摘要：【目的】對旱柳（Salix matsudana）NAC基因家族成員進行鑒定，并分析其在淹水脅迫和鹽脅迫下的表達差異，為研究SmNAC家族成員參與逆境脅迫調(diào)控機制及培育高耐非生物脅迫旱柳品種提供理論基礎。【方法】以敏淹旱柳品種Yanliu No.1、耐淹旱柳品種Suliu 795和敏鹽旱柳種質(zhì)Yanjiang和耐鹽旱柳品種9901等4份旱柳種質(zhì)為試驗材料，通過基因組數(shù)據(jù)挖掘鑒定出旱柳全基因組范圍內(nèi)的NAC基因家族成員，并對其蛋白理化性質(zhì)、保守基序、系統(tǒng)發(fā)育關系、基因結構及其染色體位置、共線性關系進行預測分析。對SmNAC基因家族成員進行淹水脅迫和鹽脅迫下的表達譜分析；選取對淹水脅迫和鹽脅迫均具有明顯響應的基因構建擬南芥過表達載體并獲取轉基因擬南芥，通過實時熒光定量PCR檢測該基因在野生型和轉基因擬南芥中的相對表達量，并分析轉基因擬南芥和野生型擬南芥在淹水脅迫下的表型差異，測定其生理指標。【結果】鑒定出290個SmNAC基因家族成員，命名為SmNAC001～SmNAC290；SmNAC家族基因編碼的氨基酸數(shù)量范圍為105～710個，分子量為12.7～77.8 kD，理論等電點（pI）為4.33～9.65，大多數(shù)蛋白成員定位于細胞核。根據(jù)SmNAC家族蛋白與擬南芥NAC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化關系及其保守基序分析結果，將SmNAC家族蛋白分為16個亞家族。大部分SmNAC家族基因中含有3個外顯子，同一亞家族內(nèi)的SmNAC成員基序組成和排列模式相似，如NAP和OsNAC7亞家族。大部分SmNAC家族基因成員啟動子含有茉莉酸甲酯以及缺氧脅迫等響應元件。SmNAC基因家族中有244個基因隨機分布在38條染色體上，其中存在13對串聯(lián)復制事件。轉錄組數(shù)據(jù)結果顯示，淹水脅迫和鹽脅迫后，ATAF亞家族（SmNAC007、SmNAC008、SmNAC009、SmNAC010、SmNAC011和SmNAC012基因）表達量在不同抗性旱柳種質(zhì)中均明顯上調(diào)。實時熒光定量PCR結果顯示，轉基因擬南芥中SmNAC007基因的相對表達量明顯高于野生型，為10～15倍；與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥中總蛋白含量顯著降低（Plt;0.05）?！窘Y論】鑒定出290個SmNAC基因家族成員，其中分別有102個和151個家族成員在淹水脅迫和鹽脅迫中差異表達；初步證實SmNAC007基因在淹水脅迫響應中發(fā)揮正向調(diào)控功能。

關鍵詞：旱柳；NAC基因家族；鹽脅迫；淹水脅迫；SmNAC007基因

中圖分類號：S687.101文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）10-3056-15

Whole genomic identification of NAC gene family and expres?sion analysis under flooding stress and salt stress inSalixmatsudana

QIAN Chao-nan，XU Sun-ran，LI Meng-ru，DENG Ming-chao，SUN Shuo，LIU Guo-yuan，LIAN Bo-lin，ZHANG Jian*，CHEN Yan-hong*

（School of Life Sciences，Nantong University/Nantong Key Laboratory of Ornamental Plant Genetics and Breeding，Nantong，Jiangsu 226019，China）

