【摘 要】目的：識別雙硫死亡相關基因在結(jié)直腸癌中的表達模式。方法：嚴格選出TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌樣本開展差異基因分析，并與已報道文獻中的雙硫基因取交集，篩選出雙硫死亡相關結(jié)直腸癌差異基因，在GEO數(shù)據(jù)庫和人類蛋白圖譜（humanprotein atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫上進一步驗證了雙硫死亡相關基因的表達，對基因SLC7A11 在人結(jié)直腸癌樣本中的表達進行了qPCR驗證。下載GSE184093數(shù)據(jù)集，利用上述篩選獲得的基因作為標記，設置不同的閾值對癌癥和對照樣本進行分類，并使用ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）評估分類效果。通過K-M生存分析，鑒定標記基因?qū)颊呖傮w生存率的影響，利用TIMER數(shù)據(jù)庫分析標記基因的表達與免疫細胞浸潤的相關性。結(jié)果：識別出了2個與結(jié)直腸癌相關的雙硫死亡相關基因。SLC7A11 和SLC3A2 這2個雙硫死亡相關基因均在結(jié)直腸癌患者中高表達，并且SLC7A11 高表達，結(jié)直腸癌患者預后良好，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；SLC3A2 高表達，結(jié)直腸癌患者預后較差，但是差異無統(tǒng)計學意義（P=0.061）。使用SLC7A11 和SLC3A2 作為標記，對樣本進行分類鑒別結(jié)直腸癌，通過ROC曲線圖可以發(fā)現(xiàn)，SLC7A11 和SLC3A2 對結(jié)直腸癌鑒別診斷的AUC分別為0.840（95%CI=0.663～1.000）和0.667（95%CI=0.395～0.938），SLC7A11 對鑒別診斷結(jié)直腸癌具有一定的準確性，SLC3A2對鑒別診斷結(jié)直腸癌具有較低的準確性。SLC7A11 和SLC3A2 在結(jié)直腸癌的免疫浸潤中起著重要的作用，SLC7A11 表達與結(jié)腸腺癌中的CD8+T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤水平正相關（Plt;0.001），SLC7A11 表達與直腸癌的CD8+T細胞、中性粒細胞浸潤水平正相關（Plt;0.001）。SLC3A2 表達與結(jié)腸腺癌的CD8+T細胞、B細胞浸潤水平負相關（Plt;0.01），與結(jié)腸腺癌的CD4+T細胞正相關（Plt;0.05）。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)，SLC7A11 和SLC3A2 這2個雙硫死亡相關基因均在結(jié)直腸癌患者中高表達，并與結(jié)直腸癌免疫浸潤密切相關，且SLC7A11 對結(jié)直腸癌鑒別診斷具有一定的準確性，為結(jié)直腸癌提供了可靠和潛在的治療靶點。

【關鍵詞】結(jié)直腸癌；生物信息學；雙硫死亡；生存分析；免疫浸潤

【中圖分類號】R114 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2023-06-07

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)Siegel RL等[1]的報道和2020年我國癌癥統(tǒng)計報告[2]顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，并且有年輕化表現(xiàn)，其惡性程度在世界排名第三位，死亡率高居第二位。雖然目前結(jié)直腸癌的診斷技術和治療方式均在不斷發(fā)展改善，但晚期結(jié)直腸癌患者預后極差，5年生存率不到12%[3]。因此，有必要深入挖掘結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制，為臨床結(jié)直腸癌的診斷治療提供新的思路。根據(jù)最新研究發(fā)現(xiàn)，雙硫死亡是由細胞內(nèi)的雙硫化合物積累，引發(fā)雙硫應激/脅迫，最終導致的細胞死亡[4]。而結(jié)直腸癌與雙硫死亡的相關性，還未有文獻報道。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫和已報道的雙硫死亡相關基因，識別結(jié)直腸癌中的雙硫死亡相關基因。并在GEO 數(shù)據(jù)庫和人類蛋白圖譜（human proteinatlas，HPA）數(shù)據(jù)庫上進一步驗證得到目的基因。分別使用ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）和K-M生存曲線圖分析目的基因?qū)Y(jié)直腸癌鑒別診斷價值和對患者總體生存率的影響，最后利用TIMER數(shù)據(jù)庫分析目的基因表達與免疫細胞浸潤的相關性。本課題組為結(jié)直腸癌提供潛在的治療靶點。技術路線見圖1。

