與擬南芥的密碼子使用頻率差異最小（4個(gè)），與釀酒酵母的密碼子使用頻率差異最大（18個(gè)）。以上結(jié)果表明，AAE3和FDH基因的異源表達(dá)受體優(yōu)先選擇擬南芥，其次為煙草；而OCD基因優(yōu)先選擇煙草，其次為擬南芥；選擇大腸桿菌和釀酒酵母作為AAE3、OCD和FDH基因的異源表達(dá)受體時(shí)，則需對(duì)較多的密碼子（17～19個(gè)）進(jìn)行優(yōu)化，以提高其基因高效轉(zhuǎn)化表達(dá)。

3討論

密碼子偏好性代表密碼子在基因編碼中的非均衡使用，在物種基因進(jìn)化和調(diào)控及環(huán)境適應(yīng)性中起著重要作用（Foster et al.，2012；Brule and Gray-hack，2017）。大量研究表明，自然選擇和突變壓力（Sueoka and Kawanishi，2000）、氨基酸組成（Wan et al.，2004）、基因長(zhǎng)度及其表達(dá)水平（Ingvarsson，2007）等眾多因素均會(huì)影響密碼子偏好性。通過(guò)對(duì)植物基因進(jìn)行密碼子偏好性分析能幫助判斷其來(lái)源和進(jìn)化歷程，也為揭示基因家族的進(jìn)化提供了更具說(shuō)服力的理論依據(jù)。本研究對(duì)100種植物乙酰化草酸降解途徑中3個(gè)關(guān)鍵酶基因AAE3、OCD和FDH進(jìn)行密碼子偏好性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AAE3、OCD和FDH基因GC含量和GC3較高，在密碼子使用上更傾向于使用以G/C結(jié)尾的密碼子，說(shuō)明核苷酸組成在AAE3、OCD和FDH基因密碼子偏好性中起著重要作用，與Li等（2017b）、Li等（2019）、Liu等（2019）的研究結(jié)果一致。此外，不同植物CaM1基因中均偏好G/C結(jié)尾（李晨輝等，2019），可能是由于這些基因均參與調(diào)控植物新陳代謝。研究表明，參與調(diào)控新陳代謝的基因偏好G/C結(jié)尾，而結(jié)構(gòu)基因或功能基因更偏好A/T結(jié)尾（Liu et al.，2005）。植物草酸乙?；到馔緩街嘘P(guān)鍵酶基因的GC3s較高可能是為了適應(yīng)環(huán)境。

偏好性起源假說(shuō)普遍認(rèn)為，突變壓力和自然選擇是影響密碼子偏好性的2個(gè)主要因素。如果突變發(fā)生在中性的第3密碼子位置，將導(dǎo)致隨機(jī)的同義密碼子選擇，其中GC和AT將在基因或基因組的簡(jiǎn)并密碼子群中按比例使用（Zhang et al.，2018）。PR2-plot和ENC-plot分析結(jié)果顯示，自然選擇可能主導(dǎo)AAE3、OCD和FDH基因密碼子偏好性的形成因素，突變壓力對(duì)密碼子偏好性的形成只起到很小的作用。研究發(fā)現(xiàn)，自然選擇是形成豆科植物IPI基因密碼子偏好性的主要原因（蔣瑞平等，2022）；茶樹(shù)氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因密碼子偏好性同時(shí)受選擇壓力和突變壓力的影響，且自然選擇壓力的影響更大（譚淳月等，2023）。因此，推測(cè)來(lái)自同一代謝途徑的關(guān)鍵酶基因密碼子使用偏好性及其形成原因可能具有一定的相似性（嚴(yán)子成等，2020）。本研究中性繪圖分析結(jié)果也表明，AAE3、OCD和FDH基因的密碼子在進(jìn)化過(guò)程中可能更多地受到自然選擇的影響，且對(duì)FDH基因影響更大，與Li等（2019）、Liu等（2019）的研究結(jié)果一致，但與Li等（2017a）的研究結(jié)果不同，推測(cè)是由于采取的分析方法不同造成了結(jié)果的差異，本研究采用目前主流的分析依據(jù)，即按照相關(guān)性及回歸曲線斜率判斷，而Li等（2017a）則根據(jù)中性繪圖中的CDS序列呈對(duì)角分布來(lái)判斷的。此外，造成這種差異還可能是不同物種中不同基因在較大環(huán)境條件差異下受到的選擇壓力不同所致；DNA變異（Suzuki，2011）、基因序列長(zhǎng)度（Ribeiro et al.，2012）、RNA結(jié)構(gòu)（Belalov and Lukashev，2013）等也可能對(duì)其產(chǎn)生影響，在一定程度上解釋了基于葉綠體基因組的分子標(biāo)記能有效對(duì)其進(jìn)行鑒定和遺傳譜系分析。

當(dāng)重組蛋白異源表達(dá)時(shí)，密碼子使用偏好性對(duì)蛋白表達(dá)水平有復(fù)雜的影響，根據(jù)密碼子的使用規(guī)則進(jìn)行密碼子優(yōu)化，可有效提高蛋白表達(dá)水平（李亞麒等，2023）。本研究確定了AAE3、OCD和FDH基因高頻密碼子和最優(yōu)密碼子，不僅有利于對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化改造，還有助于深入理解基因表達(dá)與密碼子使用偏好性之間的關(guān)系。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，AAE3和FDH基因的最優(yōu)密碼子均以G/C結(jié)尾，OCD基因以G/C結(jié)尾的密碼子占最優(yōu)密碼子的57.14%，進(jìn)一步驗(yàn)證了AAE3、OCD和FDH基因?qū)/C結(jié)尾的密碼子有更強(qiáng)的偏好性。密碼子使用頻率也和基因的表達(dá)量相關(guān)，如果外源基因使用了與轉(zhuǎn)基因受體基因相似的密碼子，可減少與對(duì)應(yīng)分子匹配的時(shí)間，使其具有較高表達(dá)量（早浩龍等，2023）。本研究發(fā)現(xiàn)，AAE3、OCD和FDH基因的CAI值均較低，說(shuō)明其表達(dá)量相對(duì)較低。因此，通過(guò)分析AAE3、OCD和FDH基因與擬南芥、煙草、大腸桿菌和釀酒酵母的密碼子使用頻率比值發(fā)現(xiàn)，AAE3、OCD和FDH基因與大腸桿菌和釀酒酵母的密碼子偏好性差異最大，與擬南芥和煙草的密碼子使用頻率差異最小。因此，擬南芥和煙草可優(yōu)先考慮作為AAE3、OCD和FDH基因的異源表達(dá)適配受體，以提高其基因表達(dá)水平，為表達(dá)系統(tǒng)中引入外源基因、優(yōu)化改造密碼子組成以及提高外源基因的表達(dá)效率提供理論參考。

4結(jié)論

AAE3、OCD和FDH基因的GC含量、GC3及GC3s較高，在密碼子使用上更傾向于使用以G/C結(jié)尾的密碼子，但在密碼子偏好性上存在一定差異。AAE3、OCD和FDH基因在進(jìn)化過(guò)程中主要受自然選擇的影響，選擇異源表達(dá)受體時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮擬南芥和煙草。

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（責(zé)任編輯陳燕）