Abstract：【Objective】The purpose of the study was to identify members of the NAC gene family in Salix matsudanaand analyze their expression differences under flooding stress and salt stress，so as to provide theoretical basis for stu-dying the mechanism of SmNAC family members involved in stress regulation and cultivating S.matsudana varieties with high tolerance to abiotic stress.【Method】Using the 4 S.matsudanagermplasms（flooding-sensitive S.matsudana variety Yanliu No.1，the flooding-tolerant S.matsudana variety Suliu 795，the salt-sensitive S.matsudanagermplasmYanjiang，and the salt-tolerant S.matsudana variety 9901）as experimental materials，the NAC gene family members within the whole genome of S.matsudana were identified through genomic data mining，and their protein physicochemical proper-ties，conserved motifs，phylogenetic relationships，gene structures，chromosome localization and collinearity relationships were predicted and analyzed.Expression profiles of SmNAC gene family members under flooding stress and salt stress was conducted；genes that showed obvious response to both flooding stress and salt stress were selected to construct Ara-bidopsis thaliana overexpression vectors and obtain transgenic A.thaliana.The relative expression levels of these genes in wild-type and transgenic A.thaliana were detected by real-time fluorescence quantitative PCR，and the phenotypic diffe-rences between transgenic A.thaliana and wild-typeA.thaliana underwater flooding stress were analyzed，and the physio-logical indicators were measured.【Result】A total of 290 SmNAC gene family members were identified，named SmNAC001 to SmNAC290；the number of amino acids encoded by SmNAC family genes ranged from 105 to 710，with molecular weights ranging from 12.7 to 77.8 kD and theoretical isoelectric points（pI）ranging from 4.33 to 9.65.Most of the protein members were localized in the nucleus.Based on the phylogenetic evolutionary relationship between SmNAC family proteins and A.thaliana NAC proteins and the results of conserved motifs，the SmNAC family proteins were di-vided into 16 subfamilies.MostSmNAC family genes contained 3 exons，and SmNAC members within the same subfami-ly had similar motif composition and arrangement patterns，such as the NAP and OsNAC7 subfamilies.MostSmNAC family gene members promoters contained elements responsive to methyl jasmonate and hypoxia stress.In the SmNAC gene family，244 genes were randomly distributed on 38 chromosomes，among which there were 13 pairs of tandem du-plication events.Transcriptome data showed that after flooding stress and salt stress，the expression levels of the ATAF subfamily（SmNAC007，SmNAC008，SmNAC009，SmNAC010，SmNAC011，and SmNAC012 genes）was up-regulated in the S.matsudanagenplasms with different resistance.Real-time fluorescence quantitative PCR results showed that the relative expression level of the SmNAC007 gene in transgenic A.thaliana was greatly higher than that in the wild-type by 10 to 15 times；compared to wild-type A.thaliana，the total protein content in transgenic A.thaliana was significantly re-duced（Plt;0.05）.【Conclusion】A total of 290 SmNAC gene family members are identified，among which 102 and 151 family members are differentially expressed under flooding stress and salt stress respectively；the SmNAC007 gene is pre-liminarily confirmed to play a positive regulatory role in the response to flooding stress.

Key words：Salixmatsudana；NAC gene family；salt stress；flooding stress；SmNAC007 gene

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31971681）；Jiangsu Key Research and Develop-ment plan Project（BE2022420）；Nantong Social Welfare Project（MS12022028）；Jiangsu College Student Innovation and Entrepreneurship Training Plan Project（202410304108Y）

0引言

【研究意義】旱柳（Salix matsudana）是隸屬于楊柳科（Salicaceae）柳屬（Salix）柳組（Sect.Salix）的喬木，樹姿美觀，具有耐水濕、耐鹽堿與耐污染等優(yōu)點，是我國重要的用材樹種，也是固沙保土和綠化的優(yōu)良樹種。在植物生長發(fā)育及對逆境脅迫的響應過程中，轉錄因子（Transcriptional factors，TFs）發(fā)揮關鍵作用。NAC轉錄因子家族是植物特有的一種TF類型，從苔蘚植物到雙子葉植物均有分布，是最大的植物特異性轉錄家族之一（Olsen et al.，2005）。據(jù)此推測旱柳NAC（SmNAC）基因家族成員在脅迫調(diào)控中發(fā)揮重要作用，因此，了解SmNAC基因家族的成員組成、分類、結構特征、表達模式和功能對于揭示其參與逆境脅迫調(diào)控的機制及培育高耐非生物脅迫旱柳品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】TFs通過與下游基因的順式調(diào)控元件結合激活或抑制靶基因的表達調(diào)控不同的信號通路，從而影響植物的生理和生化過程。NAC的命名來源于其結構域中3個基因的名稱，即無頂端分生組織（No apical meristem，NAM）基因、擬南芥轉錄激活因子1/2（Arabidopsistranscription activator factor 1/2，ATAF1/2）基因和杯狀子葉2（Cup shaped cotyledon2，CUC2）基因（Souer et al.，1996）。NAC轉錄因子家族最顯著的結構性特點是存在1個高度保守的NAM域，由150～160個氨基酸組成，可以結合DNA和其他蛋白質(zhì)，其C端是1個可變的轉錄激活區(qū)域，可以激活或抑制基因轉錄（Nakashima et al.，2007）。NAC轉錄因子在植物生長發(fā)育包括側根構建、細胞分裂、葉片衰老、果實成熟和種子萌發(fā)等方面起著關鍵作用（Puranik et al.，2012；王曉菲等，2024），其家族成員在低溫（An et al.，2018）、干旱（Thirumalaikumar et al.，2018；Yang et al.，2022；紀藝紅等，2024）、鹽堿（Li et al.，2021a，2021b）、高溫（Xi et al.，2022）特別是淹水（Bui etal.，2020）等非生物脅迫響應及調(diào)控過程中扮演重要角色。如蘋果中的MdNAC029在CBF依賴的方式下作為負調(diào)控因子調(diào)節(jié)植物的耐寒性（Anet al.，2018）；NAC因子JUNGBRUNNEN1（JUB1）是番茄耐旱性的調(diào)節(jié)因子（Thirumalaikumar et al.，2018）；擬南芥幼體和成體耐淹性的差異與AtNAC017轉錄因子有關（Bui etal.，2020）；大豆中的GmNAC06（Li et al.，2021a）和獼猴桃中的AvNAC030（Li et al.，2021b）在耐鹽性調(diào)控機制中發(fā)揮積極作用；玉米中的ZmNAC074在耐熱性中發(fā)揮關鍵作用（Xi et al.，2022）。GmNAC12基因作為關鍵基因可正向調(diào)控大豆對干旱脅迫的耐受性（Yang et al.，2022）。此外，諸多報道也表明一些NAC家族成員可參與多重脅迫的調(diào)控；如一種新的NAC轉錄因子VvNAC17在干旱、高溫、冷凍、水楊酸和脫落酸處理后的葡萄多種組織中均有表達，可增加葡萄對脫落酸的敏感性，提高其耐鹽性、抗凍性和抗旱性（Ju etal.，2020）；乙烯誘導的PtNACs在油松中對鹽、冷、旱、熱沖擊和滲透等多重非生物脅迫均有應答作用（Han et al.，2023）?！颈狙芯壳腥朦c】盡管在擬南芥和其他模式植物中對NAC基因家族的研究已取得顯著進展，但有關SmNAC基因家族成員及其轉錄因子家族功能研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】以敏淹旱柳品種Yanliu No.1、耐淹旱柳品種Suliu 795和敏鹽旱柳種質(zhì)Yanjiang、耐鹽旱柳品種9901等4份旱柳種質(zhì)為試驗材料，通過基因組數(shù)據(jù)挖掘鑒定出旱柳全基因組范圍內(nèi)的NAC基因家族成員，并對其理化性質(zhì)、保守基序、系統(tǒng)發(fā)育關系、基因結構、染色體位置、共線性關系進行預測分析。對SmNAC基因家族成員進行淹水脅迫和鹽脅迫下的表達譜分析，構建擬南芥過表達載體并獲取轉基因擬南芥。通過實時熒光定量PCR檢測該基因在野生型和過表達擬南芥中的相對表達量，為研究SmNAC家族成員參與逆境脅迫調(diào)控的機制及培育高耐非生物脅迫旱柳品種提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

