摘" 要： 近年來，隨著人口的快速增長，國際貿(mào)易日益頻繁，由未知病毒感染引起的新發(fā)傳染病對人類健康、畜牧業(yè)的發(fā)展以及公共衛(wèi)生安全的威脅正在不斷增加。因此快速、精確地監(jiān)測和檢測新發(fā)病毒是控制和預(yù)防傳染病疫情最有效的方法之一。傳統(tǒng)的病毒檢測方法操作簡單、技術(shù)要求低，但在準確性、時效性等方面存在較多局限。而利用適宜的分子生物學(xué)方法及測序技術(shù)可直接從臨床樣本中檢測未知病毒，這對于病原的快速識別并及時發(fā)現(xiàn)新型病毒具有重要意義。本文綜述了近年來應(yīng)用于新發(fā)病毒檢測的方法及測序技術(shù)的基本原理、發(fā)展情況和應(yīng)用領(lǐng)域，分析比較其差異及優(yōu)缺點，以供讀者參考。

關(guān)鍵詞： 新發(fā)病毒；檢測方法；測序技術(shù)；應(yīng)用

中圖分類號：S854.4

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5398-14

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.007

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-25

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1800503）

作者簡介：呂岱玥（1998-），女，陜西咸陽人，博士，主要從事微生物與免疫學(xué)研究，E-mail： 2541931135@qq.com

*通信作者：薛青紅，主要從事微生物與免疫學(xué)研究，E-mail：732574709@qq.com，Tel：010-62103638

Research Progress and Application of Emerging Virus Detection Methods and Sequencing Technology

L Daiyue1，2， CHEN" Yanfei1， ZHAI" Tianshu1， CAO" Shengbo2， XUE" Qinghong1*

（1.China Institute of Veterinary Drug Control， Beijing 100081，" China;

2.College of Veterinary

Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，" China）

Abstract：" In recent years， given the rapid increase in population and the frequency of international trade， the risks associated with emerging infectious diseases caused by unknown viral agents have heightened，posing threats to human health， animal husbandry， and public health. Therefore， the ability to rapidly and accurately monitor and detect emerging viruses is among the most effective strategies for controlling and preventing the outbreak of infectious diseases. While traditional methods for detecting virus are simple to operate and require minimal technical expertise， they are limited in terms of accuracy and timeliness. Unknown viruses can be directly detected from clinical samples by using appropriate molecular biological methods and sequencing technology， which is of great significance for the rapid identification of pathogens and the timely discovery of new viruses. This article reviews the basic principles， evolution and application fields of the methods and sequencing technologies used in the detection of emerging viruses in recent years. It also analyzes and compares their differences， advantages and disadvantages， offering valuable reference for the readers.

Key words： emerging virus; detection methods; sequencing technology; applications

*Corresponding author：" XUE Qinghong， E-mail：732574709@qq.com， Tel：010-62103638

新發(fā)傳染病（emerging infectious disease，EID）是指首次在人類或動物中發(fā)現(xiàn)的疾病，因其不確定性、病死率高、傳播速度快、波及范圍廣等特點，給人們的健康、畜牧業(yè)的發(fā)展和社會的穩(wěn)定帶來極大挑戰(zhàn)。2003年由冠狀病毒（corona virus，CoV）引發(fā)的SARS疫情［1］就是一個最經(jīng)典的案例。在疫情暴發(fā)的初期，由于缺乏未知病原快速鑒定技術(shù)，在很長一段時間無法確定病原，導(dǎo)致疫情無法得到及時、有效的控制，進而造成疫情的蔓延和巨大的經(jīng)濟損失。

在傳統(tǒng)的病毒檢測方法中，病毒分離培養(yǎng)的周期較長，或者在細胞培養(yǎng)的過程中不出現(xiàn)細胞病變而不能采用細胞培養(yǎng)的方法分離病毒；電鏡觀察的效率較低，成本較高，不適用于臨床檢測；免疫學(xué)方法（即抗原和抗體反應(yīng)）或基于核酸序列的PCR擴增都是“有的放矢”，不適用于新發(fā)病原的檢測。因此，具有非培養(yǎng)和非序列依賴特性的病毒檢測方法和測序技術(shù)應(yīng)運而生，尤其是下一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）的興起和新興學(xué)科宏基因組學(xué)（metagenomics）的出現(xiàn)使快速、高效地檢測和鑒定各類型樣本中潛在的未知病原體成為可能。

