摘要：【目的】明確貴州主要煙區(qū)煙草根結(jié)線蟲(chóng)種類、分布、發(fā)生規(guī)律及其與煙草主要根莖類病害混合發(fā)生情況，為貴州抗根結(jié)線蟲(chóng)煙草品種選育、煙葉生產(chǎn)布局、根結(jié)線蟲(chóng)病綜合防治策略制定提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā恳圆杉再F州9個(gè)市（州）主栽煙區(qū)98份疑似煙草根結(jié)線蟲(chóng)病根樣本為材料，使用染色鏡檢、雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋形態(tài)觀察及分子生物學(xué)方法對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)種類進(jìn)行鑒定；采用染色法和貝曼漏斗法對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生規(guī)律（根結(jié)線蟲(chóng)大田初侵染期、生活史周期及土壤線蟲(chóng)數(shù)量變化規(guī)律）進(jìn)行調(diào)查；采用PCR技術(shù)對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病根樣本中煙草黑脛病菌（Phytophthora nicotianae）、根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）和青枯病菌（Ralstonia solanacearum）進(jìn)行檢測(cè)?！窘Y(jié)果】98份樣本中有49份感染根結(jié)線蟲(chóng)，其中21份為花生根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne arenaria）單一侵染，占42.86%，為當(dāng)前貴州煙草根結(jié)線蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種群；11份為南方根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita）單一侵染，占22.45%；花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合種群、花生根結(jié)線蟲(chóng)與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M.javanica）混合種群侵染占比分別為30.61%和2.04%；1份未檢測(cè)出線蟲(chóng)，占2.04%。從各產(chǎn)區(qū)來(lái)看，畢節(jié)市主要為花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，安順市和貴陽(yáng)市為花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染，六盤(pán)水市主要為花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染，黔東南州和黔南州為南方根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染及花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，黔西南州主要為花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染，銅仁市為南方根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，遵義市主要為花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染。黑脛病、根黑腐病和青枯病等根莖類病害易與根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，3種病原菌的檢出率分別為4.1%、6.1%和20.4%。根結(jié)線蟲(chóng)初侵染期為栽后5～10 d，生活史周期約35 d；移栽后第15、20、25、30、35、40 d時(shí)每100 g土壤中根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)數(shù)量分別為96、74、59、38、60和83條，呈先減少后逐漸增加的趨勢(shì)?！窘Y(jié)論】貴州煙區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)種類有南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，花生根結(jié)線蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種群；9個(gè)市（州）主栽煙區(qū)均有根結(jié)線蟲(chóng)危害；根結(jié)線蟲(chóng)初侵染期為栽后5～10 d，生活史周期約35 d，根圍土壤中根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)數(shù)量隨著侵染時(shí)間的推移呈先減少后逐漸增加的趨勢(shì)；根結(jié)線蟲(chóng)不同種群混合侵染，與青枯病、黑脛病及根黑腐病混合發(fā)生情況普遍。

關(guān)鍵詞：煙草；根結(jié)線蟲(chóng)；種類分布；混合侵染；貴州

中圖分類號(hào)：S435.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）10-3013-10

Identification of tobacco root-knot nematode species and surveyon their mixed infestations with root and tuber diseasesin Guizhou

WU Xiu-qing1，2，LI Cai-bin3，LUO Jie4，MA Gui-mei5，LU Ning1，CHEN Xing-jiang1，CAO Yi1*

（1Guizhou Institute of Tobacco Science，Guiyang，Guizhou 550081，China；2School of Tobacco，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China；3Bijie Company，Guizhou Tobacco Company，Bijie，Guizhou 551700，China；4Qianxinan Company，Guizhou Tobacco Company，Xingyi，Guizhou 562400，China；5School of Life Sciences，YunnanUniversity，Kunming，Yunnan 650500，China）