以種植于南通大學植物園的敏淹旱柳品種Yan-liu No.1和耐淹旱柳品種Suliu 795作為淹水脅迫試驗的研究對象；敏鹽旱柳種質(zhì)Yanjiang和耐鹽旱柳品種9901作為鹽脅迫試驗的研究對象。將4份種質(zhì)的莖剪成長8～10 cm、粗2～3 mm的插條。淹水脅迫試驗種質(zhì)插條經(jīng)水培長出新根備用；鹽脅迫試驗種質(zhì)插條在基質(zhì)（無菌泥炭∶珍珠巖=2∶1）中培養(yǎng)18d長出新根，培養(yǎng)條件為25℃、16 h光照/8 h黑暗。

1.2 SmNAC基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

旱柳基因組來自本試驗測序數(shù)據(jù)。從Phytozome網(wǎng)站（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）分別下載毛果楊（Populus trichocarpa）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）和紅皮柳（Salix purpurea）的全基因組和注釋文件。從Pfam數(shù)據(jù)庫（https：//pfam.xfam.org/）下載NAM蛋白保守結構域的HMM文件（PF02365），將其作為搜索模型。代入TBtools的HMM search功能篩選模塊，篩選出目標物種中相似結構域的蛋白序列。將獲得的旱柳、毛果楊、擬南芥及紅皮柳NAC轉錄因子家族候選基因，采用SMART（https：//smart.embl.de/#）和CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）網(wǎng)站進一步確定候選蛋白中存在NAM結構域。將SmNAC基因家族的蛋白序列提交至ExPASy的ProtParam（https：//www.expasy.org/），對SmNAC轉錄因子家族成員理化性質(zhì)預測分析；使用WolfSport（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線分析工具預測SmNAC家族蛋白的亞細胞定位。

1.3系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建

利用MAGA 7.0中ClustaW對SmNAC家族蛋白進行氨基酸序列多重序列比對，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，利用Chiplot網(wǎng)站對系統(tǒng)發(fā)育進化樹進行美化（https：//www.chiplot.online/），Bootstrap設為1000次。利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html）對SmNAC蛋白中的保守基序進行鑒定，并使用TBtools對基于柳樹SmNAC家族基因結構及蛋白保守基序和結構域進行可視化。

1.4 SmNAC家族基因的染色體定位及基因復制事件分析

使用TBtools中AmazingGeneLocationfromGFF3/GTF File工具，將SmNAC家族基因定位到旱柳38條染色體。由于一部分支架（Scaffolds）尚未組裝到染色體上，因此并非所有的SmNAC家族基因均能定位到染色體。