宏基因組學(xué)的概念最初由Handelsman等［2］于1998年提出，其定義為環(huán)境樣本中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，最初主要用于獲取細菌及真菌的基因序列。直到2005年Edwards等［3］在宏基因組學(xué)的基礎(chǔ)上首次提出病毒宏基因組學(xué)（viral metagenomics，VM），為病毒組學(xué)的研究打開新局面。病毒宏基因組學(xué)是指特定環(huán)境或生物樣品中所有病毒或病毒樣顆粒的遺傳信息，主要用于解析樣品中的病毒組。該技術(shù)在國內(nèi)外臨床醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等得到廣泛應(yīng)用，如新發(fā)病毒的快速鑒定及分子溯源等。尤其是在2019年不明原因的肺炎疫情暴發(fā)后，研究者利用病毒宏基因組技術(shù)在短時間內(nèi)便獲取了未知病毒的基因組序列，最終確定新病原，即新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome corona virus 2，SARS-CoV-2），同時明確其傳播途徑，為后續(xù)抑制疫情的蔓延提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

獲取病毒基因組的主要流程包括四個部分：（1）樣品的前處理；（2）病毒核酸的提取及擴增；（3）病毒基因組測序；（4）生物信息學(xué)分析。本文總結(jié)了近年來應(yīng)用于樣本前處理和病毒粒子分離富集的方法，以及用于獲取新發(fā)病毒核酸序列的分子生物學(xué)方法和測序技術(shù)，為新發(fā)病毒的快速鑒定提供技術(shù)參考。

1" 樣本前處理和病毒粒子的分離富集

臨床樣本中通常含有大量的宿主、細菌、真核細胞等基因污染，導(dǎo)致病毒基因組在樣本中所占的比例很小。如果不對樣本進行處理，通常只能得到病毒的部分基因序列。因此，需要采取必要措施減少無關(guān)序列對目的序列的干擾，并富集病毒粒子。

1.1 "離心

離心作為樣品前處理中最重要的步驟，目前已被廣泛應(yīng)用于病毒組學(xué)的研究。根據(jù)不同的原理，離心可分為差速離心法和密度梯度離心法。

差速離心法是富集病毒粒子最常見的方法，其基本原理是基于病毒粒子的大小遠遠小于細菌和宿主細胞的特性對其進行沉降富集，即逐漸提高離心速度將病毒與細菌、宿主細胞等分離。首先通過低轉(zhuǎn)速將較大的顆粒離心至管底，再利用較高的轉(zhuǎn)速離心分離懸浮液中小的顆粒物質(zhì)，以此達到分離不同大小顆粒的目的。因此需要足夠大的離心力才能保證體積較小的病毒粒子的沉降［4］。

密度梯度離心是利用同一介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，通過重力或離心力的作用使不同密度的病毒粒子集中在與其密度相同的介質(zhì)中并形成區(qū)帶，從而達到分離富集病毒粒子的目的。密度梯度離心常見的介質(zhì)有氯化銫（CsCl）和蔗糖等。但每種密度梯度介質(zhì)對病毒粒子的完整性和感染性都有不同的影響，因此根據(jù)實驗的需求選擇合適的密度梯度介質(zhì)至關(guān)重要［5］。

1.2" 過濾

過濾是一種去除背景雜質(zhì)最常見的方法。利用0.22 μm或0.45 μm孔徑的濾器均可去除樣本中99.5%以上的宿主細胞和細菌，從而富集病毒顆粒，提高病毒的檢出率。但有研究表明，濾器的材質(zhì)和孔徑大小均會影響病毒的富集效果［6］，因此在實際應(yīng)用過程中需要選擇適宜的濾器對樣本進行過濾。

1.3" 核酸酶處理

離心和過濾可以去除樣品中大部分的雜質(zhì)、細胞和細菌碎片，但處理后的濾液仍然存在大量的背景核酸，嚴重浪費了測序和分析成本，也干擾了病原體的篩查。根據(jù)病毒衣殼蛋白具有耐受核酸酶的特性，可利用DNase I和RNase A分別降解濾液中游離的宿主DNA（genome DNA，gDNA）和核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA），提高病毒核酸的占比。這種方法能夠提高病毒檢測的靈敏度，使數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性降低［7］，并且有助于區(qū)分包膜病毒顆粒與非傳染性裸病毒［8］。

2" 應(yīng)用于新發(fā)病毒檢測的分子生物學(xué)方法

新發(fā)病毒的檢測到目前為止仍然是病毒學(xué)診斷中最具挑戰(zhàn)性的問題之一。當(dāng)臨床樣本中存在已知病毒，通常會利用已知病毒序列來設(shè)計特定的PCR引物，并使用特定檢測方法。然而，新發(fā)病毒卻缺乏有效的病原分析鑒定方法，因此需要不斷改進病毒檢測方法，放大病毒基因組本身，通過病毒序列解析其感染及傳播特征，控制病毒的傳播，為疫情防控爭取寶貴時間。下面總結(jié)了近年來主要用于新發(fā)病毒檢測的分子生物學(xué)方法的優(yōu)缺點及應(yīng)用，為新發(fā)病毒的鑒定明確方向（表1）。

