【摘 要】目的：探索肝癌缺失因子1（deleted in liver cancer 1，DLC-1）對耐恩雜魯胺前列腺癌（prostate cancer，PCa）細(xì)胞增殖，侵襲和凋亡的影響以及作用機(jī)制。方法：體外以不同濃度的恩雜魯胺藥物培養(yǎng)人前列腺癌lncap及C4-2細(xì)胞株6個(gè)月以上，構(gòu)建恩雜魯胺耐藥細(xì)胞系lncap-R，C4-2-R。CCK-8法檢測其IC50，驗(yàn)證恩雜魯胺耐藥株是否構(gòu)建成功。利用慢病毒轉(zhuǎn)染lncap-R，C4-2-R，以敲低和過表達(dá)DLC-1，采用克隆實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測DLC-1對耐恩雜魯胺的前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡的影響。結(jié)果：與對照組相比，過表達(dá)組DLC-1顯著抑制了2個(gè)耐藥株的增殖和侵襲進(jìn)程。機(jī)制上，WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DLC-1表達(dá)與2個(gè)耐藥株中Rho蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Rho抑制劑rhosin逆轉(zhuǎn)了因敲低DLC-1后lncap-R細(xì)胞凋亡減少的情況。結(jié)論：DLC-1可以下調(diào)耐藥株中的Rho蛋白的表達(dá)，并抑制耐藥株的增殖和侵襲。

【關(guān)鍵詞】肝癌缺失因子1；前列腺癌；恩雜魯胺；Rho蛋白；增殖；侵襲

【中圖分類號】R737.25 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-03-14

前列腺癌（prostate cancer，PCa）作為最常見的泌尿系惡性實(shí)體腫瘤，其發(fā)病率在男性群體中高居第2位，并且死亡率高居第5位[1]。隨著我國日漸加劇的人口老齡化程度，以及相關(guān)篩查方法的普及，如前列腺特異性抗原（Prostate Specific Antigen，PSA）[2]，泌尿系超聲等相關(guān)檢查，前列腺癌的早期診斷率和發(fā)病率逐年上升。對于前列腺癌患者，盡管我國家現(xiàn)在已有外科手術(shù)、放療、雄激素剝奪治療（androgen deprivation therapy，ADT）等治療方式[3]，但以上的這些方法更多的是用于患者的局部治療，而且前列腺癌患者的5年生存率并未達(dá)到令人滿意的程度。此外，部分前列腺癌患者采用雄激素剝奪治療方案后，最終還是會無法避免地進(jìn)展到去勢抵抗性階段，即去勢抵抗性前列腺癌[4]（castrationresistantprostate cancer，CRPC）。對于CRPC 患者，目前并沒有非常有效的治療方案，這也是導(dǎo)致CRPC患者死亡[5]的重要原因。為此，對于CRPC的研究至今仍然是泌尿系統(tǒng)疾病中難題之一。

恩雜魯胺（Enzalutamide，ENZ）是作為新一代的雄激素受體（androgen receptor，AR）拮抗劑[6]，可以在更大程度上競爭性地抑制雄激素與AR的結(jié)合[7]。除此以外，恩雜魯胺還可以阻止雄激素受體的在細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)以及AR與DNA的相互作用[8]。基于以上的機(jī)制，恩雜魯胺藥物對CRPC患者的治療具有良好效果，但是依然會有部分患者在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)藥物抵抗現(xiàn)象[9]，最后導(dǎo)致治療失敗。因此，探尋恩雜魯胺的耐藥機(jī)制對于臨床治療前列腺癌具有重大意義。

肝癌缺失因子1（deleted in liver cancer 1，DLC-1），位于染色體8p21-22區(qū)域[10]。最早開始于肝癌細(xì)胞中研究，在肝癌等多種實(shí)體瘤的研究中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)下調(diào)或缺失[11]。DLC-1可以激活GPT酶激活蛋白（GPTase-activating protein，GAP），而GAP作為一種小分子開關(guān)，在細(xì)胞的內(nèi)部起到負(fù)性調(diào)節(jié)激活型GTP-Rho到非激活型GDP-Rho的重要過程[12]，激活的Rho 蛋白可在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]和細(xì)胞的骨架重塑[14]中起重要作用。然而，lncap-R細(xì)胞，C4-2-R細(xì)胞中DLC1的潛在分子網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 恩雜魯胺耐藥株的構(gòu)建

lncap 細(xì)胞通過在含10% 的活性炭剝離血清的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)6 個(gè)月建立雄激素非依賴性lncap 細(xì)胞（lncapAndrogen Independence，lncap-AI），再通過在不同濃度的恩雜魯胺（1、2、5、10、20 μmol/L）培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月建立lncap-R細(xì)胞。C4-2細(xì)胞在10、20、40 μmol/L恩雜魯胺培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月以上建立C4-2-R細(xì)胞。