基因組中有2種基因復制：串聯(lián)復制事件（TDs）和片段復制事件（SDs）。在TBtools中，基因復制對通過Blast compare 2 Seq［sets］lt;Big Filegt;和Quick McscanX Wrapper工具鑒定。候選復制基因應具有至少80%的覆蓋度和至少65%的相似性。SmNACs基因的TDs通過TBtools中的Amazing Gene Loca-tion from GFF3/GTF File工具展示在染色體上。而SmNAC家族基因的SDs則通過TBtools的Amazing Super Circos工具進行可視化。

1.5 SmNAC基因家族共線性分析

通過下載毛果楊、紅皮柳和擬南芥的基因組序列和注釋信息，使用TBtools進行基因組比對和共線性區(qū)塊識別，并通過TBtools中Amazing Super Circos工具進行可視化。

1.6 4份旱柳種質(zhì)的非生物脅迫處理

1.6.1淹水脅迫將Yanliu No.1和Suliu 795這2個旱柳品種的莖插條完全浸入水中，并在淹水脅迫0、4、12、24和48h后采集根作為樣品。共有10組樣品，每組樣品3個生物學重復。將Yanliu No.1淹水脅迫處理0、4、12、24和48 h的樣品分別標記為WSYL-CK、WSYL-4h、WSYL-12h、WSYL-24h和WSYL-48h；Suliu 795淹水脅迫處理0、4、12、24和48 h的樣品分別標記為WR-CK、WR-4h、WR-12h、WR-24h和WR-48h。提取樣品RNA并進行轉錄組測序，轉錄組數(shù)據(jù)上傳在中國國家基因庫數(shù)據(jù)庫（CNGBdb，登錄號CNP0002062），根據(jù)淹水脅迫下SmNAC家族基因的表達量繪制表達熱圖。

1.6.2鹽脅迫將敏鹽旱柳品種Yanjiang和耐鹽旱柳品種9901已長出新根的莖插條分別在濃度為200 mmol/L的NaCl溶液中處理0、4、8和12 h。采集根作為樣品，每樣品3個生物學重復，共有8組樣品，Yanjiang鹽脅迫處理0、4、8和12 h樣品分別標記為S-CK、S-N4h、S-N8h和S-N12h。9901鹽處理0、4、8和12 h的樣品分別標記為T-CK、T-N4h、T-N8h和T-N12h，提取樣品RNA并進行轉錄組測序，轉錄組數(shù)據(jù)上傳在中國國家基因庫數(shù)據(jù)庫（CNGBdb，登錄號CNP0003817），根據(jù)鹽脅迫下SmNAC家族基因的表達量繪制表達熱圖。

1.7擬南芥的過表達載體構建

在淹水脅迫和鹽脅迫處理中，選取對于淹水脅迫和鹽脅迫均具有明顯響應的基因構建擬南芥的過表達載體，對其進一步進行相關功能分析。根據(jù)SmNAC基因序列設計引物（表1），以旱柳RNA反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR檢測，將PCR產(chǎn)物切膠回收，回收產(chǎn)物采用pMDTM 18-TVector Cloning Kit試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］進行測序。測序成功后，使用Xho I對pWM101環(huán)狀質(zhì)粒進行單酶切。設計基因接頭引物（表1），以pMDTM 18-T融合質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，然后使用非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將酶切后的pWM101載體和PCR產(chǎn)物進行連接，連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌DH5“感受態(tài)細胞（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）中，獲得含pWM101-SmNAC重組菌株；挑選陽性重組菌株，擴大培養(yǎng)提取pWM101-SmNAC重組質(zhì)粒，轉化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞［寶生物工程（大連）有限公司］。

花序侵染法轉化擬南芥：取陽性農(nóng)桿菌參照菌液活化方法，培養(yǎng)至OD600 nm為1.2～1.6，隨后在4800 r/min下離心10min，沉淀菌體。將菌體重懸于滲透緩沖液（1/2 MS液體培養(yǎng)基和5%蔗糖溶解充分后，121℃滅菌20 min，每100 mL緩沖液加入20～25μL表面活性劑SilwettL-77），使OD600 nm為0.6～0.8。在轉化前1 d將擬南芥澆足水，用剪刀去除已經(jīng)結莢的角果。轉化時將每株擬南芥花序蘸入轉化介質(zhì)中約50 s，轉化完后將擬南芥平放于托盤中，灑水保濕，暗培養(yǎng)24h，第2 d拿出后放到培養(yǎng)室正常培養(yǎng)。一周后再進行1次轉化以獲得更多轉基因種子。收獲成熟種子后，標記為T0代種子，并進行篩選點種培養(yǎng)，篩選到T3代植株進行試驗。

1.8基因表達模式分析

對生長相同周期的野生型擬南芥和NAC轉基因擬南芥為模板進行實時熒光定量PCR檢測。采用RNA試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司）］提取總RNA，使用RNA反轉錄試劑盒（TaKaRa）將RNA反轉錄合成cDNA。通過Oligo 7避開序列保守區(qū)域設計NAC引物（表1），引物委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。反應體系20.0μL：cDNA模板1.0μL，SYBR Mix 10.0μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，無菌水補足至20.0μL。擴增程序：95℃預變性1 min；95℃10 s，60℃5 s，72℃12 s，進行40個循環(huán)。每個樣品設3個生物學重復，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.9擬南芥野生型和轉基因植株缺氧脅迫指標測定

