摘" 要： 西尼羅熱（West Nile fever，WNF）是由西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）感染引起的一種人獸共患病，主要通過蚊子叮咬傳播，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、皮疹和淋巴結(jié)腫大等為主，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生腦炎癥狀，人類對(duì)其高度易感且致死率較高。對(duì)于WNF的防控目前尚無可用疫苗和特效治療藥物。及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷，對(duì)治療和防止疫情的快速傳播具有極重要的意義。本文對(duì)當(dāng)前WNV檢測(cè)技術(shù)的最新成果、診斷方法發(fā)展方向進(jìn)行了概述，其中病原學(xué)診斷技術(shù)主要包括病毒分離、RT-PCR、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，血清學(xué)診斷包括ELISA、免疫熒光法和免疫組織化學(xué)技術(shù)等，近年來基于高通量測(cè)序的宏基因組技術(shù)也成功應(yīng)用于WNF的診斷與研究，新技術(shù)的創(chuàng)新及其在疫病檢測(cè)上的應(yīng)用將極大地促進(jìn)WNF的檢測(cè)和防控技術(shù)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞： 西尼羅熱；西尼羅病毒；診斷技術(shù)

中圖分類號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5423-08

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.009

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2023-11-07

基金項(xiàng)目：重大外來動(dòng)物疫病阻斷與防控技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目（2022YFD1800500）

作者簡(jiǎn)介：周師眾（1999-），男，湖南人，碩士生，主要從事布魯氏菌耐藥性及其生物信息學(xué)研究，E-mail： aa1245846152@163.com

*通信作者：沈青春，主要從事動(dòng)物支原體、布魯氏菌病防控及其生物信息學(xué)研究，E-mail： shenqingchun@caas.cn

Diagnostic Technology of West Nile Fever

ZHOU" Shizhong， QIAN" Jiahao， ZHANG" Boyuan， LIU" Dan， GAO" Jianshuai， DING" Jiabo， QIN" Tong， SHEN" Qingchun*

（Key Laboratory of Animal Biosafety Risk Prevention and Control （North） of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Sciences of CAAS， Beijing 100193，" China）

Abstract： West Nile fever （WNF） is an infectious zoonotic ailment engendered by the West Nile virus（WNV）， predominantly disseminated via mosquito bites. The clinical presentation of this malady includes symptoms like fever， rash， and lymphadenopathy， with a potential to affect the central nervous system， leading to encephalitic manifestations. Humans demonstrate considerable vulnerability and a relatively elevated mortality rate associated with this disease. Presently， the absence of efficacious vaccines or specific therapeutic agents for WNF necessitates the importance of prompt， accurate， and timely diagnostic procedures for effective patient management and curtailing the swift spread of epidemics. This review delineates the recent advancements WNV detection technologies and the evolving landscape of diagnostic methodologies. Principal etiological diagnostic approaches comprise virus isolation， RT-PCR， and isothermal amplification， whereas serological diagnostics include techniques like ELISA， immunofluorescence， and immunohistochemistry. Additionally， the advent of metagenomics， underpinned by high-throughput sequencing， has been effectively utilized in the diagnosis and exploration of WNF in recent years. The ongoing innovation in novel technologies and their integration into disease detection are pivotal in augmenting the progression of WNF detection and preventive strategies.

Key words： West Nile fever; West Nile virus; diagnostic technology

*Corresponding author： SHEN Qingchun，E-mail： shenqingchun@caas.cn

西尼羅熱（West Nile fever，WNF）是一種由西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）引起的人畜共患病。WNV最初于1937年在烏干達(dá)西尼羅地區(qū)一名發(fā)熱女性患者的血液中被分離獲得，因而得名。該病毒主要通過蚊子傳播，尤其是伊蚊和庫蚊，主要感染鳥類、人類及馬、牛等哺乳動(dòng)物，鳥類是其主要儲(chǔ)存宿主。在宿主體內(nèi)，WNV能復(fù)制并產(chǎn)生病毒血癥，可能導(dǎo)致人類和馬出現(xiàn)致命的腦炎，以及雞和野生鳥類的死亡［1］。人類通常通過被攜帶病毒的蚊蟲叮咬而感染，臨床癥狀主要包括高熱、頭痛、肌肉疼痛、皮疹和淋巴結(jié)腫大等。該病毒可侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)腦膜炎癥狀。一旦出現(xiàn)并發(fā)的神經(jīng)性癥狀，其致死率和致殘率較高。研究表明，免疫系統(tǒng)的過度激活可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷，進(jìn)而加重WNV感染的嚴(yán)重程度［2］。