2.1" 變性寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucleotide primed PCR， DOP-PCR）

DOP-PCR（也稱簡并引物PCR）由Telenius等［9］于1992年建立，其引物序列為5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′。DOP-PCR擴增程序包含兩個PCR過程：（1）在低退火溫度下使引物的3′末端序列及中間的隨機六堿基序列與DNA模板結(jié)合進行第一次PCR擴增；（2）將第一次的PCR產(chǎn)物在較高的退火溫度下使用相同的引物進行第二次PCR擴增，使整個基因組DNA按照比例被均勻擴增（圖1）。

DOP-PCR最早被應(yīng)用于基因組圖譜研究［10］。2008年，Nanda等［11］的研究證明使用3′端包含6個核苷酸的錨定序列一般無法高效擴增病毒基因組，因此將其優(yōu)化為適用于病毒基因組擴增的具有較短3′端的錨定序列。多項研究證實DOP-PCR可直接鑒定臨床樣品［12-13］和細胞［14］中的未知DNA或RNA病毒序列，如Arthur等［15］對于博卡病毒（human Boca virus， HBoV）新亞型HBoV-3（human Boca virus 3， HBoV-3）的發(fā)現(xiàn)以及Uhlenhaut等［13］在臨床樣品中檢測到人偏肺病毒（human metapneumo virus， HMPV）都是使用了該方法。

DOP-PCR具有快速、高效的DNA擴增特點，只要有足夠的起始基因組DNA，就能對基因組中所有序列進行數(shù)百倍的擴增，并且可操作性較強、耗時短、費用低。但存在擴增產(chǎn)物的平均長度較短，基因組覆蓋率低的問題。這是由于PCR指數(shù)擴增的特性，不同序列間擴增子任何微小的差異都會被指數(shù)放大，導(dǎo)致基因組中出現(xiàn)過度擴增區(qū)和擴增不足區(qū)。因此，DOP-PCR在應(yīng)用上受到了限制［16］。

2.2" 滾環(huán)復(fù)制技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）

20世紀90年代中期，RCA作為自然滾環(huán)復(fù)制的簡化衍生技術(shù)被用于檢測基因組序列或轉(zhuǎn)錄本［17-18］。這項技術(shù)依據(jù)某些病原體用于復(fù)制其環(huán)狀DNA分子的滾環(huán)式復(fù)制機制，利用抗外切酶活性的隨機六聚體引物來進行擴增，可用于新發(fā)病毒的檢測。經(jīng)典的RCA由環(huán)狀DNA模板、DNA聚合酶（例如φ29 DNA聚合酶）、單鏈引物以及脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）組成［19-20］。其擴增形式可分為線性擴增RCA、指數(shù)擴增RCA和多引物擴增RCA（圖2）。

線性擴增RCA是指在DNA聚合酶的作用下，由單一引物沿環(huán)狀DNA模板延伸，產(chǎn)生與模板鏈互補的串聯(lián)重復(fù)序列的線性單鏈DNA（single stranded DNA，ssDNA）［21］，其擴增效率可達到105倍。Lizardi等［22］建立的指數(shù)擴增RCA是在線性擴增RCA的基礎(chǔ)上，增加一條與線性RCA產(chǎn)物序列部分互補的引物進行擴增，新合成的擴增產(chǎn)物又可以作為第一條引物的模板，如此反復(fù)，使擴增產(chǎn)物出現(xiàn)指數(shù)增長［21］，其擴增效率可達到109倍。為了在更短時間內(nèi)擴增大量的DNA，Dean等［23］建立了多引物擴增RCA。該方法在原理上與線性擴增RCA相同，不同的是利用多條引物與環(huán)狀模板結(jié)合，并在φ29 DNA聚合酶的作用下進行鏈的延伸，上游引物延伸到下游引物的結(jié)合點并置換下游引物，可在短時間內(nèi)獲得大量的DNA產(chǎn)物，提高了模板利用率及擴增效率。

目前RCA已被用于發(fā)現(xiàn)幾種具有環(huán)狀DNA基因組的新型病毒，例如，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）［24］、細環(huán)病毒（torque teno virus，TTV）［25］及新型牛乳頭瘤病毒（bovine papilloma virus，BPV）［26］。

