摘" 要：

旨在研究生物礦化對新城疫病毒（NDV）LaSota株生物學(xué)特性及免疫原性的影響，為耐熱活疫苗研發(fā)提供新思路。通過測定不同礦化條件下病毒粒徑、血凝效價(jià)和斑點(diǎn)印記，確定NDV的最佳生物礦化條件；將礦化后病毒接種BHK-21細(xì)胞，檢測礦化對病毒增殖的影響，同時比較熱處理后的礦化病毒在BHK-21細(xì)胞中的滴度變化情況；利用抗體中和試驗(yàn)檢測礦化病毒的免疫原性；最后通過飲水免疫的方式評估礦化病毒在SPF雛雞上的免疫效果。結(jié)果顯示：生物礦化條件經(jīng)優(yōu)化后，LaSota株在4 mmol·L-1 Na2HPO4 和3 mmol·L-1 CaCl2條件下礦化效果最好，此時礦化病毒粒徑最大，血凝效價(jià)最低，礦化率高達(dá)98.25%。礦化的LaSota株在BHK-21細(xì)胞上增殖起始時間遲于未礦化病毒，但兩者的最終增殖滴度沒有顯著差異。經(jīng)NDV抗體中和后，礦化病毒滴度的下降值為103.0 TCID50·mL-1，顯著低于未礦化組。在56 ℃水浴中孵育15 min后，礦化的LaSota株病毒滴度僅下降103.5 TCID50·mL-1，與TS09-C耐熱株的耐熱特性相當(dāng)。礦化的LaSota株免疫SPF雛雞14 d后，抗體水平均高于未礦化LaSota株免疫雞群。免疫后42和78 d進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，礦化LaSota株免疫雞群的存活率分別為100%和60%。綜上所述，本研究優(yōu)化了NDV LaSota株的最佳礦化條件，礦化會延緩病毒的增殖速度，但不影響病毒的增殖滴度。經(jīng)礦化后，能降低病毒與抗體的中和反應(yīng)并提升其熱穩(wěn)定性，并可通過飲水免疫的方式對SPF雛雞提供較好的保護(hù)效果。本研究證實(shí)通過生物礦化開發(fā)新城疫耐熱活疫苗是一條切實(shí)可行的思路，也為開發(fā)其他病毒耐熱活疫苗提供參考和借鑒。

關(guān)鍵詞：

新城疫病毒LaSota株；生物礦化；生物學(xué)特性；熱穩(wěn)定性；免疫原性

中圖分類號：

S852.659.5""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2024）12-5663-09

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.029

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

收稿日期：2024-07-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U23A20239；32302869）；湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2023BBB034）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（CARS-41）

作者簡介：張高峰（1999-），男，湖北宜昌人，碩士，主要從事禽病原微生物相關(guān)研究，E-mail： zgf_9439@163.com

*通信作者：魏紅波，主要從事病原微生物相關(guān)研究，E-mail：969788917@qq.com；商" 雨，主要從事禽病原微生物相關(guān)研究，E-mail：suppershangyu@126.com

Effects of Biomineralization on the Biological Characteristics and Immunogenicity of the LaSota Strain of Newcastle Disease Virus

ZHANG" Gaofeng 1，2， WEI" Jiayang2， FENG" Helong2，3， LI" Li2， ZENG" Zhe2， TIAN" Guangming1， NIE" Renfeng4， LUO" Qingping2，5， WEN" Guoyuan2，5， WEI" Hongbo1*， SHANG" Yu2*

（1.College of Animal Science and Technology， Yangtze University， Jingzhou 444100，" China;

2.Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animal Bacteriosis， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hubei Provincial Key Laboratory of Animal Pathogenic Microbiology， Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，" China;

3.Shannan Tibetan Chicken Industry Research Institute， Shannan 856000， China;

4.Hanchuan Agriculture and Rural Bureau， Xiaogan 431600， "China;

