【摘 要】目的：探討過表達(dá)SIRT4對人骨肉瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及對成骨分化的調(diào)控作用，以及過表達(dá)SIRT4對線粒體能量代謝的影響。方法：構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)SIRT4 的U2OS、MG63 骨肉瘤細(xì)胞株，通過qRT-PCR 和Western blot 檢測SIRT4 的mRNA和蛋白表達(dá)水平；CCK-8、克隆形成實驗、EDU555染色法及檢測細(xì)胞增殖；裸鼠脛骨成瘤實驗檢驗成瘤能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；DAPI染色及Annexin V-APC/7-AAD雙染法檢測細(xì)胞凋亡；細(xì)胞劃痕實驗、Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色和茜素紅S染色分別檢測細(xì)胞的早期和晚期成骨分化；葡萄糖檢測試劑盒測定培養(yǎng)基及細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量；乳酸檢測試劑盒測定培養(yǎng)基及細(xì)胞內(nèi)乳酸含量；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測試劑盒檢測細(xì)胞總ATP含量；四甲基羅丹明酯染色（tetramethylrhodamine ethylester perchlorate，TMRE）測定試劑檢測線粒體膜電位。結(jié)果：過表達(dá)SIRT4組細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力降低，裸鼠脛骨成瘤的瘤體體積減小，凋亡細(xì)胞增多；過表達(dá)SIRT4組細(xì)胞的G0/G1期占比明顯增多，S期占比明顯減少；過表達(dá)SIRT4組細(xì)胞ALP染色、茜素紅S染色鈣鹽結(jié)節(jié)明顯增多；過表達(dá)SIRT4組培養(yǎng)基中的葡萄糖較對照組消耗減少，細(xì)胞中的葡萄糖含量較對照組減少；過表達(dá)SIRT4組細(xì)胞中的乳酸含量較對照組減少，培養(yǎng)基中的乳酸較對照組產(chǎn)生減少；過表達(dá)SIRT4組細(xì)胞的總ATP較對照組更低；過表達(dá)SIRT4組的線粒體膜電位較對照組更低。結(jié)論：在U2O和MG63細(xì)胞中，過表達(dá)SIRT4抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及成瘤能力，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡以及早晚期成骨分化，調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞能量代謝。

【關(guān)鍵詞】骨肉瘤；SIRT4；惡性生物學(xué)行為；成骨分化；能量代謝

【中圖分類號】R114 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-11-02

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，常發(fā)生在青少年中，新輔助化療的應(yīng)用使骨肉瘤患者的生存率有了一定的提升，低級別骨肉瘤患者的5年生存率約為90%[1]，而骨肉瘤轉(zhuǎn)移性患者的5年總體生存率為35.5%[2]。目前骨肉瘤的病因尚未完全闡明，通過研究骨肉瘤的潛在發(fā)病機制，可能為臨床治療提供新的治療策略。

有研究指出能量代謝在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起到不可或缺的作用[3]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)過表達(dá)糖異生關(guān)鍵酶基因（fructose-1，6-bisphosphatase 1，F(xiàn)BP1）和敲低3-磷酸甘油酸脫氫酶（3-phosphoglycerindehydrogenase，PHGDH）可以改變骨肉瘤糖代謝微環(huán)境，促進(jìn)成骨分化，逆轉(zhuǎn)惡性生物學(xué)行為。sirtuin 4（SIRT4）主要位于線粒體中，一些證據(jù)表明SIRT4是能量代謝和腫瘤發(fā)生之間的“橋梁蛋白”[4]，SIRT4除了具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶、NAD+依賴性脫乙酰酶活性，還可以通過ADP-核糖基化、脫甲?；⒚撘阴；{(diào)節(jié)底物蛋白的功能[5-6]，這些酶的活性也使SIRT4能夠參與能量代謝過程，如促進(jìn)胰島素的分泌、協(xié)同糖酵解抑制劑參與糖酵解過程[7]、抑制谷氨酸脫氫酶調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝[8]、參與DNA損傷反應(yīng)[9]等，SIRT4已被證實在多種腫瘤中異常表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡和能量代謝中發(fā)揮著重要作用[10-11]；在前列腺癌的研究中，過表達(dá)SIRT4抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時抑制谷氨酰胺的代謝[11]；同時有多項研究指出SIRT4 可以協(xié)同化療藥物，例如SIRT4可以增強結(jié)直腸癌細(xì)胞對5-FU和奧沙利鉑的化學(xué)敏感度[12]；SIRT4能增強乳腺癌細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性[13]等。本研究采用低表達(dá)SIRT4的骨肉瘤細(xì)胞株U2OS和MG63為研究對象，構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)SIRT4 的人骨肉瘤細(xì)胞株，以研究過表達(dá)SIRT4 對骨肉瘤細(xì)胞株U2OS 和MG63 惡性生物學(xué)行為、成骨分化及能量代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