在生長5 d后，擬南芥野生型和轉基因植株模擬淹水脅迫設置缺氧脅迫試驗，參照Mathew等（2023）的方法進行并稍作修改，在體積為2.5 L的矩形盒子底部放置1個AnaeroGenTM 2.5 L GasPakTM厭氧包（Thermo Fisher Scientific，OXAN0025A）。在厭氧包上方放置8個裝有擬南芥的培養(yǎng)皿，厭氧包和培養(yǎng)皿間使用多層紙巾隔開，以防止厭氧包產(chǎn)生的熱量影響植物生長。在盒子的密封區(qū)域涂抹凡士林確保其密封性。盒子關閉緊密并用鋁箔包裹后放置在黑暗處進行缺氧脅迫處理，野生型擬南芥（標記為WT）和3個擬南芥轉基因株系（標記為NAC-D-4、NAC-D-6和NAC-D-8）各設3個生物學重復。處理12 h后，將培養(yǎng)皿取出進行正常培養(yǎng)。5 d后，測定WT、NAC-D-4、NAC-D-6和NAC-D-8株系的根長和鮮重；測定WT、NAC-D-4和NAC-D-6株系葉片中總蛋白含量和過氧化物酶（POD）活性，參照總蛋白和POD試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明進行測定。

1.10統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 9.5.0作圖，并采用t檢驗進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1 SmNAC家族基因成員鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析結果

利用HMM文件對旱柳全基因組中可編碼NAM結構域的基因進行搜索，篩選后共獲得290個NAC家族基因，并根據(jù)其在染色體上的位置命名為SmNAC001～SmNAC290。

由圖1可知，SmNAC家族基因編碼的氨基酸殘基數(shù)量為105～710個；蛋白分子量為12.7～77.8 kD；理論等電點（pI）為4.33（SmNAC138）～9.65（SmNAC074），其中有69個SmNAC家族蛋白成員為堿性蛋白（pIgt;7.00），其他成員為酸性蛋白（pIlt;7.00）。此外，大部分成員氨基酸數(shù)量為300～399個，pI為5.00～5.99，分子量為30～39 kD。亞細胞定位結果顯示，大多數(shù)SmNAC家族蛋白成員定位于細胞核。

2.2 SmNAC家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析結果

通過MEGA 7.0中的NJ和氨基酸序列多重比對構建旱柳和擬南芥的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果由圖2可知，SmNAC家族蛋白與擬南芥NAC蛋白一樣具有多樣性，且在各亞家族中分布不均勻。277個SmNAC蛋白和112個擬南芥NAC蛋白分為15個亞家族，包括12個ANAC001蛋白、21個ANAC063蛋白、32個NAM蛋白、9個NAC1蛋白、32個OsNAC7蛋白、8個SENU5蛋白、17個NAP蛋白、5個AtNAC3蛋白、6個ATAF蛋白、34個ONAC003蛋白、38個ONAC022蛋白、12個ANAC011蛋白、9個NAC2蛋白、10個OsNAC8蛋白和10個TIP蛋白。其中ANAC019、ANAC055和ANAC072與SmNAC202、SmNAC203、SmNAC204和SmNAC205聚類，且同屬于AtNAC3亞家族。此外，SmNAC蛋白還存在1個不典型的亞家族，該亞家族與擬南芥NAC蛋白無相似性，僅包括來自旱柳的13個NAC蛋白成員。2.3 SmNAC家族成員基因結構、蛋白保守基序及結構域分析結果

所有SmNAC蛋白均有1個NAC基因家族特有保守結構域NAM，證明基因鑒定結果可靠。為了解基因的結構特征，將SmNAC家族基因的編碼區(qū)（CDS）、非編碼區(qū)（UTR）進行可視化處理，由結果（圖3）可知，除ANAC063亞家族的部分基因（SmNAC282、SmNAC283、SmNAC281、SmNAC280、SmNAC088、SmNAC087、SmNAC260、SmNAC261和SmNAC278）無內(nèi)含子外，其他基因均包含1個以上的內(nèi)含子，但大多數(shù)基因的外顯子數(shù)量為3個，僅有5個基因（SmNAC083、SmNAC186、SmNAC037、SmNAC035和SmNAC060）外顯子數(shù)量大于8個。同一亞群基因大多具有相似的外顯子和內(nèi)含子結構，如所有的SENU5亞家族中均含有3個外顯子，ATAF和AtNAC3亞家族中僅有1個基因不含3個外顯子。