2.3" 多重置換擴增技術(shù)（multiple displacement amplification，MDA）

MDA由Dean等［27］在2002年建立，是一種基于φ29 DNA聚合酶和隨機引物，以線狀DNA為模板在等溫條件下擴增全基因組的技術(shù)。其基本過程：（1）隨機引物在多個位點與基因組模板退火，其后φ29 DNA聚合酶在多位點同時啟動復(fù)制，沿DNA模板合成新的DNA鏈；（2）用合成的新鏈置換出模板鏈的互補鏈使之成為新的模板鏈來進行擴增，形成級聯(lián)分支放大系統(tǒng)，從而獲得足量的DNA［28］（圖3）。

MDA最初被應(yīng)用于單細胞及細菌的全基因組測序。近年來，由于其操作簡單、產(chǎn)物質(zhì)量穩(wěn)定、擴增的特異性高和基因組覆蓋率高的特點，越來越多的研究利用其檢測未知病毒［29-31］。雖然在臨床樣本中MDA能夠捕獲較多DNA病毒，并且在低病毒載量的條件下高度覆蓋某些病毒的基因組［32］，但MDA與DOP-PCR一樣，是一個指數(shù)擴增過程，這會導(dǎo)致序列依賴性偏差［33］，并且MDA的偏差在高倍數(shù)擴增的反應(yīng)中更為明顯［34］。后來有研究人員將MDA與微流控技術(shù)相結(jié)合［35］或利用DNA引物酶合成的小寡核苷酸取代隨機六聚體引物［36-37］來解決這一問題。

2.4" 代表性差異分析（representational difference analysis，RDA）

RDA是20世紀90年代由Lisitsyn等［38］建立的一種非序列依賴性PCR擴增與消減雜交相結(jié)合的技術(shù)，最初被用于比較兩種細胞基因組。此后，Hubank和Schatz［39］將構(gòu)建cDNA文庫和消減雜交法融合在一起，創(chuàng)建了cDNA RDA并將其成功應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的基因克隆。

cDNA RDA的基本過程：（1）將試驗組（Tester）和對照組（Driver）的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；（2）利用識別4個堿基的內(nèi)切酶來切割兩個基因組的cDNA，分別連接12/24寡聚核苷酸接頭（由一個12寡聚核苷酸和一個24寡聚核苷酸組成），12寡聚核苷酸在72℃解鏈后，利用聚合酶補平末端并用相應(yīng)的24寡聚核苷酸引物進行第一輪PCR擴增，將大小不等的DNA片段分離純化；（3）隨后將接頭切除，只在Tester的DNA片段末端連接新接頭并與過量的Driver DNA混合雜交，產(chǎn)生Tester/Tester、Driver/Tester和Driver/Driver這三種雙鏈DNA；（4）利用新接頭引物進行第二輪PCR擴增。Tester/Driver雜交體只能被線性擴增，產(chǎn)物為單鏈DNA；Driver/Driver雜交體不能進行PCR擴增；只有Tester/Tester雜交體能夠以指數(shù)形式擴增，得到雙鏈DNA；（5）雜交過程重復(fù)2～3次后，將擴增產(chǎn)物分離、克隆并測序［40］（圖4）。

RDA技術(shù)可通過消減雜交使靶序列被百萬倍富集，具有較高的靈敏度，同時不依賴于序列特異性擴增，并且無需文庫篩選。目前利用此技術(shù)發(fā)現(xiàn)了多種病毒，如1995年鑒定出了GBV（GB virus，GBV）的A型病毒（GBV-A）和B型病毒（GBV-B）［41］；1997年，Nishizawa等［42］在肝炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)了TTV。但其不足之處在于：操作過程相對繁瑣復(fù)雜，實驗周期長，非差異表達基因的擴增產(chǎn)物難以避免，而且會出現(xiàn)假陽性結(jié)果［43］，因此在新發(fā)病毒檢測領(lǐng)域的應(yīng)用受到了限制。

2.5" 序列非依賴的單引物擴增（sequence independent single primer amplification，SISPA）

SISPA技術(shù)是單引物擴增法中最常用的一種，既不依賴組織培養(yǎng)，也不依賴于核酸序列信息，常常被用于從臨床樣本中鑒定低濃度的未知病毒序列［44-45］。其基本過程：（1）將平末端的接頭連接至cDNA的平端，或是通過對提取的模板進行酶切產(chǎn)生黏性末端，連接黏性末端接頭；（2）用單引物進行擴增，然后對擴增產(chǎn)物進行克隆、測序、序列分析，最終確定病原（圖5）。

SISPA技術(shù)最早可追溯至1989年，最初的目的是從極低量的mRNA模板中生成代表性cDNA文庫。Reyes和Kim［46］于1991年完善了該技術(shù)，并以丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）為例進行了驗證。雖然SISPA最初應(yīng)用于RNA病毒的檢測，但隨著SISPA技術(shù)不斷的發(fā)展和改進，逐漸呈現(xiàn)了更多衍生方法，主要是對引物加以修飾，包含引入酶切位點、單鏈接頭等。目前該技術(shù)不僅能夠捕獲RNA病毒，還能檢測DNA病毒。