骨肉瘤細(xì)胞株U2OS由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院黃增益教授贈予，骨肉瘤細(xì)胞株MG63由本實驗室保存；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；105 IU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；過表達(dá)SIRT4 慢病毒購自擎科生物；青霉素-鏈霉素溶液（100×）、胰蛋白酶消化液、DAPI 染料、結(jié)晶紫染液、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、茜素紅S 染液、Beyo‐ClickTMEdU 555 細(xì)胞增殖檢測試劑盒、Triton-X100、抗熒光淬滅封片液、一抗稀釋液及封閉液、葡萄糖檢測試劑盒以及ATP檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR 熒光染料購自abclonal 生物科技有限公司；CCK-8試劑購自米鼠（西安）生物科技有限公司；鼠抗人SIRT4單克隆抗體購自proteintech武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，鼠抗β-actin 單克隆抗體、山羊抗鼠二抗購自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；全蛋白提取試劑盒、乳酸（lactate，LD）測試盒以及Annexin VAPC/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；四甲基羅丹明酯染色（tetramethylrhodamineethylester perchlorate，TMRE）測定試劑購自Medchemex‐press公司；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物購自北京六合華大基因科技股份有限公司，引物序列見表1。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將U2OS、MG63細(xì)胞用含有10%胎牛血清及青霉素/鏈霉素（1X）的DMEM 高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行過表達(dá)SIRT4慢病毒和空白對照病毒轉(zhuǎn)染。

實驗設(shè)置2組，每次實驗重復(fù)次數(shù)至少3次以上：①陰性對照組，轉(zhuǎn)染空載慢病毒；②SIRT4過表達(dá)組，轉(zhuǎn)染SIRT4過表達(dá)慢病毒。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測SIRT4 mRNA表達(dá)水平 篩選過表達(dá)SIRT4的慢病毒U2OS和MG63穩(wěn)定株篩選后，提取各組細(xì)胞總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過q-PCR 檢測各組細(xì)胞中SIRT4 mRNA表達(dá)水平。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測SIRT4和Id1的蛋白的表達(dá) 篩選過表達(dá)SIRT4的慢病毒U2OS和MG63穩(wěn)定株篩選后，提取各組細(xì)胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度并定量，再配制10% SDS-PAGE以分離目的蛋白。先用90 mV電壓15～20 min電泳，后轉(zhuǎn)130 mV電壓30 min電泳分離蛋白，將分離后的蛋白用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉30 min后洗膜；然后加入SIRT4 鼠抗人單克隆抗體（1∶40 000）、Id1（inhibitor ofDNA binding 1）兔抗人單克隆抗體（1∶1 000）、β-actin單克隆抗體（1∶10 000），4 ℃反應(yīng)過夜；回收一抗后，繼續(xù)用TBST洗膜，隨后加入山羊抗鼠抗原（1∶5 000）、山羊抗兔抗原（1∶5 000），室溫反應(yīng)2 h后TBST洗膜，最后ECL發(fā)光顯影。采用ImageJ軟件分析各組蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對表達(dá)水平通過目的蛋白與β-actin的比值來表示。