為揭示SmNAC家族蛋白結構多樣性，利用MEME共鑒定得到10個基序，且基序長度不同（圖3）。在290個SmNAC蛋白中，至少有1～8個保守基序，其中Motif 7和Motif 10僅出現(xiàn)在ONAC003中。Motif 3、Motif 5、Motif 1、Motif 2、Motif 4和Motif 9組成保守結構域NAM，并非所有蛋白均含有這些基序，有些蛋白包含不完整的NAM結構域，僅含有1～2個基序，如SmNAC087和SmNAC277僅有1個基序。SmNAC086、SmNAC044、SmNAC192和SmNAC191含有基序種類最多，包含8個保守基序。同一亞家族內(nèi)的SmNAC成員基序組成和排列模式相似，如NAP和OsNAC7亞家族。

2.4 SmNAC家族基因啟動子順式作用元件分析結果

為分析SmNAC家族基因潛在的生物學功能，對290個SmNAC家族基因成員啟動子序列進行順式作用元件預測，并篩選植物激素響應和非生物脅迫響應元件，結果（圖4）表明，大部分SmNAC家族基因成員啟動子含有茉莉酸甲酯（MeJA）以及缺氧脅迫等響應元件。290個家族成員中，在激素反應方面，主要包括生長素（Auxin）、赤霉素（ABA）、MeJA和水楊酸（SA）響應元件，其中MeJA響應元件最多（778個）。而非生物脅迫中，主要有厭氧誘導響應元件（545個）、缺氧誘導響應元件（172個）、參與干旱誘導反應的MYB結合位點（177個）和參與低溫響應的順式作用元件（145個）。推測SmNAC家族基因在參與植物激素和非生物脅迫響應中發(fā)揮重要作用。

2.5 SmNAC家族基因染色體定位及共線性分析結果

利用TBtools對旱柳基因組注釋信息對290個SmNAC家族基因進行染色體定位，結果（圖5）顯示，244個SmNAC家族基因隨機分布在38條染色體上。由圖5和圖6可知，9號染色體（Chr9）最多，為14個，占比5.86%，其次是5號、13號和28號染色體，均為13個基因，占比5.44%。6號染色體基因數(shù)量最少，僅有2個基因，占比0.84%。

基因復制事件是植物家族基因形成過程中常見且廣泛發(fā)生的事件，對理解物種適應性進化具有重要意義。對所有SmNAC家族基因進行共線性分析及復制事件研究，結果如圖5和圖7所示，在SmNAC家族基因中發(fā)現(xiàn)13對串聯(lián)復制事件，且在不同染色體之間存在多個片段重復，推測原因是旱柳為四倍體植物，隨著物種進化和植物基因組的復雜性，會發(fā)生NACs基因的復制，從而增加了物種中NAC家族成員的數(shù)量。

為進一步探討旱柳與模式植物擬南芥和楊柳科物種之間NAC家族基因的進化關系，分析了SmNAC基因家族與擬南芥、毛果楊和紅皮柳的共線性關系，結果（圖8）表明，旱柳與3種植物的親緣關系各不相同，與紅皮柳的共線性基因對最多，其次是毛果楊，與擬南芥的共線性基因對最少，表明旱柳與紅皮柳的親緣關系最近。基因組間和基因組內(nèi)共線性分析表明，直系同源基因對的片段重復或全基因組重復在NAC基因家族的進化過程中比例較大。

2.6 SmNAC家族基因在非生物脅迫下表達模式分析結果

2.6.1淹水脅迫為研究SmNAC家族基因在非生物脅迫中的作用，根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)，對SmNAC家族基因在淹水脅迫下的轉錄表達量進行分析。結果（圖9-A）表明，淹水脅迫處理后，共102個SmNAC家族基因的表達量有差異。其中，NAP亞家族基因（SmNAC159、SmNAC160、SmNAC161和SmNAC162）的表達量在敏淹旱柳品種Yanliu No.1和耐淹旱柳品種Suliu 795中均有較大幅度升高。淹水脅迫處理后，ATAF亞家族基因（SmNAC007、SmNAC008、SmNAC009、SmNAC010、SmNAC011和SmNAC012）表達量在2個旱柳品種中均明顯上調(diào)，其中在敏淹旱柳品種Yanliu No.1中上調(diào)幅度較大，2個品種均在淹水脅迫處理4 h時，ATAF亞家族基因的表達量達最大值；TIP亞家族基因（SmNAC184、SmNAC185和SmNAC186）表達量在敏淹旱柳品種Yanliu No.1中明顯上調(diào)，在耐淹旱柳品種Suliu 795中變化不明顯；OsNAC7亞家族基因表達量變化不明顯且均維持較低水平；ONAC003亞家族基因表達量明顯下降，且耐淹旱柳品種Suliu 795較敏淹旱柳品種Yanliu No.1下降更明顯。淹水脅迫4～48 h，2個柳樹品種的SmNAC237、SmNAC238、SmNAC239和SmNAC240基因表達量相對穩(wěn)定并維持較高水平。