但與MDA相比，SISPA對于獲取病毒基因組全長以及探查病毒豐度具有一定的局限性，這可能與序列的隨機擴增有關(guān)［32］。若樣品中存在較多外源基因的干擾可能會導(dǎo)致非病毒核酸序列的過度擴增，因此樣品的前處理至關(guān)重要。Allander等［44］在原有的基礎(chǔ)上建立了DNase-SISPA技術(shù)，該技術(shù)首先對樣品進行DNase處理，再利用限制性核酸內(nèi)切酶對模板DNA進行切割，隨后利用SISPA技術(shù)成功從血清中鑒定出兩種牛細小病毒。隨后Djikeng等［47］又將RNase A處理添加至SISPA技術(shù)中，以減少外源RNA的污染，進一步提高了未知病毒核酸的檢出率。另外，針對SISPA技術(shù)檢測血漿樣本中的病毒序列靈敏度低的這一問題，Biagini等［48］將RCA與SISPA技術(shù)相結(jié)合，成功從人的血漿樣本和貓的唾液樣本中鑒定出環(huán)狀病毒。

2.6" cDNA 擴增片段長度多態(tài)性（virus discovery cDNA-amplified fragment length polymorphism，VIDISCA）技術(shù)

VIDISCA是一種基于SISPA的技術(shù)，由Hoek等［49］在2004年建立并用該技術(shù)從臨床樣本中鑒定出了新型冠狀病毒。其過程：（1）在核酸提取之前，通過DNase處理樣本以降解宿主基因組DNA；（2）利用兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶對DNA進行切割，然后與相應(yīng)的2套接頭連接；（3）用套式PCR擴增，第一輪擴增用與接頭相對應(yīng)的上、下引物，第二輪使用與第一輪相同的引物，但在兩條引物的3′末端分別延伸一個核苷酸（圖6）。由于延伸的堿基種類有4種（A、T、G或C），因此該方法提供了16種可能的引物組合［50］。VIDISCA可以檢測RNA病毒，最低檢測限值為106拷貝·mL-1；也可以檢測DNA病毒，最低檢測限值為105拷貝·mL-1 ［51］。VIDISCA檢測病毒樣本的靈敏度遠遠大于SISPA。Tan等［52］對上述方法做了進一步優(yōu)化，將隨機引物PCR與VIDISCA聯(lián)用，進一步提高了其靈敏度，更有利于在臨床上的應(yīng)用。

近年來，研究人員利用VIDISCA在人類和動物的臨床樣本中發(fā)現(xiàn)了幾種新病毒，其中包括1例重度腦病患兒腦脊液中的Ntwetwe病毒［53］、1例點頭綜合征患者血漿中的蒙德里病毒（Mundri virus，MUNV）［54］、蝙蝠血液中的兩種新型細小病毒［55］以及野生狐猴血清中的黃病毒［56］。

2.7" 隨機引物PCR技術(shù)（arbitrary-primer PCR，AP-PCR）

隨機引物PCR又稱隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polimophic DNA，RAPD），最初

由Welsh和Mcclelland［57］以及Williams等［58］于1990年建立，是利用隨機引物擴增未知DNA序列的技術(shù)。隨機引物PCR和一般PCR的反應(yīng)原理基本相同，但與一般PCR最大的不同是該技術(shù)所用的引物通常由5～10個堿基的隨機核苷酸組成，并且擴增產(chǎn)物是大小不一的核苷酸片段，而并非特異的目的片段。

由于隨機引物PCR易受外界因素的影響，因此研究人員對上述方法進行了改進，建立了錨定隨機引物PCR技術(shù)（tagged random primer PCR，T-PCR）。其引物由3′端的隨機序列及5′端的特異序列構(gòu)成。錨定隨機引物PCR包含兩個PCR過程：（1）利用3′端的隨機序列與目的DNA序列互補，再利用DNA聚合酶將5′端的特異序列摻入其中，作為下一輪PCR擴增的模板；（2）用5′端特異序列作為第二輪PCR擴增的引物進行擴增（圖7）。Allander等［59-60］利用該技術(shù)鑒定出了HBoV以及新的多瘤病毒（polyoma viruses，PyV）；Fouchier等［61］于2004年發(fā)現(xiàn)了新型的冠狀病毒（human corona virus， HCoV）。