1.3.3 細(xì)胞克隆形成實驗、CCK-8、Edu555細(xì)胞增殖檢測法以及裸鼠脛骨成瘤實驗檢測細(xì)胞的增殖能力 1.3.3.1 細(xì)胞克隆形成實驗 細(xì)胞按5×102個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)到大多數(shù)單個克隆細(xì)胞數(shù)目大于50%為止，克隆完成后用4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗加入結(jié)晶紫染料，室溫避光孵育20 min，最后PBS洗滌3次后拍照。

1.3.3.2 CCK-8法 取2組骨肉瘤細(xì)胞按2.5×103個/孔接種于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2 的孵箱中培養(yǎng)，于細(xì)胞貼壁0 h、24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1.5 h，最后用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處各孔的吸光度（absorbance，A）值。

1.3.3.3 Edu555細(xì)胞增殖檢測法 細(xì)胞鋪板48 h后進(jìn)行檢測，加入1×Edu工作液孵育3.5 h進(jìn)行標(biāo)記，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定30 min，去除固定液后PBS清洗，再用0.3%的Triton-X100通透15 min，后用PBS洗3次，再用Edu555工作液每個孔200 μL室溫避光敷育30 min，然后PBS洗3次，DAP染色15 min后用PBS清洗，最后用抗熒光淬滅封片液進(jìn)行封片，使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖片拍攝。

1.3.3.4 裸鼠脛骨成瘤實驗 將MG63 2 組骨肉瘤細(xì)胞離心收集后計數(shù)，用無菌PBS 重懸細(xì)胞將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107 個/mL，用碘伏消毒后經(jīng)裸鼠膝關(guān)節(jié)注射60 μL的細(xì)胞懸液至脛骨骨膜內(nèi)，每周觀察腫瘤大小，4周后處死裸鼠，分離腫塊，拍照記錄。

1.3.4 DAPI染色法、Annexin V-APC/7-AAD雙染法檢測細(xì)胞的凋亡 1.3.4.1 DAPI染色法 細(xì)胞貼壁24 h后進(jìn)行染色，4%多聚甲醛固定30 min后，用PBS清洗，加入DAPI染料室溫避光孵育，最后PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.3.4.2 Annexin V-APC/7-AAD 雙染法 用不含EDTA 的胰蛋白酶溶液消離心收集細(xì)胞沉淀，加入500 μL BlindBuffer輕輕吹勻成單細(xì)胞懸液，再加入5 μL AnnexinV-APC和5 μL7-ADD染液，輕輕吹勻，室溫避光染色10 min，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.5 劃痕法、Transwell檢測細(xì)胞侵襲、遷移能力 1.3.5.1 劃痕法 待細(xì)胞密度長到95%以上后用200 μL的Tip頭垂直均勻用力劃痕，PBS清洗后加入基礎(chǔ)培養(yǎng)，在0 h、24 h、48 h后鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況。劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%1.3.5.2 Transwell遷移實驗 將細(xì)胞離心計數(shù)，調(diào)節(jié)濃度為1×105個/mL，然后在Transwell chamber上室中加入100 μL無血清細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 10% 血清的完全培養(yǎng)基，24 h加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后加入結(jié)晶紫染色，最后PBS清洗后顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5.3 Transwell 侵襲實驗 Transwell chamber 下室加入60 μL稀釋基質(zhì)膠，放入孵育箱中至基質(zhì)膠凝固，將細(xì)胞離心計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105個/mL，后上室中加入100 μL無血清細(xì)胞懸液，在下室中加入500 μL 10%血清的完全培養(yǎng)基，24 h后PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min后用PBS清洗，加入結(jié)晶紫染色，最后PBS輕洗用棉簽輕拭去上室細(xì)胞，顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 加入胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞離心，用PBS 洗滌后加入75% 乙醇4 ℃固定24 h，PBS洗滌后離心，加入500 μL細(xì)胞周期試劑，振蕩混勻，室溫避光放置30 min，最后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.3.7 堿性磷酸酶染色、茜素紅染色檢測細(xì)胞成骨分化能力 1.3.7.1 ALP染色法 細(xì)胞用含4%FBS、10 mmol/L β-磷酸甘油、0.1 μmol/L地塞米松、0.1 g/mL VitC的成骨培養(yǎng)基處理2周后，4%多聚甲醛室溫避光固定，再用堿性磷酸酶顯色緩沖室溫避光染色后拍照。