1 材料與方法

1.1 從TCGA數(shù)據(jù)庫中鑒定雙硫死亡相關基因

從TCGA 數(shù)據(jù)庫[5]（https：//portal.gdc.cancer.gov） 下載并整理TCGA-COAD 和TCGA-READ 項目STAR 流程的RNAseq數(shù)據(jù)并提取Counts格式的數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)，去除沒有臨床數(shù)據(jù)的樣本，最終得到包括647個腫瘤組織和51個癌旁組織。雙硫死亡相關基因從文獻[4]中收集。將雙硫死亡相關基因與TCGA數(shù)據(jù)集中的DEGs取交集，得到目標基因。

1.2 基因表達數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)圖譜（HPA）數(shù)據(jù)庫中SLC7A11、SLC3A2 轉(zhuǎn)錄和翻譯水平驗證

GEO 數(shù)據(jù)庫[6]（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo）選取GSE134834 和GSE6988 數(shù)據(jù)集，全部來源為人類。通過GSE134834數(shù)據(jù)集中正常結(jié)直腸組織5例，結(jié)直腸癌組織5例驗證結(jié)直腸腫瘤組織和正常組織中SLC7A11 和SLC3A2 表達水平。通過GSE6988數(shù)據(jù)集驗證結(jié)直腸腫瘤組織和正常組織SLC3A2 的表達水平，GSE6988數(shù)據(jù)集中正常結(jié)直腸組織28例，結(jié)直腸癌組織82例。HPA是1個開放的數(shù)據(jù)庫，允許學術界和工業(yè)界的研究人員免費訪問來探索人類蛋白質(zhì)組。在本研究中，使用HPA數(shù)據(jù)庫[7]（http：// www.proteinatlas.org），通過免疫組化方法驗證了從正常細胞和腫瘤細胞中SLC3A2 的蛋白表達。

1.3 基因SLC7A11 qPCR實驗驗證

使用結(jié)腸癌cDNA芯片（上海芯超），包括結(jié)直腸癌和癌旁各15 例標本，檢測SLC7A11 基因和內(nèi)參基因b-Actin。SLC7A11 基因引物序列[8]（Forward：5'-ATACGCTGAGTGTGGTTTGC-3'，Reverse：5'-GTTCCACCCAGACTCGTA-3'），b-Actin基因引物序列（Forward：5'-GAAGAGCTACGAGCTGCCTGA-3'，Reverse：5'-CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3'），按照熒光定量PCR試劑的試劑盒說明書進行操作，按以下擴增程序進行熒光定量PCR擴增檢測：預變性95℃ 5 min；循環(huán)：變性95℃ 15 S，退火60℃ 30 S，延伸72℃ 30 S，循環(huán)40 次。實驗結(jié)束后按照相對定量方法計算SLC7A11 基因表達。

1.4 SLC7A11 和SLC3A2 對結(jié)直腸癌鑒別的診斷價值

在本研究中，SLC7A11 和SLC3A2 對結(jié)直腸癌鑒別診斷價值，通過GSE184093數(shù)據(jù)集進行分類分析，其中正常結(jié)直腸組織和腫瘤組織各9例樣本，使用SLC7A11 和SLC3A2 的表達量作為基因標記物，并統(tǒng)計分類結(jié)果的特異性和敏感度，結(jié)果用ROC曲線展示，并計算AUC量化預測效果。在AUCgt;0.5的情況下，AUC越接近于1，說明該變量在預測結(jié)局上診斷效果越好。0.50.9時有較高準確性。AUC=0.5時，說明該變量不起作用，無診斷價值。