2.6.2鹽脅迫對SmNAC家族基因在鹽脅迫處理下的轉錄表達量進行分析，結果（圖9-B）顯示，有151個基因表達量存在差異，其中ATAF亞家族基因（SmNAC007、SmNAC008、SmNAC009、SmNAC010、SmNAC011和SmNAC012）和AtNAC3亞家族基因（SmNAC202、SmNAC203、SmNAC204和SmNAC205）的表達量在敏鹽旱柳種質(zhì)Yanjiang和耐鹽旱柳品種9901中均明顯上調(diào)；而二者的NAC1亞家族基因表達量均有所下調(diào)；OsNAC7亞家族基因的表達量在敏鹽旱柳種質(zhì)Yanjiang和耐鹽旱柳品種9901中變化不明顯且表達量較低。

2.7 SmNAC007基因的克隆及表達載體構建

在淹水脅迫和鹽脅迫處理中，SmNAC007基因表達量對于2種脅迫處理均有明顯響應，因此選取該基因構建擬南芥的過表達載體，對其進行進一步相關功能分析。

以旱柳cDNA為模板經(jīng)PCR擴增獲得長度約為927 bp的片段（圖10-A），將PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后測序。測序成功后對pWM101環(huán)狀質(zhì)粒進行單酶切（圖10-B）。將PCR擴增得到的片段和與酶切后的pWM101載體連接，獲取pWM101-SmNAC007重組質(zhì)粒并轉到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，隨后使用花序侵染法成功獲得轉基因擬南芥株系。

2.8 SmNAC007基因表達模式及缺氧脅迫指標測定分析結果

以生長相同周期的野生型擬南芥和SmNAC007轉基因擬南芥為模板，進行實時熒光定量PCR檢測，結果（圖11-A）表明轉基因擬南芥NAC-D-4和NAC-D-6株系中SmNAC007基因的相對表達量明顯高于野生型擬南芥，為10～15倍。

對野生型擬南芥和轉基因擬南芥株系進行缺氧脅迫處理，結果（圖11-B）顯示，缺氧脅迫的環(huán)境下，轉基因擬南芥株系生長勢較野生型擬南芥株系好，表現(xiàn)為3個轉基因擬南芥株系NAC-D-4、NAC-D-6、NAC-D-8的根長和鮮重均極顯著高于WT（Plt;0.01，下同）（圖11-C和圖11-D），說明過表達SmNAC007基因可以促進擬南芥適應缺氧脅迫的環(huán)境。由圖11-E和圖11-F可知，與WT相比，NAC-D-4和NAC-D-8株系中總蛋白含量顯著降低（Plt;0.05，下同），POD活性分別顯著和極顯著升高。推測SmNAC007基因在缺氧脅迫響應中起著正調(diào)控功能，能通過促進POD基因的表達，使細胞免受氧化氫損害。

3討論

諸多研究已證明NAC基因家族廣泛參與調(diào)控植物對非生物脅迫的響應過程，是提高作物抗逆性的重要基因家族之一。截至目前，NAC基因家族成員的全基因組鑒定已經(jīng)在許多植物中完成（Ooka et al.，2003；Wang et al.，2013；Peng et al.，2015；Ahmad et al.，2018；Diao et al.，2018）。例如，在擬南芥中已鑒定出105個NAC基因家族成員，在水稻中鑒定出151個，在玉米中鑒定出148個（Ooka et al.，2003；Peng et al.，2015）。而對旱枊NAC基因家族在全基因組水平上的系統(tǒng)分析和深入研究鮮見報道。本研究在旱柳參考基因組中共鑒定到290個NAC基因家族成員，旱柳屬四倍體植物，其SmNAC基因家族成員數(shù)量與三倍體擬南芥NAC基因家族成員數(shù)目接近。本研究通過對SmNAC基因家族成員的全基因組鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進化分析，推測SmNAC基因家族的擴展與基因組復制有關，基因復制可能是響應環(huán)境壓力，如淹水脅迫所驅動的進化機制。SmNAC家族成員中存在1個不典型的亞家族，該亞家族僅包含13個SmNAC蛋白成員，與擬南芥NAC蛋白無相似性，其原因可能與旱柳和擬南芥在基因組、生理特征和生態(tài)環(huán)境等方面的差異有關，也可能與該亞家族中SmNAC蛋白獨有的功能特性或調(diào)控機制有關。此外，本研究對SmNAC進行基因結構和基序分析，發(fā)現(xiàn)同一亞家族內(nèi)的SmNAC成員基序組成和排列模式相似，如NAP和OsNAC7亞家族，推測同一亞家族SmNAC成員的功能相似。