1" 西尼羅病毒概況

WNV為黃病毒科黃病毒屬的成員，根據(jù)遺傳學(xué)特性，可分為至少5個(gè)不同的譜系，即譜系1～譜系5，其中譜系1和譜系2與人類西尼羅熱相關(guān)。1937年首次被發(fā)現(xiàn)的WNV以及其后在全球部分地區(qū)傳播的毒株（如NY99、Israel 1998、Morocco 2003等）屬于譜系1；譜系2最早在非洲發(fā)現(xiàn)，21世紀(jì)初出現(xiàn)在中歐和東歐地區(qū)的毒株（如Kunjin、Hungary 2004、Greece 2010等）也屬于譜系2。

WNV直徑約50 nm，外殼為被脂質(zhì)包膜包圍的二十面體核衣殼［3］，其結(jié)構(gòu)示意圖和基因組結(jié)構(gòu)圖見圖1［4］。該病毒基因組為長(zhǎng)度11 kb左右的單鏈RNA，5′端為Ｉ型帽結(jié)構(gòu)（m7GpppAmp），3′端沒有ployA尾巴［5］。病毒RNA可以被翻譯成多個(gè)蛋白，被細(xì)胞和病毒蛋白酶切割成3種結(jié)構(gòu)蛋白（C蛋白、E蛋白和prM蛋白）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5蛋白）［6］，C蛋白是構(gòu)成病毒衣殼的主要成分［7］；E蛋白是與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的主要表面蛋白；prM蛋白促進(jìn)病毒顆粒形成和從宿主細(xì)胞釋放，保護(hù)E蛋白不被宿主細(xì)胞識(shí)別［8］；NS1蛋白參與病毒復(fù)制與免疫逃逸［9］；在同為黃病毒屬的登革熱病毒中，NS2A蛋白和NS2B蛋白被證明通過形成膜通道來滲透不同的膜模型，以及通過自寡聚參與一系列病毒功能［10］；NS3蛋白是病毒復(fù)制和組裝的關(guān)鍵酶，具有蛋白酶和核酸酶活性［11］；NS4A、NS4B蛋白功能尚不完全明確；NS5是黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中最保守的蛋白，負(fù)責(zé)病毒基因組的蓋帽、甲基化和復(fù)制［12-14］。其中，E蛋白［15］和NS1蛋白［16］具有良好的免疫原性，是血清學(xué)檢測(cè)方法的重要靶點(diǎn)，這兩個(gè)蛋白基因的保守序列及WNV基因組的非翻譯區(qū)保守基因序列也常被用于核酸檢測(cè)的靶標(biāo)序列。

WNV在全球范圍內(nèi)廣泛分布，近年來在歐洲、非洲、東地中海、北美和西亞地區(qū)的傳播尤為活躍，且在歐洲顯示出頻發(fā)趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自2019年起，希臘共診斷出35例西尼羅病毒感染病例，患者年齡在52至91歲之間。2022年，歐盟共報(bào)告了1 133個(gè)西尼羅河感染病例（其中92例死亡），涉及11個(gè)歐洲國(guó)家。意大利報(bào)告的病例最多（感染723例，死亡51例），其次為希臘（感染286例）。2023年7月，歐洲4個(gè)國(guó)家再次報(bào)告了41例感染病例，死亡3例，其中包括意大利（26例，死亡1例）、希臘（11例，死亡2例）、法國(guó)（3例）和匈牙利（1例）［17-19］。同時(shí)，西班牙和德國(guó)也報(bào)告了動(dòng)物（馬和鳥類）的疫情，盡管未發(fā)現(xiàn)人類感染病例。

目前，尚無特定的抗病毒藥物可用于治療WNV感染，針對(duì)人類的疫苗也尚未上市。一種基于植物提取物的候選疫苗正在研發(fā)中［2］。

2" 診斷技術(shù)

國(guó)際上對(duì)西尼羅河熱的防控是以大規(guī)模監(jiān)測(cè)和預(yù)防為主，主要防控措施包括防蚊措施推廣、風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域的人員與動(dòng)物的監(jiān)測(cè)以及對(duì)疑似或確診病例進(jìn)行隔離治療等。西尼羅河熱的檢測(cè)技術(shù)可分為病原學(xué)診斷技術(shù)、血清學(xué)診斷技術(shù)及其他新型診斷技術(shù)。