5.Hongshan Laboratory， Wuhan 430070，" China）

Abstract：

This study aims to investigate the effects of biomineralization on the biological characteristics and immunogenicity of the Newcastle disease virus （NDV） LaSota strain， and provide new insights for the development of heat-stable live vaccines. The optimal biomineralization conditions for NDV were determined by measuring viral particle size， hemagglutination titers， and spot blots under different mineralization conditions. The effect of mineralization on viral replication was evaluated by inoculating mineralized viruses into BHK-21 cells， and then comparing their titer changes after heat treatment. The immunogenicity of mineralized viruses was evaluated through virus neutralization tests. Finally， the immunological efficacy of mineralized viruses was assessed in SPF chicks via water administration. Results were as follows： Upon optimization of the biomineralization conditions， the LaSota strain exhibited the best mineralization effect under 4 mmol·L-1 Na2HPO4 and 3 mmol·L-1 CaCl2 conditions， characterized by the largest particle size of the mineralized virus， the lowest hemagglutination titer， and a high mineralization rate of 98.25%. Compared to the non-mineralized virus， the mineralized LaSota strain showed a delayed onset of replication in BHK-21 cells， however， there was no significant difference in the final replication titers between them. Following neutralization with NDV antibodies， the titer reduction value of the mineralized virus was 103.0 TCID50·mL-1， which was significantly lower than that of the non-mineralized group. After incubation at 56 ℃ for 15 minutes， the viral titer of the mineralized LaSota strain decreased by only 103.5 TCID50·mL-1， demonstrating a heat resistance characteristic comparable to that of the TS09-C heat-resistant strain. Fourteen days post-immunization， antibody levels in SPF chicks immunized with the mineralized LaSota strain were higher than those in chicks receiving the non-mineralized LaSota strain. Challenge experiments conducted 42 and 78 days post-immunization showed survival rates of 100% and 60%， respectively， in the group immunized with the mineralized LaSota strain. This study optimized the best biomineralization conditions for the NDV LaSota strain. Mineralization delays the initial viral replication but does not affect the final titer. After mineralization， it can reduce neutralization reaction of virus with antibodies and enhance thermal stability of virus， providing good protective effects to SPF chicks via drinking water immunization. This study confirms that developing heat-stable live vaccines for Newcastle disease through biomineralization is a practical and feasible approach， and also offers valuable references and inspirations for developing heat-stable live vaccines for other viruses.

Key words：

LaSota strain of Newcastle disease virus; biomineralization; biological characteristics; thermal stability; immunogenicity

*Corresponding authors：" WEI Hongbo， E-mail： 969788917@qq.com; SHANG Yu， E-mail： suppershangyu@126.com

新城疫（Newcastle disease， ND）又稱亞洲雞瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）引發(fā)的一種主要感染禽類的烈性高度接觸性傳染病，死亡率可達(dá)90%以上，在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生［1］，其流行對家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health， WOAH）列為需上報(bào)禽傳染病。ND防控的主要手段是接種疫苗，常用的疫苗有滅活疫苗和弱毒活疫苗。其中弱毒活疫苗能通過飲水、噴霧等便捷的免疫方式，實(shí)現(xiàn)對雞群的快速免疫，且可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液、細(xì)胞及局部黏膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生全方位、多層次的免疫保護(hù)效果［2］。但大部分弱毒活疫苗耐熱性較差，其儲運(yùn)依賴嚴(yán)格的冷鏈系統(tǒng)，因此限制了其在溫度較高或冷鏈條件較差地區(qū)的推廣和應(yīng)用。目前提升疫苗熱穩(wěn)定的方法首先是加入耐熱凍干保護(hù)劑進(jìn)行真空冷凍干燥，以保持疫苗在儲運(yùn)過程中的穩(wěn)定性，但在凍干過程中會發(fā)生pH值改變，DNA/RNA機(jī)械損傷，形成冰晶等導(dǎo)致疫苗有效抗原效價(jià)下降［3］；其次通過選育毒株也可提高耐熱性，從根源解決疫苗保存和運(yùn)輸問題，但涉及漫長的選育過程［4-6］。

生物礦化是自然中普遍存在的現(xiàn)象，是生物體從環(huán)境中吸收相關(guān)礦物質(zhì)元素使之轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟ńY(jié)構(gòu)的過程，有助于穩(wěn)定內(nèi)部結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使其免受惡劣環(huán)境的影響［7］。病毒在一定條件下也可發(fā)生礦化，Zhou等［8］發(fā)現(xiàn)禽流感病毒在禽類腸道的高鈣離子條件下可以實(shí)現(xiàn)生物礦化，進(jìn)而抵抗體外環(huán)境中不利因素（如溫度、pH等）對病毒的影響。通過生物礦化的方法，為病毒、蛋白質(zhì)等添加保護(hù)性礦化外殼，以提高其對熱等外部環(huán)境的耐受性［9］，為耐熱疫苗研發(fā)提供了一種新的思路。目前，可用于生物礦化的材料種類繁多，包括磷酸鈣、碳酸鈣、二氧化硅等［10］。而磷酸鈣［Ca3（PO4）2，簡稱Cap］因無毒、生物相容性高、可降解性高而備受疫苗和材料領(lǐng)域關(guān)注［11］。Koppad等［12］評估了礦化新城疫滅活疫苗引起免疫應(yīng)答的效果，驗(yàn)證了生物礦化對新城疫疫苗的免疫原性有顯著的提升作用，能使免疫應(yīng)答反應(yīng)更強(qiáng)且持久。Du等［13］通過生物礦化口蹄疫病毒樣顆粒，在37 ℃下儲存11 d后仍能夠保持免疫原性。因此，Cap作為改善疫苗熱穩(wěn)定性的新型佐劑，能在抗原物質(zhì)周圍形成物理性屏障，隔絕與外界環(huán)境的直接接觸，并防止病毒發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化，利于刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)［14］。