為了提高錨定隨機引物PCR獲取未知病毒核酸序列的效率，Stang等［62］對錨定隨機引物PCR技術(shù)進行了優(yōu)化。首先對樣品進行過濾、密度梯度離心和DNase處理后，富集病毒核酸，再利用簡并3′端的引物擴增富集的病毒核酸，并對隨機擴增的PCR產(chǎn)物進行克隆和測序。該技術(shù)成功擴增出了腸道病毒和腺病毒序列，并且意外地在慢性疲勞綜合征病人的漱口液中檢測出了單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus 1，HSV-1），表明隨機引物PCR技術(shù)可以用于檢測RNA和DNA病毒。

2.8" 構(gòu)建cDNA 文庫

構(gòu)建cDNA文庫是發(fā)現(xiàn)新基因和測定基因序列的重要方法之一。其主要流程：將生物體在特定階段所轉(zhuǎn)錄的mRNA全部經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種合適的載體連接而形成重組DNA克隆的集合（圖8），該集合包括了特定生物或組織在特定時期所有可能表達的遺傳信息。該方法應(yīng)用于未知病原檢測的典型例子是1989年Choo等［63］根據(jù)NANBH（Non-A， Non-B hepatitis）患者血清中構(gòu)建的隨機引物的cDNA文庫鑒定出了HCV。由于該方法耗時長且陽性率低，目前已逐步退出未知病毒檢測領(lǐng)域，但在研究功能基因組學(xué)方面仍具有巨大的優(yōu)勢。

3" 應(yīng)用于新發(fā)病毒檢測的新型測序技術(shù)

以上幾種應(yīng)用于新發(fā)病毒檢測的分子生物學(xué)方法所獲得的終產(chǎn)物都需要通過測序技術(shù)來進行最后的分析和確認。近年來，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，下一代測序技術(shù)（NGS）突破了雙脫氧鏈末端終止法（Sanger測序法）測序的瓶頸，并被進一步分為第二和第三代測序技術(shù)，使一次性檢測大量的序列成為可能，由此開啟新發(fā)病毒檢測技術(shù)的新篇章。

3.1" 直接應(yīng)用于新發(fā)病毒檢測的新型測序技術(shù)

20世紀70年代至今，測序技術(shù)經(jīng)歷了以Sanger測序法為代表的一代測序技術(shù)、Illumina為代表的二代測序技術(shù)和納米孔測序為代表的三代測序技術(shù)的發(fā)展。

第一代測序技術(shù)為早期一些物種的全基因組測序計劃作出了重大貢獻，但是該方法通量低，成本高，耗時長，已經(jīng)無法滿足快速檢測病原體的需求。直到21世紀，測序技術(shù)發(fā)生了根本性變革。二代和三代測序技術(shù)的出現(xiàn)極大地開拓了病毒宏基因組學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域，可直接對臨床樣本進行測序，縮短測序周期。目前這兩種測序方法已在基因測序領(lǐng)域已經(jīng)占據(jù)了主導(dǎo)地位，在未知病原體發(fā)現(xiàn)的方面也具有不可替代的優(yōu)勢［64］。

3.1.1" 第二代測序技術(shù)直接應(yīng)用于新發(fā)病毒的檢測

21世紀初，454 Life Sciences公司開發(fā)了第一個基于DNA焦磷酸測序的第二代測序平臺，標志著高通量測序技術(shù)的誕生。該技術(shù)的基本原理是：（1）引物與模板DNA退火；（2）在四種酶（DNA聚合酶、熒光素酶、ATP硫酸化酶和雙磷酸酶）協(xié)同催化的作用下，將引物上每一個脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來；（3）通過檢測化學(xué)發(fā)光信號釋放的有無和強度，達到實時測定DNA序列的目的。這一測序技術(shù)實現(xiàn)了對數(shù)百萬個DNA分子同時測序，并可深入對一個物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組進行整體分析［65］。自454測序平臺建立以來，高通量測序技術(shù)進入了飛速發(fā)展的時期，多家公司接連推出了不同的測序平臺。2007年Illumina公司收購Solexa公司后便進入基因組測序平臺研發(fā)制造領(lǐng)域，逐步推出以可逆鏈終止物和合成測序法為基礎(chǔ)的MiSeq、Hiseq和NovaSeq 6000等測序平臺，降低了測序成本，應(yīng)用靈活度更高，并且這些測序平臺之間具有高度互補性及交叉性，使其在高通量測序領(lǐng)域占有絕對的優(yōu)勢［66］。Thermo Fisher公司推出的Ion Torrent系列測序平臺是利用半導(dǎo)體芯片直接測定DNA聚合反應(yīng)產(chǎn)生的氫離子引起的pH值變化，從而讀取出待測片段的序列［67］，使測序變得更簡單、快速、經(jīng)濟高效。2014年起華大智造公司自主研發(fā)的BGISEQ系列和MGISEQ系列［68］的測序平臺以聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)及改進的DNA納米球技術(shù)為核心技術(shù)支撐，能夠在更短的時間內(nèi)完成完整的測序流程，并且確保測序結(jié)果的準確性。研究人員對比發(fā)現(xiàn)MGISEQ-2000與Illumina公司的NovaSeq 6000在片段大小的分布、基因覆蓋率等方面高度相似，這說明華大智造的測序平臺在基因測序領(lǐng)域已占有一席之地［69］。目前以上三種測序平臺占據(jù)了市場的主導(dǎo)地位，而由ABI公司推出的Solid測序平臺因其無法突破技術(shù)瓶頸已經(jīng)退出了主流市場［70］。