2.1" 病原分離鑒定

病毒分離是病毒學(xué)研究的基礎(chǔ)，主要目的是從臨床樣本中分離出病原體，并通過對(duì)病原體的鑒定和分析，了解其基本特征和生物學(xué)特性。常用細(xì)胞培養(yǎng)法分離西尼羅病毒，即取腦組織（尤其是后腦和髓質(zhì)）、脊髓或感染早期血清接種于RK-13細(xì)胞、Vero細(xì)胞或BHK21細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞病變情況。病毒的鑒定和定型通常采取中和試驗(yàn)（neutralization test）進(jìn)行，主要包括蝕斑減少中和試驗(yàn)

（plaque reduction neutralization test，PRNT）、微量中和試驗(yàn)（micro-neutralization test，MNT）、病毒中和試驗(yàn)（virus neutralization test，VNT），其中PRNT被認(rèn)為是定量和定性檢測(cè)抗黃病毒中和抗體或黃病毒科的病毒鑒定與定性的金標(biāo)準(zhǔn)［20-21］。

西尼羅病毒分離培養(yǎng)鑒定所需的時(shí)間長(zhǎng)（約6 d），操作復(fù)雜，對(duì)樣品質(zhì)量要求高，并且必須在生物安全Ⅲ級(jí)及以上的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作。

2.2" 核酸檢測(cè)技術(shù)

2.2.1" RT-PCR技術(shù)

RT-PCR技術(shù)可通過特異性地?cái)U(kuò)增西尼羅病毒特征序列實(shí)現(xiàn)對(duì)微量的病毒RNA監(jiān)測(cè)，具有良好的特異性和敏感性，也可方便檢測(cè)出早期感染者。當(dāng)前廣泛應(yīng)用于臨床的檢測(cè)方法主要包括兩種，即巢式RT-PCR和熒光定量RT-PCR。

巢式RT-PCR，又稱為嵌套式RT-PCR，比常規(guī)RT-PCR的敏感度高十倍以上，可以靈敏地檢測(cè)出組織病料中的微量RNA。Zaayman等［22］開發(fā)的巢式RT-PCR可以檢測(cè)出WNV譜系1a、1b和2，同時(shí)在特異性和敏感性方面表現(xiàn)俱佳。

熒光定量RT-PCR，相較于巢式RT-PCR，具有更快的檢測(cè)速度和較低的污染風(fēng)險(xiǎn)。在保證了靈敏度的同時(shí)，還具備更適合定量檢測(cè)且適用于高通量分析等優(yōu)點(diǎn)，因而也得到了廣泛的應(yīng)用。邱璐等［23］針對(duì)E蛋白基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了WNV核酸的熒光定量RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)不與同屬的日本腦炎病毒和登革病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，靈敏度可達(dá)0.01 pg，相較于常規(guī)PCR靈敏度提高了100倍。Linke等［24］針對(duì)WNV譜系1和2建立了一種熒光定量RT-PCR方法，基于譜系1和2的保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，可靈敏、快速檢測(cè)譜系1和2，并且與其他黃病毒如黃熱病病毒、登革病毒、日本腦炎病毒和圣路易斯腦炎病毒無反應(yīng)，適用于西尼羅河病毒的診斷和監(jiān)測(cè)研究。但除了西尼羅病毒譜系1和2之外還有其他變異株。Vzquez等［25］則為填補(bǔ)這一空白，建立了更為全面的熒光定量RT-PCR方法，可以檢測(cè)到其他WNV譜系和變異株。它將引物和探針設(shè)計(jì)在病毒基因組的3′端非翻譯區(qū)，結(jié)果與所有測(cè)序的西尼羅病毒株完美匹配，靈敏度可以達(dá)到1.5到15個(gè)copies·μL－1。

近些年，數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）也被應(yīng)用于WNV的檢測(cè)。dPCR可將單個(gè)核酸分子制成微反應(yīng)單元，通過檢測(cè)微反應(yīng)單元的熒光濃度達(dá)到絕對(duì)定量。張俊鋒等［26］建立的WNV上沖微滴式數(shù)字PCR敏感性和特異性俱佳，并且在高病毒濃度和低病毒濃度下的變異系數(shù)較小，體現(xiàn)了dPCR在病毒定量檢測(cè)方面的高可靠性。