Abstract：【Objective】To clarify the distribution of tobacco root-knot nematode species，the occurrence pattern and its mixed infestations with major root and stem diseases in major tobacco areas of Guizhou，and to provide scientific basis for the selection and breeding of root-knot nematode resistant tobacco varieties，tobacco production layout，and the for-mulation of integrated control strategies for root-knot nematode diseases in Guizhou.【Method】Using 98 samples of to-bacco root-knot nematode infected roots collected from the main planting areas of 9 cities（prefecture）in Guizhou as ma-terials，and the root-knot nematode species were identified by staining microscopy，morphological observation of the fe-male perineal pattern，and molecular biology methods；the root-knot nematode incidence patterns（the initial infestation period of the root-knot nematode in the field，the life-history cycle，and the change pattern of the number of nematodes in the soil）were investigated using the dyeing and the Behmann funnel methods；and PCR technology was used to test Phy-tophthoranicotianae，Thielaviopsis basicola and Ralstonia solanacearum in root-knot nematode root samples.【Result】A total of 49 of the 98 samples were infested with root-knot nematodes，of which 21 samples（42.86%）were singly infested with Meloidogynearenaria，the dominant population in Guizhou；and 11 samples（22.45%）were singly infested with M.incognita.Infestation rates of M.arenaria and M.incognita mixed population，M.arenaria and M.javanica mixed popula-tion were 30.61%and 2.04%respectively；there was 1 sample detected no root-knot nematode，which accounted for 2.04%.From the producing areas，Bijie City mainly had single infestation of M.arenaria and compound infestation ofM.arenaria and M.incognita，Anshun City and Guiyang City had infestation by single M.arenaria，Liupanshui City had mainly single infestation of M.arenaria，Qiandongnan Prefecture and Qiannan Prefecture had single infestation of M.in-cognita and compound infestation of M.incognita and M.arenaria，Qianxinan mainly had single infestation of M.are-naria，Tongren City had single infestation of M.incognita and complex infestation of M.incognita and M.arenaria，Zunyi City mainly had compound infestation of M.arenaria and M.incognita.Rhizome diseases such as black shank，root black rot and bacterial wilt wee prone to mixed infection with root-knot nematodes，the detection rates of black shank pathogen，root black rot pathogen and bacterial wilt pathogen were 4.1%，6.1%，and 20.4%；the initial infestation period of root-knot nematode was 5-10 d after planting，and it took about 35 d to complete a life history cycle；the numbers of second instar of root-knot nematode per 100 g of soil at 15th，20th，25th，30th，35th and 40th d after transplanting were 96，74，59，38，60，and 83 respectively，with a decreasing and increasing trend.【Conclusion】Root-knot nematode species in Guizhou tobacco area include M.incognita，M.arenaria，M.javanica，with M.arenaria as the dominant species；root-knot nematode is found in the main planting areas of 9 cities（prefecture）；the initial infestation period of root-knot nema-tode is 5-10 dafter planting，and the life-history cycle lasts for about 35 d，and the number of second instar larva of root-knot nematode in soil around roots shows the tendency to decrease first and then increase gradually with the increase of infestation time；mixed infestation of different populations of root-knot nematode，as well as mixed with bacterial wilt，black shank and root black rot is common.

Key words：tobacco；root-knot nematode；species distribution；mixed infestation；Guizhou

Foundation items：Major Science and Technology Project of China National Tobacco Corporation［110202101055（LS-15）］；Science and Technology Project of Guizhou Company of China National Tobacco Corporation（2021XM12，2023XM05）