1.5 結(jié)直腸癌患者SLC7A11 和SLC3A2 生存分析

使用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫[9]（http：//kmplot. com/analysis/）中記錄的基因表達和患者生存時間數(shù)據(jù)，對基因SLC7A11 和SLC3A2 對結(jié)直腸癌的影響進行生存分析。

1.6 結(jié)直腸癌中腫瘤浸潤免疫細胞與SLC7A11 和SLC3A2表達相關性分析

TIMER 數(shù)據(jù)庫[10]（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）可用于系統(tǒng)評價各種類型腫瘤的免疫細胞浸潤。該數(shù)據(jù)庫用于分析樹突狀細胞（dendritic Cell）、中性粒細胞（neutrophil）、巨噬細胞（macrophage）、CD4+T細胞（CD4+ T cell）、CD8+T細胞（CD8+ T cell）和B細胞（B cell）的腫瘤浸潤情況。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有統(tǒng)計分析均采用R（4.2.1）版本進行。使用pROC包對進行分類效果評估的ROC 分析。正態(tài)計量資料采用均數(shù)±標準差形式表達，非正態(tài)計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）[Md（P25，P75）]表示，計數(shù)資料用率、構(gòu)成比等形式表達。腫瘤樣本和正常樣本之間SLC7A11 和SLC3A2 的差異表達水平采用Mann-Whitney U 檢驗和獨立樣本t 檢驗。所有結(jié)果均使用ggplot2進行可視化。高表達和低表達均是與非腫瘤細胞相比較。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 從TCGA數(shù)據(jù)庫中鑒定雙硫死亡相關基因

TCGA數(shù)據(jù)庫中滿足p.adjlt;0.05且|log2FC|≥1閾值的genesymbol有15768個，與文獻查詢到的6個雙硫死亡相關基因（包括：SLC7A11、SLC3A2、GLUT1、NCKAP1、WAVE2、Rac1）取交集后得到2 個雙硫死亡相關結(jié)直腸癌基因，分別是SLC7A11 和SLC3A2。具體見圖2A。SLC7A11 和SLC3A2 在腫瘤中均為高表達，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001）。具體見圖2B。

2.2 不同數(shù)據(jù)庫和人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）對SLC7A11 和SLC3A2 轉(zhuǎn)錄水平的驗證

通過GSE134834 數(shù)據(jù)庫驗證，SLC7A11 和SLC3A2 在腫瘤組織中均高表達，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；通過GSE6988數(shù)據(jù)庫驗證，SLC3A2 在腫瘤組織中高表達，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001）。具體見圖3。通過HPA也驗證了結(jié)直腸癌腫瘤組織中SLC3A2 的蛋白高表達，圖中紅色方框為放大區(qū)域。具體見圖4。綜上所述，這些結(jié)果提示SLC7A11和SLC3A2 在結(jié)直腸癌患者中表達上調(diào)，與TCGA數(shù)據(jù)庫表達一致。

2.3 基因SLC7A11 qPCR實驗驗證

通過qPCR實驗驗證，基因SLC7A11 在結(jié)直腸癌組織中高表達，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。具體見圖5。

2.4 SLC7A11 和SLC3A2 對結(jié)直腸癌鑒別的診斷價值

利用SLC7A11 和SLC3A2 2個基因作為標記物，使用不同的閾值對樣本進行分類，并評估分類的準確性。通過ROC曲線圖可以發(fā)現(xiàn)，SLC7A11 對結(jié)直腸癌鑒別診斷AUC=0.840，95%CI=0.663～1.000，SLC3A2 對結(jié)直腸癌鑒別診斷AUC=0.667，95%CI=0.395～0.938，SLC7A11 對結(jié)直腸癌鑒別診斷具有一定的準確性。SLC3A2 對結(jié)直腸癌的診斷價值相對較低。具體見圖6。