1.3.7.2 茜素紅S染色法 細(xì)胞經(jīng)過上述成骨培養(yǎng)基處理30 d后，4%多聚甲醛避光固定，再用茜素紅S染液室溫避光染色后拍照。

1.3.8 過表達(dá)SIRT4對骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞能量代謝的影響 1.3.8.1 葡萄糖消耗量檢測 細(xì)胞鋪板24 h 后每孔加入200 μL裂解液，將細(xì)胞刮下離心收集，取上清液待測，每個EP 管中分別加入5 μL 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，再依次加入185 μLGlucose Assay Reagent，PCR儀上95 ℃ 8 min循環(huán)至4 ℃后，每管取180 μL液體至96孔板中，測定630 nm的A值，再用BCA試劑盒測樣品的蛋白濃度，最后按照說明方法計算葡萄糖消耗量。

1.3.8.2 乳酸生成量檢測 細(xì)胞鋪板24 h后離心，300 W超聲破碎收集上清液備用，EP管中分別加入20 μL的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品、1 mL的酶工作液和200 μL的顯色劑混勻，37 ℃水浴箱反應(yīng)10 min后加入2 mL終止液終止反應(yīng)，每管吸出250 μL液體至潔凈的96孔板中，測定530 nm的A值；再用BCA試劑盒測定樣品的蛋白濃度，最后按照說明方法計算乳酸生成量。

1.3.8.3 ATP檢測 細(xì)胞鋪板24 h后離心收集上清液備用，在避光的96孔板中依次加入100 μL ATP檢測工作液、20 μL樣品和標(biāo)準(zhǔn)品混勻，用化學(xué)發(fā)光儀測定RLU值，再用BCA試劑盒測定樣品的蛋白濃度，最后按照說明方法計算細(xì)胞中ATP含量。

1.3.8.4 線粒體膜電位檢測 細(xì)胞鋪板24 h 加入稀釋的TMRE染料敷育30 min，再加入1X的Hoechest敷育20 min后用PBS清洗，最后加入DMEM，用共聚焦顯微鏡拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 GraphPad Prism 9.4.1統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用t檢驗或單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)SIRT4上調(diào)U2OS、MG63細(xì)胞中SIRT4的表達(dá)，抑制Id1的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示SIRT4在骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞中的表達(dá)均低于正常成骨細(xì)胞Hfob1.19（圖1A）（Plt;0.01、Plt;0.001），故以U2OS、MG63細(xì)胞為研究對象，過表達(dá)SIRT4進(jìn)行實驗。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖1B）顯示，與對照組相比，過表達(dá)SIRT4中U2OS、MG63細(xì)胞的SIRT4mRNA表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.001）；Western blot檢測結(jié)果（圖1C、D）顯示在過表達(dá)SIRT4的U2OS、MG63細(xì)胞的SIRT4蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.05）；Id1的蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.05）。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染SIRT4過表達(dá)慢病毒后，可明顯上調(diào)U2OS、MG63細(xì)胞中SIRT4的mRNA及蛋白表達(dá)水平，而上調(diào)的SIRT4則可以抑制Id1的表達(dá)。