0引言

【研究意義】植物寄生線蟲(chóng)被廣泛認(rèn)為是植物侵染性病害的主要病原之一，全球每年因線蟲(chóng)病侵染造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1730億美元（Ellinget al.，2013）。目前，根結(jié)線蟲(chóng)病在我國(guó)主要煙區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)可造成30%～50%的損失，該病造成的煙葉經(jīng)濟(jì)損失占侵染性病害所致?lián)p失的5.7%，且危害程度逐年上升，嚴(yán)重制約著煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展（徐興陽(yáng)等，2017；陸惠光等，2018；張宗錦等，2019；馬桂妹等，2023）。據(jù)報(bào)道，貴州作為我國(guó)第二大煙葉產(chǎn)區(qū)，年均煙草種植面積約13.33萬(wàn)ha、產(chǎn)量20萬(wàn)t，因線蟲(chóng)病常年損失30%～50%（馬云飛等，2020；李彩斌等，2021）。根結(jié)線蟲(chóng)還可誘發(fā)其他根莖類病害，從而加大經(jīng)濟(jì)損失（陸惠光等，2018）。因此，對(duì)貴州省各煙區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)種類進(jìn)行鑒定，調(diào)查其分布及與其他根莖類病害混合侵染情況和發(fā)生規(guī)律，對(duì)貴州煙草根結(jié)線蟲(chóng)病的精準(zhǔn)防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】焦永吉等（2014）通過(guò)線蟲(chóng)樣本PCR分子檢測(cè)與雌成蟲(chóng)會(huì)陰花紋形態(tài)鑒定相結(jié)合的方法對(duì)河南省8個(gè)縣煙草根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行種類鑒定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生危害的有南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）、花生根結(jié)線蟲(chóng)（M.arenaria）、北方根結(jié)線蟲(chóng)（M.hapla）和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M.javanica），其中南方根結(jié)線蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種群；楊艷梅等（2017）采用雌成蟲(chóng)會(huì)陰花紋形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)對(duì)云南省昆明、曲靖和玉溪3地?zé)煵莞Y(jié)線蟲(chóng)種類進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生危害的有南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)，花生根結(jié)線蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種群；江其朋等（2021）采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)危害四川涼山州會(huì)理縣黎溪鎮(zhèn)的煙草根結(jié)線蟲(chóng)種類進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生危害的是南方根結(jié)線蟲(chóng)；李彩斌等（2021）采用田間調(diào)查及室內(nèi)外部形態(tài)鑒定方法對(duì)畢節(jié)煙草根結(jié)線蟲(chóng)種類進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)出產(chǎn)生危害的有南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，南方根結(jié)線蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種群。根結(jié)線蟲(chóng)除在煙草上產(chǎn)生危害外，還在水稻、藥材、蔬菜和水果上產(chǎn)生危害。Wang等（2015）和Cao等（2023）首次對(duì)辣椒和玉米上根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行報(bào)道，其病原種類分別為象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M.enterolobii）和rDNA-ITS花生根結(jié)線蟲(chóng)；陳昆圓等（2022）采用形態(tài)學(xué)、rDNA-ITS序列分析和特異性引物擴(kuò)增相結(jié)合的方法對(duì)河南省許昌市、三門(mén)峽市和南陽(yáng)市等丹參種植園區(qū)的丹參根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行種類鑒定，鑒定產(chǎn)生危害的是南方根結(jié)線蟲(chóng)；徐幸等（2023）利用生物測(cè)定和根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物對(duì)中國(guó)南方15個(gè)?。ㄖ陛犑?自治區(qū)）的水稻根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定，鑒定產(chǎn)生危害的有擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)（M.gramini-cola）、北方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)，擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種群；Wu等（2023）采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法首次對(duì)云南和四川等地烏頭根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定，鑒定產(chǎn)生危害的是北方根結(jié)線蟲(chóng)；陳京環(huán)等（2024）采用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和室內(nèi)人工接種法對(duì)甘肅隴西縣黃芩根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定，鑒定產(chǎn)生危害的是北方根結(jié)線蟲(chóng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前，貴州煙區(qū)未對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的種類分布、優(yōu)勢(shì)種群、發(fā)生規(guī)律及其與煙草主要根莖類病害混合發(fā)生情況進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查和研究，導(dǎo)致育種、生產(chǎn)和植保工作處于被動(dòng)狀態(tài)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)染色鏡檢、雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋形態(tài)觀察及分子生物學(xué)方法對(duì)貴州主要煙區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)種類進(jìn)行鑒定，采用染色法和貝曼漏斗法對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生規(guī)律進(jìn)行調(diào)查，并使用煙草黑脛病菌（Phytophthora nicotianae）、根黑腐病菌（Thielaviop-sis basicola）和青枯病菌（Ralstonia solanacearum）特異引物對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)感病樣本進(jìn)行檢測(cè)，研究貴州主要煙區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)種類分布、發(fā)生規(guī)律及其與煙草主要根莖類病害混合發(fā)生情況，為貴州抗根結(jié)線蟲(chóng)煙草品種選育、煙葉生產(chǎn)布局、根結(jié)線蟲(chóng)病綜合防治策略制定等提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1田間采樣