2.5 結(jié)直腸癌患者SLC7A11 和SLC3A2 的生存分析

通過K-M 生存曲線分析SLC7A11 和SLC3A2 基因?qū)颊呖傮w生存率的影響，可以發(fā)現(xiàn)，SLC7A11 高表達，結(jié)直腸癌患者預后較好，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；SLC3A2 高表達，結(jié)直腸癌患者預后較差，但是差異無統(tǒng)計學意義（P=0.061）。具體見圖7。

2.6 結(jié)直腸癌腫瘤浸潤免疫細胞與SLC7A11 和SLC3A2 表達相關分析

在本研究中，進一步利用TIMER數(shù)據(jù)庫來分別評估結(jié)直腸癌中免疫浸潤水平與SLC7A11 和SLC3A2 表達之間的相關性。SLC7A11 表達與結(jié)腸腺癌中的CD8+ T 細胞（r=0.358）、中性粒細胞（r=0.267）、樹突狀細胞（r=0.171）浸潤水平呈正相關（Plt;0.001），SLC7A11 表達與直腸癌的CD8+ T細胞（r=0.365）、中性粒細胞（r=0.336）浸潤水平呈正相關（Plt;0.001），具體見圖8。SLC3A2 表達與結(jié)腸腺癌的CD8+ T細胞（r=-0.184）、B細胞（r=-0.158）浸潤水平呈負相關（Plt;0.01），與結(jié)腸腺癌的CD4+ T細胞（r=0.11）呈正相關（Plt;0.05），具體見圖9。

3 討 論

大量研究報道了多種其他基因也與結(jié)直腸癌相關[11-13]，然而其發(fā)病機制仍不明確，患者的5年生存率尚待提高。因此，為提高結(jié)直腸癌的預防、早期診斷、個體化治療及預后的評估，非常有必要進一步識別潛在的分子生物標志物和治療靶點。近期一項研究表明[4]，當腫瘤細胞高表達SLC7A11蛋白時，在葡萄糖饑餓的條件下，細胞胞內(nèi)的胱氨酸等二硫化物會發(fā)生異常積累，后者會誘導二硫化物應激/脅迫，導致肌動蛋白細胞骨架之間的異常二硫鍵交聯(lián)，最終引起肌動蛋白網(wǎng)絡崩潰，從而形成腫瘤細胞死亡。這種因葡萄糖缺乏而誘導的高表達SLC7A11 癌細胞死亡不屬于任何一種已知的細胞死亡類型，不但不能被一般細胞死亡抑制劑或敲除鐵死亡/細胞凋亡關鍵基因所阻止，且硫醇氧化劑（如二酰胺和馬來酸二乙酯）則可以顯著增強這種細胞死亡，因而該死亡方式被命名為雙硫死亡。研究還發(fā)現(xiàn)[4]，高表達SLC7A11 的癌細胞在葡萄糖轉(zhuǎn)運體（glucose transporter，GLUT）抑制劑的誘導下可發(fā)生雙硫死亡，進而抑制腫瘤生長，且對正常組織無明顯毒性，有望成為腫瘤治療的新策略。因此，本研究旨在基于生物信息學方法識別雙硫死亡相關基因與結(jié)直腸癌的關系，并評估結(jié)直腸癌免疫細胞浸潤情況。