2.2 過表達(dá)SIRT4可抑制骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞增殖

細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)晶紫染色結(jié)果（圖2A）顯示，過表達(dá)SIRT4 組U2OS、MG63 細(xì)胞克隆形成數(shù)較對照組減少；CCK-8 結(jié)果（圖2B）顯示，在0 h、24 h、48 h 時各處理組間A450 nm 值無明顯差異，在72 h時，過表達(dá)SIRT4組的A450 nm 值明顯小于對照組（Plt;0.01）；EDU染色（圖2C）結(jié)果顯示，過表達(dá)SIRT4組U2OS、MG63細(xì)胞增殖數(shù)較NC組明顯減少；裸鼠脛骨成瘤（圖2D）結(jié)果表明MG63過表達(dá)組細(xì)胞的瘤體明顯小于對照組。以上表明過表達(dá)SIRT4 可以抑制骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞的增殖。

2.3 過表達(dá)SIRT4促進(jìn)骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞凋亡

DAPI染色（圖3A）顯示過表達(dá)SIRT4組U2OS、MG63細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯多于對照組（Plt;0.05）；Annexin V-APC/7-AAD 雙染法流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖3B）顯示，與對照組相比較，過表達(dá)SIRT4 組細(xì)胞的凋亡率增高（Plt;0.05、Plt;0.01）。這些結(jié)果顯示，過表達(dá)SIRT4促進(jìn)骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞的凋亡。

2.4 過表達(dá)SIRT4抑制骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞的遷移能力

劃痕實驗（圖4A）顯示，劃痕后24 h 及48 h，過表達(dá)SIRT4組劃痕愈合速度較NC組明顯減慢，48 h過表達(dá)SIRT4組劃痕愈合率明顯低于NC 組（Plt;0.01、Plt;0.001）；Transwell實驗（圖4B）顯示，過表達(dá)SIRT4組細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯低于對照組細(xì)胞數(shù)。以上結(jié)果顯示，過表達(dá)SIRT4能夠抑制骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞的遷移能力。

2.5 過表達(dá)SIRT4 抑制骨肉瘤U2OS、MG63 細(xì)胞的侵襲能力

基質(zhì)膠Transwell實驗結(jié)果（圖4C）顯示，過表達(dá)組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組穿膜細(xì)胞數(shù)。結(jié)果提示，過表達(dá)SIRT4抑制骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞的侵襲能力。

2.6 過表達(dá)SIRT4對骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞周期實驗結(jié)果（圖5）顯示，過表達(dá)SIRT4組細(xì)胞的G0/G1 期占比明顯增多，S期占比明顯減少（Plt;0.01、Plt;0.001）。這一結(jié)果提示，過表達(dá)SIRT4可以將細(xì)胞周期阻滯在G1期影響細(xì)胞分裂，從而影響U2OS、MG63的增殖。

2.7 過表達(dá)SIRT4促進(jìn)骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞的成骨分化能力

堿性磷酸酶染色結(jié)果（圖6A）顯示，過表達(dá)SIRT4組染色較對照組陽性率明顯上升；茜素紅S染色結(jié)果（圖6B）顯示，過表達(dá)SIRT4組與對照組相比鈣鹽沉積明顯增多。以上結(jié)果顯示，過表達(dá)SIRT4能夠促進(jìn)骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞的早期和晚期成骨分化。

2.8 過表達(dá)SIRT4對骨肉瘤U2OS、MG63細(xì)胞能量代謝的影響

檢測U2OS和MG63細(xì)胞的葡萄糖含量和培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗量（圖7A），證明過表達(dá)SIRT4組所消耗的葡萄糖較對照組減少（Plt;0.05、Plt;0.01、Plt;0.001）；檢測U2OS 和MG63細(xì)胞的乳酸含量和培養(yǎng)基中的乳酸含量（圖7B），發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT4 組所產(chǎn)生的乳酸較對照組減少（Plt;0.05、Plt;0.01）；檢測U2OS和MG63細(xì)胞中的ATP（圖7C），發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT4組產(chǎn)生的ATP較對照組更少（Plt;0.01）；通過TMRE染色檢測線粒體膜電位（圖7D），發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT4組的平均熒光強度較對照組更低（Plt;0.05）。以上結(jié)果提示，過表達(dá)SIRT4可能通過影響U2OS、MG63骨肉瘤細(xì)胞的能量代謝來逆轉(zhuǎn)骨肉瘤的惡性生物學(xué)行為。