2021年8月—2022年9月，于貴州省9個(gè)市（州）主產(chǎn)煙區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查和樣本采集，使用五點(diǎn)取樣法共采集98份疑似根結(jié)線蟲(chóng)病煙草根部樣本，詳情見(jiàn)表1。

1.2根結(jié)線蟲(chóng)的獲取

分別采用直接解剖法和貝曼漏斗法（段玉璽，2011）獲取根結(jié)線蟲(chóng)雌蟲(chóng)及2齡幼蟲(chóng)（J2）。

1.3根結(jié)線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定

1.3.1根結(jié)線蟲(chóng)染色及鏡檢剪取采集的煙根樣本，參考段玉璽（2011）的次氯酸鈉—酸性品紅染色法進(jìn)行染色，染色后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋標(biāo)本制作及觀察根結(jié)線蟲(chóng)雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋標(biāo)本制作及特征比對(duì)參考劉維志（2000）的方法，制作根結(jié)線蟲(chóng)雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋玻片貼好標(biāo)簽于顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 J2幼蟲(chóng)形態(tài)特征隨機(jī)挑選20～30條J2幼蟲(chóng)，參照張紹升等（2021）的方法進(jìn)行固定。固定后在顯微鏡下進(jìn)行測(cè)量和觀察，參考劉維志（2000）的描述進(jìn)行特征比對(duì)。

1.4根結(jié)線蟲(chóng)分子生物學(xué)鑒定

1.4.1根結(jié)線蟲(chóng)樣本總DNA提取使用FastDNA?Spin Kit for Soil（MP Biomedicals，美國(guó)）提取根結(jié)線蟲(chóng)樣本總基因組DNA。具體操作：將樣本剪成0.3～0.5 cm的根塊，研磨后加入裂解研磨管E中；加入978μL磷酸鈉緩沖液（SPB）和122μL MT緩沖液；置于渦旋儀上以6 m/s振蕩40～50 s；14000 r/min離心10～15 min；將上清液移入1.5 mL離心管中，加入250μL蛋白沉淀溶液（PPS）并晃動(dòng)混勻；14000 r/min離心5 min后將上清液轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，加入1.0 mL結(jié)合基質(zhì)；顛倒2 min靜置3 min沉淀；去除500μL上清液，結(jié)合基質(zhì)與剩余上清液重懸，吸取約600μL混合液至吸附柱中，14000 r/min離心1 min；倒掉管中液體，重復(fù)上一步直至15 mL離心管中的上清液吸盡；在吸附柱中加入500μL SEWS-M溶液，14000 r/min離心1 min后棄管中的液體；14000 r/min離心2 min后換新的收集管并在室溫下風(fēng)干5 min；往吸附柱加入50μL DES溶液，14000 r/min離心1 min；棄吸附柱，DNA提取完畢。

1.4.2根結(jié)線蟲(chóng)種類分子生物學(xué)鑒定利用4對(duì)特異性引物（表2），對(duì)提取的根結(jié)線蟲(chóng)樣本總DNA進(jìn)行特異性序列擴(kuò)增（SCAR）。PCR反應(yīng)體系50.0μL：2×Taq PCR Master Mix 25.0μL，DNA模板1.0μL，正、反向引物各1.0μL，滅菌ddH2O 22.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，58～64℃30 s，72℃30～60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。取5.0μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，并在凝膠成像儀下觀測(cè)拍照。

1.4.3煙草根結(jié)線蟲(chóng)樣本中混合感染病原菌分子檢測(cè)以提取的根結(jié)線蟲(chóng)樣本總DNA為模板，采用特異性引物（表3）分別對(duì)煙草黑脛病菌、根黑腐病菌和青枯病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同1.4.2。P1/P2、TB-5/TB-3和RSF/RSR擴(kuò)增程序參考前人相關(guān)研究（梁元存等，2004；趙永強(qiáng)等，2009；Chen et al.，2010）。取5.0μL的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳并在凝膠成像儀下觀測(cè)拍照。