1.2 試劑

結(jié)晶紫（索萊寶科技公司），PBS（碧云天公司），RPMI1640和胎牛血清（Gibco公司），青霉素-鏈霉素（碧云天公司），胰蛋白酶（Sigma-Aldrich公司），DMSO（生工生物工程公司），CCK-8試劑盒（碧云天公司），DLC-1抗體及Rho抗體（Abmart公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) lncap細(xì)胞，C4-2細(xì)胞均為課題組前期保存。lncap細(xì)胞和C4-2細(xì)胞均在含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素的1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。Lncap-AI 細(xì)胞在10%木炭剝離胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。而Lncap-R，C4-2-R則在含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素以及不同濃度的恩雜魯胺的1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 于擎科公司購買DLC1-1的過表達(dá)和敲低質(zhì)粒，使用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的lncap-R細(xì)胞，C4-2-R細(xì)胞接種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度至60%，使用碧云天Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基，48 h后觀察轉(zhuǎn)染效率，72 h后加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-timepolymerase chain reaction，q-PCR） 采用TRIZOL 方法提取lncap-R細(xì)胞和C4-2-R細(xì)胞中的總RNA，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)反轉(zhuǎn)成cDNA，采用q-PCR 方法檢測lncap-R 細(xì)胞和C4-2-R細(xì)胞中的DLC-1 RNA 表達(dá)情況，最后使用2-ΔΔCt 法分析2株細(xì)胞中DLC-1的相對表達(dá)情況。在提取細(xì)胞中的總蛋白后，需要使用BCA法測量蛋白樣本的濃度，并選擇合適的蛋白樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。接著，使用伯樂濕轉(zhuǎn)裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。隨后，使用25%濃度的脫脂奶粉進(jìn)行2 h的封閉，再加入一抗在4 ℃孵育10 h。之后，用TBST洗滌6次，每次5 min，加入二抗在室溫蠟板上孵育2 h，再進(jìn)行6 次洗滌，每次5 min，最后使用bio-rad儀器進(jìn)行發(fā)光顯影。

1.3.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將每組細(xì)胞分別接種于96孔板，并在0、24、48、72 h后進(jìn)行處理。隨后吸除培養(yǎng)基，添加CCK-8試劑，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育1.5 h。最后使用酶標(biāo)儀檢測每組在450 nm處的吸光度來計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率=（[ 實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白孔吸光度）（/ 對照組吸光度-空白孔吸光度）]×100%。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù) 以5×105個(gè)/L的密度將細(xì)胞傳代于6孔板中，培養(yǎng)48 h，按需求將細(xì)胞分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入不含EDTA的胰酶1 mL/孔，消化2 min，離心收集沉淀細(xì)胞。用1 mL PBS將細(xì)胞重懸，吹打均勻，繼續(xù)離心，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，3 min，收集細(xì)胞。最后將樣本送到流式儀室進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)由軟件CytExpert進(jìn)行分析。

1.3.6 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過對數(shù)生長期細(xì)胞的消化和計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液重懸于完全培養(yǎng)基中，并在6孔板培養(yǎng)板中接種1 000個(gè)/孔作為實(shí)驗(yàn)組。隨后持續(xù)培養(yǎng)至第14天，直到大多數(shù)單個(gè)克隆中的細(xì)胞數(shù)超過50。完成克隆后，進(jìn)行PBS洗滌并固定，然后進(jìn)行結(jié)晶紫染色。6孔板流水沖洗干凈，風(fēng)干后進(jìn)行拍照。

1.3.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 取生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)期并且無污染的細(xì)胞，胰酶消化2 min，吹打制成單細(xì)胞懸液。tran?swell下室中加入含有20％胎牛血清的完全培養(yǎng)基600 μL，將單細(xì)胞懸液加入鋪有基質(zhì)膠的小室內(nèi)。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵培育48 h。取出小室，PBS洗滌2遍，使用甲醇固定15 min。隨后每個(gè)小室加入結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌2遍，風(fēng)干后，正置熒光顯微鏡下使用白光模式進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism9.5進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建耐恩雜魯胺lncap-R和C4-2-R細(xì)胞

對lncap 和C4-2細(xì)胞分別在20 μmol/L 和40 μmol/L 的恩雜魯胺培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月，直至2株細(xì)胞可以在恩雜魯胺培養(yǎng)基中可以穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，命名為lncap-R和C4-2-R。CCK8 對親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞測定IC50，結(jié)果顯示lncap 和lncap-R 的IC50 分別為11.78 μmol/L、51.33 μmol/L，lncap-R 的耐藥指數(shù)（resistance index，RI）為4.35（圖1A）。C4-2、C4-2-R細(xì)胞的IC50分別為28.90 μmol/L、74.18 μmol/L，C4-2-R的RI為2.56（圖1B）。

2.2 過表達(dá)DLC-1，可以抑制耐藥株的增殖

為了研究DLC-1在耐恩雜魯胺lncap-R和C4-2-R細(xì)胞的作用功能，本課題組在2株耐藥株中對DLC-1進(jìn)行了過表達(dá)，進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)以檢測耐藥株的增殖能力。q-PCR和WB實(shí)驗(yàn)證明，在2 株耐藥株中成功過表達(dá)DLC-1（圖2A、B）。對比NC 組，oe-DLC-1 組中的細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)明顯減少（圖2C），并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）（圖2D）。