基于不同物種直系同源物的結構特征，使用系統(tǒng)發(fā)育進化樹預測分析基因功能。在擬南芥中，NAC轉錄因子家族成員如ANAC019、ANAC055和ANAC072等3個基因的過表達可顯著提高植物抗旱性，3個基因通過與參與干旱脅迫反應的ERD1基因啟動子CATGTG核心區(qū)結合調(diào)控ERD1蛋白及其下游基因的表達（Tran et al.，2004）。本研究的系統(tǒng)發(fā)育進化樹結果顯示，ANAC019、ANAC055和ANAC072與SmNAC202、SmNAC203、SmNAC204和SmNAC205聚類，且同屬于AtNAC3亞家族，結合鹽脅迫下差異表達熱圖推測SmNAC202、SmNAC203、SmNAC204、SmNAC205基因的過表達可提高旱柳耐鹽性，以增強其在鹽脅迫環(huán)境下的適應能力。不同的是，SmNAC家族蛋白成員存在應對不同脅迫的功能分化，原因可能與基因的染色體定位和保守基序差異有關，也可能與NAC家族成員在不同物種進化的過程中發(fā)生功能分化有關，因此，有關不同SmNAC家族蛋白成員的功能特異性還需進一步探究。

SmNAC家族基因可能在響應旱柳淹水脅迫和鹽脅迫中發(fā)揮調(diào)控作用。在本研究中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過淹水脅迫處理后，大多數(shù)SmNAC的表達水平產(chǎn)生了變化。其中，在淹水處理4～48 h后，SmNAC159、SmNAC160、SmNAC161、SmNAC162、SmNAC007、SmNAC008、SmNAC009、SmNAC010、SmNAC011和SmNAC012基因的表達量在2個旱柳品種中均上調(diào)，表明這些基因可能是旱柳響應淹水脅迫的重要候選基因。同時鹽脅迫處理下，發(fā)現(xiàn)SmNAC007、SmNAC008、SmNAC009、SmNAC010、SmNAC011、SmNAC012、SmNAC202、SmNAC203、SmNAC204和SmNAC205基因表達量在敏鹽和耐鹽植株中均明顯上調(diào)，表明這些基因可能是響應旱柳鹽脅迫的重要候選基因。研究表明，某些NAC轉錄因子可參與植物對兩種或多種非生物脅迫的響應，例如SNAC1基因過表達可通過改善根系發(fā)育增強田間試驗中水稻的耐旱性和耐鹽性（Liu et al.，2014），StNAC053基因的過表達可提高馬鈴薯耐鹽性和耐旱性（Wang et al.，2021），本研究中也發(fā)現(xiàn)SmNAC007基因對于淹水和鹽處理的表達均具有明顯響應。

正常條件下，植物體內(nèi)的活性氧產(chǎn)生與清除系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)。環(huán)境脅迫會使植物細胞中積累大量活性氧，從而嚴重損傷細胞蛋白質(zhì)、膜脂、DNA及其他細胞組分，植物可通過產(chǎn)生超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等酶促脫毒系統(tǒng)清除體內(nèi)活性氧緩解細胞受損（杜秀敏等，2001）。如明網(wǎng)紋甜瓜可通過提高自身抗氧化酶活性適應低氧脅迫緩解膜脂過氧化程度（劉義玲等，2010）；玉米ZmWRKY101基因通過調(diào)控抗氧化系統(tǒng)參與對鹽脅迫的信號轉導（郭玉敏等，2020）。本研究對SmNAC007基因功能進行分析，結果表明該基因在淹水脅迫下的發(fā)揮正調(diào)控作用，因此推測SmNAC007基因通過調(diào)控下游基因表達，特別是涉及酶促脫毒系統(tǒng)和細胞保護機制的基因，增加體內(nèi)抗氧蛋白減緩細胞在脅迫條件下的損傷。

旱柳作為一種常見的樹種，其強大的生命力使其在綠化和生態(tài)修復中發(fā)揮著重要作用。旱柳不僅具有出色的適應性和生長速度，還能在各種環(huán)境條件下展現(xiàn)出強大的抗逆性。旱柳在生長發(fā)育過程中經(jīng)常受到各種非生物脅迫，如土壤污染（汪慶兵等，2014）、寒冷、干旱和鹽脅迫（李子英等，2017），特別是金屬鎘脅迫（曹繼敏等，2020）等，造成產(chǎn)量和質(zhì)量損失。因此，挖掘旱柳抗逆性基因并制定分子育種策略對旱柳遺傳改良具有重要意義。NAC基因家族作為植物中重要的基因家族之一，在植物生長和對不同非生物脅迫的反應中發(fā)揮重要作用。本研究對SmNAC基因家族相關研究結果，可為下一步研究證實SmNAC基因家族成員對各種脅迫的響應機制和調(diào)控功能提供參考依據(jù)。

4結論

鑒定出290個SmNAC基因家族成員，其中分別有102個和151個在淹水脅迫和鹽脅迫中差異表達，差異表達大部分成員屬于ATAF亞家族。通過對ATAF亞家族成員SmNAC007基因進行基因克隆、表達載體構建和轉基因擬南芥，證實SmNAC007基因在淹水脅迫響應中起正向調(diào)控功能。

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（責任編輯李洪艷）