1.5貴州煙草主產(chǎn)區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生規(guī)律調(diào)查

從大田根結(jié)線蟲(chóng)初侵染期、生活史周期及土壤線蟲(chóng)數(shù)量變化規(guī)律3個(gè)方面進(jìn)行煙草根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生規(guī)律調(diào)查。試驗(yàn)于2022年在畢節(jié)市大方縣大水鄉(xiāng)典型根結(jié)線蟲(chóng)病區(qū)（約0.133 ha）開(kāi)展，試驗(yàn)地塊按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)生產(chǎn)管理，不施用根結(jié)線蟲(chóng)防治藥劑。自煙苗移栽后5～40 d，每5 d隨機(jī)采集15株烤煙的根系樣本，剪取20條左右須根組成混合樣品，利用次氯酸鈉—酸性品紅染色法（段玉璽，2011）觀察根內(nèi)線蟲(chóng)及其蟲(chóng)態(tài)，確定J2初侵染期及生活史周期。栽后15 d起，采集根圍土壤，用貝曼漏斗法（段玉璽，2011）分離J2，于顯微鏡下計(jì)數(shù)水中有口針的J2，統(tǒng)計(jì)每100 g土壤中的J2數(shù)量。

2結(jié)果與分析

2.1根結(jié)線蟲(chóng)染色結(jié)果

對(duì)98份疑似根結(jié)線蟲(chóng)病煙草根部樣本進(jìn)行徹底清洗，并進(jìn)行拍照記錄（圖1）。隨后進(jìn)行染色處理，觀察結(jié)果（圖2）顯示，有49份樣本感染根結(jié)線蟲(chóng)，可清晰觀察到紫色的梨形狀雌蟲(chóng)、橢圓狀的蟲(chóng)卵以及細(xì)長(zhǎng)蠕蟲(chóng)狀的J2。

2.2根結(jié)線蟲(chóng)種類鑒定

結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)特征，在感染根結(jié)線蟲(chóng)的49份樣本中鑒定出3種根結(jié)線蟲(chóng)。（1）雌蟲(chóng)洋梨至檸檬形，頭部有2～3個(gè)環(huán)紋。體長(zhǎng)495～725μm，口針長(zhǎng)14.5～17.5μm，背食道腺開(kāi)口到口針基部球距離2～4μm（圖3-I-A）。會(huì)陰花紋輪廓呈橢圓或近圓形，背紋緊密，背弓高且頂部圓潤(rùn)而扁平，偶爾呈梯形，兩側(cè)近直角；線紋平滑至波浪狀，側(cè)線不明顯，有時(shí)分叉（圖3-I-B）。J2體長(zhǎng)335～415μm，口針長(zhǎng)9.5～13μm，尾長(zhǎng)38～55μm（圖3-I-C）。形態(tài)學(xué)觀察該種線蟲(chóng)疑似南方根結(jié)線蟲(chóng)，利用南方根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物（Mi-F/Mi-R）對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)樣本總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到了一條大小為1000bp的DNA條帶（圖3-I-D），表明所檢測(cè)樣本中線蟲(chóng)為南方根結(jié)線蟲(chóng)。（2）雌蟲(chóng)洋梨至球形，頭部有1個(gè)環(huán)紋。體長(zhǎng)510～9500μm，口針粗壯，錐部和桿部寬，背食道腺開(kāi)口至口針基部球的距離4～6μm（圖3-II-A）。會(huì)陰花紋輪廓扁平至圓形，背弓較低且線紋少有分叉，短而規(guī)則并在弓上成肩狀突起，背線和側(cè)線在側(cè)線附近交叉，線蟲(chóng)1～2個(gè)翼（圖3-II-B）。形態(tài)學(xué)觀察該種線蟲(chóng)疑似花生根結(jié)線蟲(chóng)，利用花生根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物（Far/Rar）對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)樣本總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條大小約為420 bp的DNA條帶（圖3-II-D），表明所檢測(cè)樣本中線蟲(chóng)為花生根結(jié)線蟲(chóng)。（3）雌蟲(chóng)洋梨至近球形，有突出頸部，唇區(qū)有1個(gè)環(huán)紋，體長(zhǎng)541～804μm（圖3-III-A）。會(huì)陰花紋背弓圓而扁平，線紋平滑至波浪狀，清晰側(cè)線將花紋背線和腹線分開(kāi)，分明顯的背區(qū)和腹區(qū)（圖3-III-B）；J2體長(zhǎng)400～560μm，口針長(zhǎng)9.4～11.4μm，尾長(zhǎng)47～60μm（圖3-III-C）。形態(tài)學(xué)觀察該種線蟲(chóng)疑似爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，利用爪哇根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物（Fjav/Rjav）對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)樣本總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條大小為720 bp的DNA條帶（圖3-III-D），表明所檢測(cè)樣本中線蟲(chóng)為爪哇根結(jié)線蟲(chóng)。