與一代測序相比，二代測序平臺普遍具有準確率高（原始序列測序準確率可達到99.9％），通量高，靈敏度高，運行成本低，最重要的是無需提前了解病原體信息的特點，使未知病毒測序的研究得以發(fā)展，可普遍用于分析和鑒定動物血液、糞便、組織和呼吸道分泌物等樣本中的病毒基因序列。如Towner等［71］利用此技術(shù)在來自烏干達的臨床血液樣本中發(fā)現(xiàn)一種新型的埃博拉病毒（Ebola virus，EBoV）；2011年，Hoffmann等［72］從患病的動物血樣中鑒定出了一種新型病毒，并將其命名為施馬倫貝格病毒（Schmallenberg virus，SBV）；2015年，Stremlau等［73］在西非尼日利亞的健康人群中發(fā)現(xiàn)了一種高度分化的新型的彈狀病毒，并將該病毒命名為庫波熱病毒（Ekpoma virus，EKV）。這些研究進一步證明高通量測序技術(shù)可應(yīng)用于新型未知病毒的挖掘。雖然二代測序技術(shù)擁有種種優(yōu)點，但是其讀長太短，需要通過生物信息學(xué)對海量的數(shù)據(jù)進行分析并組裝序列，那么如何高效地分析和利用數(shù)據(jù)也是一種挑戰(zhàn)。在此背景下，讀長較長的三代測序技術(shù)應(yīng)運而生。

3.1.2" 第三代測序技術(shù)直接應(yīng)用于新發(fā)病毒的檢測

2014年由牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）開發(fā)的納米孔測序技術(shù)是基因工程技術(shù)與計算機輔助技術(shù)的結(jié)合［74］。其基本原理是利用電信號進行序列測定。納米孔測序設(shè)備的核心是鑲嵌在聚合物薄膜的蛋白質(zhì)納米孔，該薄膜被浸沒在電解質(zhì)溶液中，通過在薄膜兩側(cè)加以適當(dāng)電壓，使離子能夠通過納米孔以形成電位差，從而產(chǎn)生恒定的電流。當(dāng)DNA單鏈穿過納米孔時，每個DNA堿基的獨特空間構(gòu)象都會產(chǎn)生不同的離子流波動，通過分析離子流波動的數(shù)值讀取出堿基的序列。該技術(shù)無需PCR擴增，降低了擴增引入的錯誤，使檢測的準確率能夠達到92%～98%［75］。ONT公司推出的便攜式測序儀MinION體積比手機更小，通過USB接口與計算機連接即可實現(xiàn)序列的實時測序，目前該測序儀已成功應(yīng)用于臨床檢測。

2019年，在內(nèi)蒙古阿爾山地區(qū)突發(fā)的一起散養(yǎng)野豬不明原因疫情中，閆曉敏等［76］采用納米孔測序技術(shù)在獲得樣品后2.5 h左右便檢測出了非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的特異性序列，迅速鎖定此次疫情是由ASFV導(dǎo)致，從而確定感染的源頭，有效地控制疫情蔓延。