2.2.2" 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（isothermal amplification）是一種在恒定溫度下進(jìn)行的DNA或RNA的快速擴(kuò)增方法，省略了復(fù)雜的溫度循環(huán)，快速簡(jiǎn)便，對(duì)于抑制物質(zhì)（如血液、組織提取物等）的耐受性較好，所需的設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，降低了成本，因此適用現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)或者大批量的快速檢測(cè)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的核酸檢測(cè)方法。2004年，Parida等［27］開發(fā)了一種快速檢測(cè)WNV的實(shí)時(shí)RT-LAMP方法，具有極高的靈敏度，可以檢測(cè)到0.1 PFU病毒，且不與相關(guān)的黃病毒屬成員發(fā)生交叉反應(yīng)，但實(shí)時(shí)濁度分析可能會(huì)受到背景干擾。Cao等［28］開發(fā)了一種新的診斷西尼羅病毒的LAMP方法，結(jié)合VF顯示條帶判斷結(jié)果，這些條帶被封閉在塑料防漏設(shè)備中，從而減少受污染或干擾的風(fēng)險(xiǎn)。

逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RT-RPA）、逆轉(zhuǎn)錄酶促重組等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-ERA）與逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增檢測(cè)（RT-RAA）三者的原理相似，不同之處在于重組酶的來源，這導(dǎo)致了它們的專利和命名的差異。呂沁風(fēng)等［29］建立了一種西尼羅病毒逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增檢測(cè)方法（RT-RAA），反應(yīng)溫度為39 ℃，在20 min內(nèi)出結(jié)果，敏感度可達(dá)10 copies·μL－1，并且其他黃病毒屬的黃熱病毒、登革病毒、日本腦炎病毒及甲病毒屬的基孔肯雅病毒無擴(kuò)增曲線，具有良好的特異性。而在張逸龍等［30］建立的RT-ERA方法中，敏感度可以提高至1 copies·μL－1。

2.2.3" 宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)是基于高通量測(cè)序的研究樣品中所有微生物群體的物種和豐度信息的技術(shù)，可以被用于對(duì)蚊子或其他宿主中的病毒群體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而提前預(yù)測(cè)可能的疫情爆發(fā)。除此之外，通過對(duì)不同時(shí)間、地點(diǎn)或宿主來源的樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序，可以跟蹤西尼羅病毒的遺傳變異和進(jìn)化。Wollants等［31］對(duì)一名比利時(shí)的老年患者進(jìn)行了一系列常規(guī)診斷測(cè)試，所有結(jié)果均為陰性，但通過對(duì)培養(yǎng)的呼吸道樣本進(jìn)行高通量測(cè)序和宏基因組分析，檢測(cè)人員得到了一個(gè)完整的西尼羅病毒基因組。

2.3" 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括抗原檢測(cè)和抗體檢測(cè)兩大類。抗體檢測(cè)通過檢測(cè)體液中的特定抗體來確認(rèn)病原體接觸史，適用于免疫監(jiān)測(cè)和疫苗效果評(píng)估?？乖瓩z測(cè)直接檢測(cè)病原體存在，適用于早期診斷和疫情控制?？贵w檢測(cè)相對(duì)穩(wěn)定，但可能錯(cuò)過早期感染，而抗原檢測(cè)速度快但穩(wěn)定性較差。WNV感染機(jī)體后，會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，有利于WNV顆粒從活體動(dòng)物的機(jī)體中清除［32-34］，因此WNV抗體的檢測(cè)更為常用。

血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于西尼羅病毒診斷和傳染病監(jiān)測(cè)，常用的技術(shù)包括中和試驗(yàn)（neutralization test，NT）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫熒光法（immuno-fluorescence assay，IFA）等。中和試驗(yàn)為早期的檢測(cè)方法，當(dāng)前主要用于病毒鑒定或中和抗體的定性與定量。ELISA和IFA可以檢測(cè)體液中的抗原或抗體，還有血凝抑制試驗(yàn)（hemagglutination inhibition，HI）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test，CFT）主要用于檢測(cè)體液中的抗體，免疫組化法（immunohistochemistry，IHC）主要用于檢測(cè)組織樣本中的抗原。

2.3.1" ELISA

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）在WNV檢測(cè)中扮演著重要角色，不僅為臨床診斷提供了工具，也為疫情監(jiān)控和病毒學(xué)研究提供了支持，是目前應(yīng)用得最為廣泛的血清學(xué)檢測(cè)方法，在臨床實(shí)踐中，以檢測(cè)WNV抗體為目的的ELISA方法更為常用。