2.3煙草根結(jié)線蟲(chóng)種類及分布

49份感染根結(jié)線蟲(chóng)樣本中，花生根結(jié)線蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染的樣本分別有21和11份，分別占42.86%和22.45%；花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染的樣本分別有15和1份，分別占30.61%和2.04%（圖4-A）；1份未檢測(cè)出線蟲(chóng)，占2.04%。花生根結(jié)線蟲(chóng)為當(dāng)前貴州煙草根結(jié)線蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種群。

從根結(jié)線蟲(chóng)分布來(lái)看（圖4-B），畢節(jié)市主要為花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，少量南方根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染，未見(jiàn)花生根結(jié)線蟲(chóng)與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染；安順市和貴陽(yáng)市為花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染，未見(jiàn)南方根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染、花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染；六盤(pán)水市主要為花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染，少量南方根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染，未見(jiàn)花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染；黔東南州和黔南州為南方根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染及花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，未見(jiàn)花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染；黔西南州主要為花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染，少量花生根結(jié)線蟲(chóng)與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，未見(jiàn)南方根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，一份未檢測(cè)出線蟲(chóng)；銅仁市為南方根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，未見(jiàn)花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染；遵義市主要為花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，少量南方根結(jié)線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染，未見(jiàn)花生根結(jié)線蟲(chóng)與爪哇根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染。

2.4根結(jié)線蟲(chóng)樣本混合感染病原菌鑒定結(jié)果

分別采用特異性引物P1/P2、TB-5/TB-3和RSF/RSR對(duì)49份感染根結(jié)線蟲(chóng)樣本中黑脛病菌、根黑腐病菌和青枯病菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖5）共檢測(cè)出2份樣本感染煙草黑脛病菌、3份樣本感染根黑腐病菌、10份樣本感染青枯病菌，檢出率分別為4.1%、6.1%和20.4%；表明3種病原菌與根結(jié)線蟲(chóng)存在混合侵染情況。其中青枯病菌與根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染最普遍，在畢節(jié)市、遵義市、六盤(pán)水市、銅仁市和黔西南州煙草產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，黑脛病菌與根結(jié)線蟲(chóng)和根黑腐病菌與根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染情況較少，黑脛病菌與根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染主要發(fā)生在安順市，而根黑腐病菌與根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染主要發(fā)生在畢節(jié)市，并且這2種情況在銅仁市均有發(fā)生。

2.5貴州煙草主產(chǎn)區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生規(guī)律調(diào)查結(jié)果

在栽后第5 d所采集的煙根樣本經(jīng)染色后未觀察到J2，第10 d觀察到J2，據(jù)此推測(cè)，春季該樣點(diǎn)根結(jié)線蟲(chóng)初侵染期為栽后5～10 d內(nèi)（圖6-Ⅰ）;在栽后第15 d所采集的煙根樣本中出現(xiàn)根瘤（圖6-Ⅱ），第25 d及第35 d的樣本經(jīng)染色后分別可看到成熟雌蟲(chóng)和蟲(chóng)卵（圖6-Ⅲ），至此完成一個(gè)約35 d的生活史周期。