3 討 論

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年[14]，最常見的原發(fā)部位是長骨（例如股骨遠(yuǎn)端）、脛骨近端和肱骨近端干骺端[15-17]。新輔助化療的出現(xiàn)使得無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的5年生存率約70%，而伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5年生存率則低至30%[18]。有研究指出能夠通過抑制JAK2/STAT3和WNT/β-catenin信號通路抑制骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移[19]；通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 信號通路抑制骨肉瘤的發(fā)展[20]；激活STING/IRF3/IFN-β通路誘導(dǎo)骨肉瘤的免疫浸潤[21]。骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個極其復(fù)雜的過程，因此發(fā)現(xiàn)骨肉瘤新的治療靶點勢在必行。

SIRT4是一類高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性蛋白去乙?；?，主要位于線粒體中，在線粒體代謝和其他過程中發(fā)揮作用，比如谷氨酸代謝和糖代謝[5]。最近大量的研究已經(jīng)證實了SIRT4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義[22-24]；在胰腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、腎母細(xì)胞瘤、伯基特淋巴瘤的研究中表明，SIRT4可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)凋亡，同時通過影響線粒體調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝[10，25-27]。與其他發(fā)現(xiàn)一致，本研究結(jié)果表明SIRT4可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為，同時本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞過表達(dá)SIRT4后Id1被抑制；而本課題組前期發(fā)現(xiàn)敲低Id1可以逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[28]。SIRT4可能通過抑制Id1逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為并促進(jìn)其成骨分化。Id1又名分化抑制因子，它可以抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等[29-30]；在結(jié)腸癌和肺細(xì)胞癌的研究中表明Id1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[31]，同時在肺細(xì)胞癌中敲低Id1影響糖酵解的關(guān)鍵酶[32]；所以SIRT4通過調(diào)節(jié)Id1影響骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的具體機制還需進(jìn)一步探索。

越來越多的研究表明，能量代謝與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展有著密切的關(guān)系。例如通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）活性降低線粒體膜電位，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[33]；通過影響細(xì)胞的糖酵解可以抑制肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展[34]，以及通過抑制能量代謝聯(lián)合抗腫瘤藥物來發(fā)揮抗腫瘤作用[35]，并且近期有研究表明通過抑制骨肉瘤細(xì)胞的糖酵解可以抑制骨肉瘤的進(jìn)展[36]；本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT4后骨肉瘤細(xì)胞的葡萄糖的消耗和乳酸分泌減少。葡萄糖的消耗主要涉及糖酵解和三羧酸循環(huán)。有研究指出SIRT4可以抑制丙酮酸脫氫酶[37]，而丙酮酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，所以SIRT4可能通過抑制三羧酸循環(huán)來抑制骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為；因此本研究檢測了骨肉瘤細(xì)胞的總ATP和線粒體膜電位，結(jié)果表明骨肉瘤細(xì)胞的總ATP含量和線粒體膜電位均降低。ATP主要通過糖酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生，線粒體是ATP主要產(chǎn)生部位，本研究結(jié)果中線粒體膜電位與ATP檢測結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明過表達(dá)SIRT4可以影響人骨肉瘤細(xì)胞的能量代謝，而SIRT4是否通過抑制Id1調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的能量代謝影響惡性生物學(xué)行為有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，過表達(dá)SIRT4抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制骨肉瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡及早晚期成骨分化，調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞能量代謝。而SIRT4能否通過抑制Id1調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的能量代謝進(jìn)而影響惡性生物學(xué)行為還需進(jìn)一步研究，從而為骨肉瘤的治療提供新的思路和方法。

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（責(zé)任編輯：李青穎）