本研究以NDV LaSota株為對象，探索其生物礦化的條件，研究生物礦化對LaSota株生物學(xué)特性的影響，評估礦化LaSota株的免疫保護(hù)效果，為開發(fā)耐熱新城疫活疫苗提供技術(shù)支撐。

1" 材料與方法

1.1" 細(xì)胞、病毒和主要試劑

NDV耐熱弱毒株TS09-C株、非耐熱弱毒LaSota株和強(qiáng)毒F48E9株、BHK-21細(xì)胞均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病防控團(tuán)隊(duì)（本實(shí)驗(yàn)室）保存。

DMEM、PBS、胰酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG和FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；雞新城疫血凝抑制陽性血清購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司；ECL顯色液購自德國默克公司。

1.2" 雞胚與試驗(yàn)動物

SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；SPF雛雞由本實(shí)驗(yàn)室孵化，隔離器飼養(yǎng)。

1.3" 病毒的純化與礦化條件的優(yōu)化

將NDV LaSota株的尿囊液稀釋104倍，稀釋的病毒尿囊液以100 μL·枚-1接種至9～10日齡SPF雞胚的尿囊腔。37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天檢查雞胚存活情況。棄去24 h之內(nèi)死亡的雞胚，收集24 h之后死亡雞胚和96 h后未死亡雞胚的尿囊液，通過血凝試驗(yàn)（HA）［15］檢測每枚雞胚尿囊液的效價(jià)，棄去HA效價(jià)低于27的尿囊液。將收集的尿囊液10 000 r·min -1離心30 min，收集上清；然后以40 000×g離心力在4 ℃條件下超速離心2 h，棄去上清，用0.01 mol·L-1 Tris-HCl重懸沉淀。

將1 mL病毒懸液（HA=28）分別加入終濃度為0～10 mmol·L-1的Na2HPO4溶液，37 ℃搖床孵育1 h后，在各組Na2HPO4溶液中分別加入終濃度為1～5 mmol·L-1的CaCl2溶液，37 ℃搖床繼續(xù)孵育12 h。通過粒度分析儀和血凝試驗(yàn)測定經(jīng)不同濃度組合礦化病毒的粒徑和血凝效價(jià)，依據(jù)測定結(jié)果初選出礦化的最佳濃度組合。

1.4" 粒徑測定

粒徑由馬爾文納米粒度儀檢測，具體步驟：吸取40 μL病毒樣品加入樣品池中，打開儀器的樣品池蓋，放入儀器中。通過軟件設(shè)定緩沖液為Tris-HCl，樣品溫度為25 ℃，孵育時間為2 min，測定次數(shù)為3次，設(shè)置完畢后，開始測定樣品粒徑。

1.5" 斑點(diǎn)雜交

將20 μL礦化病毒滴于NC膜上自然晾干，置于50 g·L-1脫脂乳（TBST配制）中孵育1 h，TBST洗滌3次。先后以雞新城疫血凝抑制陽性血清為一抗、HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體為二抗對NC膜進(jìn)行溫育，最后將ECL顯色液均勻滴加至NC膜上，顯色，觀察并拍照。

1.6" 礦化效率測定

將礦化病毒以12 000 ×g高速離心30 min。取離心前、后的病毒上清200 μL，進(jìn)行10倍梯度稀釋。稀釋后的病毒接種于生長有BHK-21細(xì)胞的96孔板，每個稀釋度接種6孔，每孔接種100 μL。感染72 h后，以NDV陽性血清為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體為二抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）［16］，檢測細(xì)胞的病毒感染情況，根據(jù)Reed-Muench方法［17］計(jì)算TCID50，通過以下公式計(jì)算礦化率：