在本研究中，通過生物信息學分析識別出了2個雙硫死亡相關基因與結(jié)直腸癌密切相關，包括基因SLC7A11 和SLC3A2，它們均在結(jié)直腸癌中高表達。通過K-M 生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，SLC7A11 高表達，與預后良好相關。SLC7A11 基因可能被認為是一種潛在的預后標志物。SLC7A11 和SLC3A2 基因均為溶質(zhì)載體家族（solute carrier family，SLC）中的成員，后者是人類基因組中僅次于G蛋白偶聯(lián)受體的第二大基因家族，參與介導代謝物和溶質(zhì)跨細胞膜的轉(zhuǎn)運[14]。SLC7A11 是一種重要的跨膜蛋白，其參與氨基酸代謝來維持胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)態(tài)，與SLC3A2 共同組成System Xc-。SLC7A11 作為SystemXc-的功能亞基發(fā)揮主要生物學功能和轉(zhuǎn)運活性，而SLC3A2 作為伴侶蛋白參與維持SLC7A11 的穩(wěn)定性，它們以1∶1的比例攝入胞外的Cys2并排出胞內(nèi)的谷氨酸（glutamate，Glu）[15]。進入細胞質(zhì)的Cys2迅速還原為Cys用于合成GSH[16]。如前所述，SLC7A11促進葡萄糖依賴性，導致具有高SLC7A11 表達的癌細胞對葡萄糖缺乏具有更高的敏感性[17]。

雙硫死亡相關基因一方面與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展或有密切關系，另一方面又在結(jié)直腸癌的免疫浸潤中起著重要的作用。進一步利用TIMER數(shù)據(jù)庫來分別評估結(jié)直腸癌免疫浸潤水平與SLC7A11和SLC3A2 表達之間的相關性中，發(fā)現(xiàn)SLC7A11 的表達與結(jié)腸腺癌中的CD8+ T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤水平呈正相關，與直腸癌的CD8+ T 細胞、中性粒細胞浸潤水平呈正相關。SLC3A2 的表達與結(jié)腸腺癌的CD8+ T細胞、B細胞浸潤水平呈負相關，與結(jié)腸腺癌的CD4+ T細胞呈正相關。有研究表明[18]，CD4+T細胞具有較高的免疫抑制作用，通過抑制有效地抗腫瘤免疫，促進腫瘤進展。B細胞也被證明在調(diào)節(jié)與腫瘤、自身免疫和炎癥相關的免疫反應中發(fā)揮重要作用[19]。CD8+ T細胞可以分化為細胞毒性T淋巴細胞，后者具有抗腫瘤作用。有研究報道，中性粒細胞是腫瘤微環(huán)境中重要的炎癥性浸潤細胞，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，腫瘤相關中性粒細胞可以極化為抗腫瘤表型（N1型）和促腫瘤表型（N2型）[20]。綜上所述，免疫浸潤與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關，但機制復雜。CD8+T細胞和中性粒細胞（N1型）均具有抗腫瘤作用，這些免疫細胞的升高，可能也與SLC7A11 高表達，結(jié)直腸癌患者總體生存期反而較長這一結(jié)果有一定的聯(lián)系。

人類SLC7A11-SLC3A2 復合物的結(jié)構(gòu)和Erastin結(jié)合該復合物的高分辨率結(jié)構(gòu)已經(jīng)有相關研究報告和解析[21-22]，這可能為合理設計有效的雙硫死亡誘導劑提供結(jié)構(gòu)基礎，從而產(chǎn)生更有效的治療策略。目前，針對SLC7A11 的疫苗已經(jīng)研制成功，但要達到抑制SLC7A11 的效果可能需要大劑量疫苗，而后者的安全性仍有待探索，還有其毒副作用也需要進一步評估[23]。因此，開發(fā)靶向SLC7A11 和或者SLC3A2 的新型高效小分子藥物可能是未來治療結(jié)直腸癌疾病的發(fā)展方向之一。本研究發(fā)現(xiàn)，SLC7A11 和SLC3A2 這2 個雙硫死亡相關基因均在結(jié)直腸癌患者中高表達，并與結(jié)直腸癌免疫浸潤密切相關，且SLC7A11 對結(jié)直腸癌鑒別診斷具有一定的準確性，本課題組的發(fā)現(xiàn)為結(jié)直腸癌提供了可靠和潛在的治療靶點。

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（責任編輯：周一青）