由于IgM抗體不能穿過血腦屏障，其在腦脊液中的存在證明宿主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)已受到感染和損害。腦脊液中檢測(cè)西尼羅河病毒IgM抗體是一種非常敏感的檢測(cè)方法，幾乎所有腦炎或腦膜炎患者在癥狀出現(xiàn)后8 d內(nèi)腦脊液中均可檢測(cè)到高水平的IgM抗體［35］。Martin等［36］在建立一種基于西尼羅病毒E蛋白的IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法過程中，發(fā)現(xiàn)IgM捕獲ELISA比IgG捕獲ELISA有著更低的交叉反應(yīng)。Ludolfs等［37］建立了一種獨(dú)特的反向ELISA方法（reverse-ELISA）來檢測(cè)基于西尼羅病毒E蛋白Ⅲ結(jié)構(gòu)域的IgG抗體，用過氧化物酶標(biāo)記原核表達(dá)的WNV E蛋白結(jié)構(gòu)域III抗原，再通過將血清樣品與酶標(biāo)記抗原混合，形成免疫復(fù)合物，同時(shí)可以被類風(fēng)濕因子包被的微量滴度板識(shí)別。經(jīng)檢驗(yàn)，符合率為77.6%（206份WNV感染者血清檢出160份陽性），在檢測(cè)急性確診的WNV感染血清樣本中，檢測(cè)符合率為100%，特異性為98.5%。由于部分黃病毒科成員（如寨卡病毒、日本腦炎病毒）的E蛋白Ⅲ結(jié)構(gòu)域與WNV的相似性較高，檢測(cè)結(jié)果還需進(jìn)一步評(píng)估。

2015年巴西爆發(fā)寨卡病毒疫情，暴露了黃病毒診斷的一大難點(diǎn)，即基于E蛋白建立的ELISA方法不能有效區(qū)分同屬不同種類的黃病毒。E蛋白抗原的交叉反應(yīng)表位主要位于融合環(huán)內(nèi)或附近，在70到115位氨基酸之間，參與病毒與細(xì)胞膜的融合，在黃病毒屬內(nèi)高度保守［38-39］?；谡ú《綨S1蛋白的ELISA檢測(cè)方法顯示出更好的特異性［40］。Ding等［41］開發(fā)了基于WNV的NS1蛋白抗原捕獲ELISA方法表現(xiàn)出良好的特異性，對(duì)黃病毒屬的其他成員無交叉反應(yīng)等。也有人更加深入地去開發(fā)基于WNV E蛋白的ELISA方法，曹增國(guó)［42］成功建立了一種針對(duì)WNV抗體的間接ELISA方法，與含日本乙型腦炎、委內(nèi)瑞拉馬腦炎、東部馬腦炎、西部馬腦炎抗體的陽性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于7%。

當(dāng)前對(duì)WNF的血清學(xué)檢測(cè)方法主要包括IgM捕獲ELISA（MAC-ELISA）和IgG捕獲ELISA（IgG-ELISA），IgM捕獲ELISA常應(yīng)用于感染前期的檢測(cè)，一般在感染后1～2周間檢測(cè)更為敏感，而IgG捕獲ELISA的檢測(cè)窗口期較長(zhǎng)，一般在病程2周后檢測(cè)更為敏感。2012年，美國(guó)WNV流行病爆發(fā)時(shí)，各州衛(wèi)生與環(huán)境部門采用IgM捕獲ELISA技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的WNV感染監(jiān)測(cè)。

2.3.2" 免疫熒光法（IFA）

IFA是一種常用的定性檢測(cè)和定量方法，它利用熒光標(biāo)記的二抗或其他探針來檢測(cè)待測(cè)樣本中是否存在特定的抗原或抗體。Malan等［43］利用IFA檢測(cè)了82份血清樣本和16份腦脊液樣本中針對(duì)WNV的IgM和IgG，并將結(jié)果分別與MAC-ELISA和IgG-ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)IgG-IFA的一致性、臨床敏感性和臨床特異性分別為92%、100%和90%，而IgM-IFA的一致性、臨床敏感性和臨床特異性分別為98%、96%和100%。這表明IFA與ELISA檢測(cè)結(jié)果相近，但對(duì)于急性感染的檢測(cè)，ELISA敏感性略高于IFA，且IFA對(duì)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求更高。