從栽后15d起定期采集土樣，在15～40 d內(nèi)每5d用貝曼漏斗法計(jì)數(shù)根圍土壤中J2數(shù)量變化。移栽后第15、20、25、30、35和40 d，每100 g根際土中J2數(shù)量分別為96、74、59、38、60和83條。土壤中J2數(shù)量在根結(jié)線蟲(chóng)侵染煙根后呈先減少后逐漸增加的變化趨勢(shì)，推測(cè)因根結(jié)線蟲(chóng)侵染煙根并定居，致使土壤中的J2數(shù)量減少，而J2在煙根獲取營(yíng)養(yǎng)發(fā)育成雌蟲(chóng)并產(chǎn)卵，新孵化出的幼蟲(chóng)進(jìn)入土壤開(kāi)啟下一個(gè)侵染周期，致使土壤中的J2數(shù)量上升。

3討論

形態(tài)學(xué)鑒定作為根結(jié)線蟲(chóng)種類鑒定的經(jīng)典手段之一，以雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋的形態(tài)學(xué)特征觀察為主，但雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋存在一定種內(nèi)變異（Coomans etal.，2012），單憑會(huì)陰花紋進(jìn)行種類鑒定精確度不高。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)中的SCAR技術(shù)憑借其引物長(zhǎng)、退火溫度高、穩(wěn)定性高及快速準(zhǔn)確的鑒定能力（楊艷梅等，2017）在煙草根結(jié)線蟲(chóng)種類鑒定中廣泛應(yīng)用。在對(duì)部分區(qū)域煙草根結(jié)線蟲(chóng)種類鑒定中，采樣范圍的局限可能會(huì)影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和普適性。本研究采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)貴州煙區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行種類鑒定和分布特征分析，采樣范圍涵蓋貴州主要煙區(qū)，研究結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性及代表性較好。

本研究通過(guò)染色法推測(cè)煙草根結(jié)線蟲(chóng)在大田中的初侵染期為栽后5～10 d，其在根內(nèi)的完整生活史周期約為35 d，與馬文清（2017）的研究結(jié)果相似。此外，采用貝曼漏斗法調(diào)查土壤中根結(jié)線蟲(chóng)數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)土壤中J2數(shù)量在根結(jié)線蟲(chóng)侵染煙草根系后呈先減少后逐漸增加的趨勢(shì)，與范成平等（2020）的研究結(jié)果相似。對(duì)煙草根結(jié)線蟲(chóng)大田初侵染期、根內(nèi)生活史周期以及土壤中J2數(shù)量變化的了解，對(duì)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)煙草根結(jié)線蟲(chóng)病的發(fā)生具有重要意義，并為制定長(zhǎng)期、有針對(duì)性的防治策略提供了科學(xué)依據(jù)。根據(jù)研究結(jié)果，可從煙草栽后第5 d起采取針對(duì)性措施對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行防控，減少土壤中J2數(shù)量，以達(dá)到防控根結(jié)線蟲(chóng)病的目的。