2.3 敲低DLC-1，可以增加耐藥株的侵襲能力

為了進(jìn)一步研究DCL-1 的作用，在2 株耐藥株中對DLC-1進(jìn)行了敲低。Q-PCR和WB實(shí)驗(yàn)證明，本課題組在2株耐藥株中成功敲低DLC-1（圖3A、B）。進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)以檢測耐藥株的侵襲能力，對比NC 組，sh-DLC-1 組中的細(xì)胞侵襲能力明顯增加，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）（圖3C、D）。

2.4 DLC-1通過Rho通路調(diào)節(jié)耐恩雜魯胺lncap-R細(xì)胞的凋亡

最后，為了探究DLC-1 的作用機(jī)制，本課題組使用String數(shù)據(jù)庫對DLC-1進(jìn)行PPI蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作圖，發(fā)現(xiàn)其下游分子包括Rho通路（圖4A）。為了進(jìn)一步分析DLC-1和Rho 通路之間的聯(lián)系，特異性Rho 抑制劑rhosin 用于處理lncap-R細(xì)胞的NC組和sh-DLC1組細(xì)胞。如圖4B所示，對比NC 組和sh-DLC-1 組，NC+rhoisn 組和sh-DLC-1+rhosin組中的Rho表達(dá)量進(jìn)一步下降。rhosin顯著增加了NC組和sh-DLC-1組細(xì)胞的凋亡率（圖4C）。綜上所述，這些結(jié)果表明，Rho抑制劑rhosin在挽救lncap-R細(xì)胞中DLC1的功能中發(fā)揮了重要作用。

3 討 論

前列腺癌是老年男性最常見惡性腫瘤疾病之一[15]，因環(huán)境、人種和地區(qū)等因素的不同，所以各個(gè)地方前列腺癌患病率也具有較大的差異，其中歐美等發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)病率最高[16]。但是在近些年，我國前列腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)升高的趨勢，主要原因是我國人口結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)老齡化趨勢、篩查方法如PSA檢測法的普及，男性平均壽命的延長等各種原因。

雄激素是前列腺癌維持生長和進(jìn)展所必需的物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國近半成的患者首次發(fā)現(xiàn)前列腺癌即為晚期[17]。晚期前列腺癌的主要治療手段為新內(nèi)分泌治療，通過雄激素剝奪治療有一定的治療效果。然而ADT 治療后，部分患者最終會進(jìn)展為CRPC，并且預(yù)后較差。然而目前，針對CRPC的研究較少，且發(fā)生機(jī)制并不明確。目前其發(fā)病機(jī)制主要為以下幾個(gè)方面：AR擴(kuò)增和突變[18]、AR的異常活化或修飾[19]、AR剪接變異體[20]。但確定的是，一旦進(jìn)展到該階段，患者的生存時(shí)間將大大減少。所以，如何提高CRPC患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間，是泌尿醫(yī)生急需探索解決的一個(gè)重大難題。通過臨床輔助檢查證據(jù)表明，CRPC的發(fā)生與雄激素受體具有很強(qiáng)的相關(guān)性[21]。

作為第2代的靶向雄激素受體拮抗劑，恩雜魯胺不僅可以抑制雄激素與AR的結(jié)合，還可以阻止AR在核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此CRPC患者服用恩雜魯胺后，能有效延長CRPC患者的生存時(shí)間[22]，治療效果表現(xiàn)良好。但依然有部分患者對其產(chǎn)生耐藥性，最終會出現(xiàn)都對恩雜魯胺的耐藥 情況[23]。

本研究結(jié)果表明在2株耐藥株中，過表達(dá)DLC-1明顯抑制了耐藥株的侵襲能力。此外，本研究結(jié)果闡明了DLC-1是恩雜魯胺耐藥細(xì)胞中的腫瘤抑制因子。此外，本研究分析表明DLC1和Rho蛋白在恩雜魯胺耐藥細(xì)胞中呈負(fù)相關(guān)。DLC1可能通過抑制Rho通路來抑制恩雜魯胺耐藥細(xì)胞的增殖和侵襲。

在本次研究中，本研究在2株恩雜魯胺耐藥細(xì)胞中驗(yàn)證了DLC-1的生物學(xué)功能，使用慢病毒載體對DLC1進(jìn)行敲低和過表達(dá)。且2個(gè)實(shí)驗(yàn)部分獲得的結(jié)果是一致的，這使得本研究的結(jié)果更加可靠。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)Rho抑制劑可以挽救敲低DLC-1在耐藥株中的增殖能力。因此，rhosin是治療恩雜魯胺耐藥患者的潛在藥物，靶向Rho 信號通路，可能為恩雜魯胺耐藥患者的治療提供新的思路。

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（責(zé)任編輯：李青穎）