除了在動物疫病檢測中的應(yīng)用外，在2019年12月全球暴發(fā)的新型冠狀病毒的肺炎疫情中也應(yīng)用了納米孔測序技術(shù)。Zhu等［77］利用Illumina測序技術(shù)和納米孔測序技術(shù)對不明原因肺炎患者的支氣管肺泡灌洗液中的病毒基因組進行測序與分析，確認為新發(fā)現(xiàn)的病原體，即SARS-CoV-2。而與一代測序技術(shù)和二代測序技術(shù)相比，納米孔測序技術(shù)以其長讀長、設(shè)備便于攜帶、可實時訪問測序數(shù)據(jù)等優(yōu)點，成為了眾多研究人員用來探索和檢測新型冠狀病毒的首選［78-80］。此外，ARTIC network于2020年2月發(fā)布了首個通過納米孔測序技術(shù)檢測SARS-CoV-2基因組序列的快速測序方案，包含引物設(shè)計、實驗方案、生信學(xué)教程和數(shù)據(jù)庫，僅8 h即可完成病毒基因組的鑒定。目前，納米孔測序技術(shù)已成功應(yīng)用于寨卡病毒（Zika virus）［81］、EBoV［82］和猴痘病毒（monkey pox virus，MPXV）［83］等新發(fā)、突發(fā)疾病病原體的實時分析，可監(jiān)測流行病學(xué)信息、識別病毒突變類型等，進一步證實了納米孔測序技術(shù)能夠快速地了解新發(fā)病毒的來源、變異演化、傳播鏈條、傳播規(guī)律，真正意義上實現(xiàn)實時快速測序。

雖然納米孔測序技術(shù)已成功應(yīng)用于新發(fā)病原的檢測及分子溯源等方面，但是必須承認，在實際應(yīng)用中還存在一些未突破的技術(shù)瓶頸。首先，納米孔測序技術(shù)是以化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電信號為基礎(chǔ)，在測序過程中，單個核苷酸通過納米孔的速度過快以及納米孔的脂質(zhì)雙分子層不穩(wěn)定，都是導(dǎo)致納米孔測序技術(shù)準確率低的原因，這也是最突出的問題［84］；其次，納米孔測序技術(shù)建庫時對樣本中病毒核酸含量要求較高。盡管研究人員對臨床樣本的前處理和病毒粒子的富集已經(jīng)進行了多方面的優(yōu)化，但由于臨床樣本成分復(fù)雜，前處理后的宿主核酸占比仍舊很高，病毒基因組被覆蓋，出現(xiàn)納米孔測序無法檢測出樣本中低拷貝數(shù)病毒的情況，這在一定程度上限制了其應(yīng)用。但值得期待的是，納米孔測序技術(shù)作為新一代測序技術(shù)，其測序平臺還在不斷更新中，相信終將突破技術(shù)瓶頸，達到測序通量、測序速度與測序準確度的全面提升，拓寬其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用，為病原微生物鑒定的發(fā)展提供更大的推進力。

3.2" 新型測序技術(shù)與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)用

新型測序技術(shù)擁有種種優(yōu)點，但復(fù)雜的生物信息學(xué)分析方法限制了其在新發(fā)病毒檢測上的應(yīng)用。同時，大多數(shù)臨床樣本中病毒核酸濃度一般較低，難以達到測序的建庫要求，需要經(jīng)過非特異性擴增，再將擴增后的產(chǎn)物與二代或三代測序技術(shù)進行聯(lián)用，提高臨床樣本中病原體的檢出率。

為了降低納米孔測序技術(shù)的單堿基錯誤率，Gallardo等［85］將RCA與其結(jié)合，發(fā)現(xiàn)RCA可以通過延長短序列來提高納米孔測序從臨床樣本中檢測RNA病毒基因組的準確率。2021年Sarchese等［86］采用基于SISPA的納米孔測序技術(shù)，從1只死亡野狼的糞便樣本中檢測出了1株基因3型戊型肝炎病毒（hepatitis E virus 3，HEV-3）的全基因組。截至目前，已有多項研究將SISPA或VIDISCA與NGS相結(jié)合并從臨床樣本中鑒定出了克里米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus， CCHFV）［87］、1型犬腺病毒（canineadeno virus 1，CAV-1）［88］、犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）［89］、腸道病毒［90］、非洲馬瘟病毒（African horse sickness virus，AHSV）［91］等。這表明多種檢測方法的聯(lián)用在不明原因疫情處置中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為疫情溯源提供參考。

4" 問題與展望

臨床樣本中感染性病原體的快速檢測和鑒定至關(guān)重要。傳統(tǒng)的病原微生物檢測方法在準確性、時效性等方面存在較多局限，目前已經(jīng)無法滿足病原體快速檢測的需要。而本文介紹的新發(fā)病毒檢測方法可不依賴于病毒的核酸序列，直接對臨床樣本進行檢測，并且能迅速縮小病原范圍，為快速確診新發(fā)疫病病原提供參考。

但單一的新發(fā)病毒檢測方法有各自的局限性和適用范圍，因此在實際應(yīng)用中，恰當(dāng)?shù)穆?lián)合檢測是重要的發(fā)展趨勢，并且有利于在短時間內(nèi)分析未知病毒的感染及傳播特征。相信隨著生物檢測技術(shù)研究的不斷發(fā)展，這些技術(shù)的成熟必將成為新發(fā)病毒快速檢測的新途徑、新方法。

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（編輯" 白永平）