2.3.3" 免疫組織化學(xué)法（IHC）

IHC是一種結(jié)合顯微解剖學(xué)和免疫生物學(xué)成分的方法，最常用于檢測(cè)死亡病例組織樣本中的WNV抗原，但其對(duì)操作人員技術(shù)要求高、時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)都限制了這項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。Pennick等［44］使用基于E蛋白Ⅲ結(jié)構(gòu)域的一個(gè)表位抗體對(duì)馬進(jìn)行IHC檢測(cè)，并用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，陽性馬腦組織的IHC陽性率為零。在Godhardt等［45］的研究中，對(duì)19個(gè)陽性鴉類的腦、腎、皮膚組織進(jìn)行IHC檢查，腎組織中有17份被檢測(cè)到WNV，皮膚樣本中有15份陽性，而在腦組織中只有9份陽性。因此，腦組織不推薦使用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。

血凝抑制試驗(yàn)（HI）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）可作為一種輔助檢測(cè)WNV抗體的手段，沒有實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí)限制，具有檢測(cè)快速、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。

2.4" 其他診斷技術(shù)

近些年發(fā)展起來的微流控技術(shù)，以其在微米尺度上對(duì)流體的精密操控而聞名，通過與其他診斷方法的結(jié)合應(yīng)用，已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷的重要工具。這項(xiàng)技術(shù)通過在芯片上集成微型管道、閥門和其他功能單元，實(shí)現(xiàn)了對(duì)流體流動(dòng)和化學(xué)反應(yīng)的高度控制，特別是在處理極小量的生物樣本（皮升到納升級(jí)別）時(shí)。針對(duì)WNV的檢測(cè)，微流控技術(shù)不僅提高了檢測(cè)WNV的靈敏度和特異性，還支持實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，加快了對(duì)病毒暴發(fā)的響應(yīng)速度。微流控設(shè)備的便攜性非常適合于田間檢測(cè)監(jiān)測(cè)。該技術(shù)能夠集成多種分析方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA），為WNV的綜合診斷提供了有效的平臺(tái)。在羅馬就已有文獻(xiàn)利用高通量微流控結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)成功檢測(cè)到蚊子排泄物中的2譜系西尼羅病毒［46］。

在我國(guó)，為了確保公共衛(wèi)生安全和預(yù)防疾病的傳播，研究人員采用了多種方法來對(duì)各種病毒進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)西尼羅病毒的檢測(cè)，我國(guó)現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27518—2011已經(jīng)明確規(guī)定了幾種檢測(cè)技術(shù)，包括蝕斑減少中和試驗(yàn)PRNT、IgM捕獲ELISA、RT-PCR（熒光定量RT-PCR、套式RT-PCR）。通過這幾種技術(shù)手段，人們可以更加準(zhǔn)確地診斷西尼羅病毒，從而更好地進(jìn)行預(yù)防和控制。在國(guó)際上，WOAH對(duì)西尼羅熱的推薦診斷方法與我國(guó)類似，除了以上方法外，還包括了免疫組化法。

3" 展" 望

西尼羅熱（WNF）當(dāng)前仍然是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。過去幾十年已經(jīng)在其診斷與監(jiān)測(cè)上取得了顯著進(jìn)步，但該病的感染特性和流行的復(fù)雜性仍然要求人類不斷探索更先進(jìn)、更有效的科學(xué)手段。診斷技術(shù)的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新為人們提供了新的希望，以高通量測(cè)序技術(shù)為主的宏基因組學(xué)分析手段，能夠更加迅速和準(zhǔn)確地識(shí)別病毒序列，在疫情早期進(jìn)行預(yù)警和風(fēng)險(xiǎn)提示；微流控技術(shù)的發(fā)展提供了一種高效和低成本的檢測(cè)手段；人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)的引入，使得數(shù)據(jù)分析的速度、準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性都將得到顯著提升，使人類能夠更好地理解病毒傳播的模式和動(dòng)態(tài)，如Farooq等［47］采用人工智能技術(shù)分析了生態(tài)氣候在歐洲西尼羅熱爆發(fā)中的影響。科技的進(jìn)步正不斷提升人們的應(yīng)對(duì)和處置各類疫病風(fēng)險(xiǎn)的能力，為預(yù)防、預(yù)警、監(jiān)測(cè)和治療疾病的感染提供更有效的手段，以保障人類和動(dòng)物的健康與安全。

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（編輯" 范子娟）