貴州煙區(qū)存在花生根結(jié)線蟲(chóng)、南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)及花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)混合種群侵害，與何成興等（2016）對(duì)西南地區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)種類調(diào)查結(jié)果一致。本研究中畢節(jié)市主要是花生根結(jié)線蟲(chóng)單一侵染和花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)復(fù)合侵染，與李彩斌等（2021）報(bào)道畢節(jié)煙區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)種類為南方根結(jié)線蟲(chóng)，其次為花生根結(jié)線蟲(chóng)的結(jié)果存在一定差異，可能是取樣范圍不同及長(zhǎng)期種植抗南方根結(jié)線蟲(chóng)煙草品種導(dǎo)致南方根結(jié)線蟲(chóng)比例下降。當(dāng)前花生根結(jié)線蟲(chóng)為貴州煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群，并且多種群混合侵染現(xiàn)象日趨嚴(yán)重?？緹熎贩NK326對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)1號(hào)和3號(hào)小種具有抗性；Speight G-28對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)1號(hào)、3號(hào)生理小種和花生根結(jié)線蟲(chóng)1號(hào)生理小種具有抗性（喻盛甫等，1999；Ng’Ambi et al.，1999），但目前在貴州烤煙生產(chǎn)中均未種植，因此，迫切需要對(duì)抗花生根結(jié)線蟲(chóng)的煙草品種進(jìn)行選育。此外，可借助現(xiàn)代育種技術(shù)、基因編輯等手段，培育出同時(shí)抗多種根結(jié)線蟲(chóng)侵染的煙草新品種，從而為煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供有力支持。受氣候變化、土壤生態(tài)和種植結(jié)構(gòu)調(diào)整等多重因素影響，煙草根結(jié)線蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)種群會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化（崔江寬等，2021）。2013—2017年間，徐興陽(yáng)等（2013，2017）在云南省的研究發(fā)現(xiàn)，花生根結(jié)線蟲(chóng)替代南方根結(jié)線蟲(chóng)成為該區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群。前人研究報(bào)道貴州省煙草根結(jié)線蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)種群為南方根結(jié)線蟲(chóng)（莫熙禮等，2016；李彩斌等，2021），本研究結(jié)果表明，貴州省當(dāng)前煙草根結(jié)線蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)種群為花生根結(jié)線蟲(chóng)，說(shuō)明根結(jié)線蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)種群發(fā)生了變化，由南方根結(jié)線蟲(chóng)轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉY(jié)線蟲(chóng)。這種種群動(dòng)態(tài)波動(dòng)可能是導(dǎo)致原有的根結(jié)線蟲(chóng)防治策略失效的原因，因此，及時(shí)更新根結(jié)線蟲(chóng)種類分布數(shù)據(jù)和持續(xù)監(jiān)測(cè)其種群動(dòng)態(tài)對(duì)于制定更為精準(zhǔn)和有效的防治策略具有至關(guān)重要的作用。

土傳性病害如黑脛病、根黑腐病和青枯病等常與根結(jié)線蟲(chóng)病混合發(fā)生，根結(jié)線蟲(chóng)造成的傷口為其他病原菌提供入侵機(jī)會(huì)，導(dǎo)致多種根莖類病害共同發(fā)生，加劇了煙株病害的復(fù)雜性和嚴(yán)重程度（Donget al.，2014；許大鳳等，2018；白茂軍等，2023；焦芹等，2024；王興松等，2024）。林代福等（1998）研究表明，同時(shí)接種黑脛病菌和根結(jié)線蟲(chóng)較單接種黑脛病菌，煙株黑脛病發(fā)病加重，說(shuō)明根結(jié)線蟲(chóng)的存在會(huì)加重黑脛病的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，煙草黑脛病、根黑腐病和青枯病常與煙草根結(jié)線蟲(chóng)病和混合發(fā)生，因此，早期防治根結(jié)線蟲(chóng)病有利于減少煙草根莖類病害的發(fā)生。

4結(jié)論

當(dāng)前危害貴州煙區(qū)的根結(jié)線蟲(chóng)種類有南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，以花生根結(jié)線蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種群；安順市、貴陽(yáng)市、畢節(jié)市、六盤(pán)水市和黔西南州煙草根結(jié)線蟲(chóng)主要種群為花生根結(jié)線蟲(chóng)，黔東南州、黔南州和銅仁市煙草根結(jié)線蟲(chóng)主要種群為南方根結(jié)線蟲(chóng)，遵義市主要煙草根結(jié)線蟲(chóng)種群為花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)混合種群；根結(jié)線蟲(chóng)初侵染期為栽后5～10 d，生活史周期約35 d，根圍土壤中根結(jié)線蟲(chóng)J2數(shù)量隨侵染時(shí)間的推移呈先減少后逐漸增加的變化趨勢(shì)；根結(jié)線蟲(chóng)不同種群混合侵染，與青枯病、黑脛病及根黑腐病混合發(fā)生情況普遍。

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（責(zé)任編輯麻小燕）