礦化率（％）=（1-上清液滴度/離心分離前病毒滴度）×100。

1.7" 生長曲線測定

將礦化病毒以0.1 MOI接種于鋪有BHK-21細(xì)胞的6孔板中，分別在接種后的0、12、24、48、72、96、120和144 h收取細(xì)胞培養(yǎng)上清200 μL。在BHK-21細(xì)胞上測定上清中病毒的TCID50，根據(jù)上清中病毒的TCID50繪制礦化病毒的生長曲線。

1.8" 抗體中和試驗(yàn)

取礦化組病毒或未礦化病毒（礦化前血凝效價(jià)HA=28）和雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（血凝抑制效價(jià)HI=28）各100 μL混合，37 ℃孵育60 min。在BHK-21細(xì)胞上測定各組中和前后病毒的TCID50，計(jì)算中和后病毒滴度下降值。

1.9" 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將礦化前后的NDV LaSota株分別在56 ℃孵育0、5、10和15 min，將不同處理時間的病毒液在BHK-21細(xì)胞上測定TCID50滴度，評估病毒的感染力熱穩(wěn)定性。

1.10" 礦化病毒免疫保護(hù)試驗(yàn)

將30只1日齡SPF雛雞平均分為3組，分別為礦化組、未礦化組和空白對照組。各組雞群在禁水2 h后，使用滅菌純水將礦化和未礦化LaSota株病毒稀釋至106.0 EID50·mL-1，每組2 h內(nèi)自由飲水40 mL。在免疫后7、14、21、28、35、42和49 d每組隨機(jī)采集10只雞的血液并分離血清，通過血凝抑制試驗(yàn)（HI）［14］檢測血清的NDV抗體水平。

分別在免疫后42、78 d進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，每組隨機(jī)取5只雞，以肌肉注射的方式進(jìn)行新城疫病毒強(qiáng)毒F48E9株攻擊，104.5EID50·只-1，統(tǒng)計(jì)一周內(nèi)雛雞的發(fā)病及死亡情況，并計(jì)算攻毒保護(hù)率。

2" 結(jié)" 果

2.1" 礦化條件優(yōu)化

將NDV LaSota株在不同濃度的Na2HPO4和CaCl2條件下進(jìn)行礦化，測定病毒的粒徑及血凝效價(jià)。在Na2HPO4濃度為4 mmol·L-1時，隨著CaCl2濃度的升高，礦化病毒的粒徑顯著增加，在CaCl2濃度為3 mmol·L-1時，病毒粒徑達(dá)到最高值（1 045 nm），隨后礦化病毒的粒徑顯著下降（圖1A）。血凝效價(jià)測定結(jié)果顯示，Na2HPO4濃度為4 mmol·L-1時，礦化病毒血凝效價(jià)隨CaCl2濃度增加而降低，CaCl2濃度為3～5 mmol·L-1時，礦化病毒血凝效價(jià)達(dá)到最低值（21），CaCl2濃度為3 mmol·L-1時，礦化效果已達(dá)平臺期（圖1B）。由上述結(jié)果可知，Na2HPO4濃度為4 mmol·L-1時，病毒粒徑與CaCl2濃度有較好的相關(guān)性，且血凝效價(jià)隨CaCl2濃度增加下降較快，說明Na2HPO4濃度4 mmol·L-1是最佳的礦化濃度。為了進(jìn)一步優(yōu)化CaCl2的濃度，將Na2HPO4的濃度固定在4 mmol·L-1，CaCl2濃度調(diào)整為2.0、2.2、2.4、2.6、2.8和3.0 mmol·L-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)礦化病毒粒徑隨CaCl2濃度升高而增加，3 mmol·L-1時粒徑達(dá)到最大值（圖1C）；血凝效價(jià)在CaCl2濃度為3 mmol·L-1時降至最低值（圖1D）。綜上所述，初步確定Na2HPO4濃度為4 mmol·L-1，CaCl2濃度為3 mmol·L-1時為最佳條件，此時粒徑最大，血凝效價(jià)最低。

2.2" NDV LaSota株的礦化效果評估

將4 mmol·L-1 Na2HPO4，3mmol·L-1 CaCl2濃度條件下礦化的病毒進(jìn)行斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)，同時設(shè)置未礦化病毒作為對照組。結(jié)果顯示，CaCl2的濃度為3 mmol·L-1時，免疫印跡顯著變淺，能顯著抑制抗體與病毒的結(jié)合（圖2A）。通過病毒礦化率結(jié)果可知，Na2HPO4濃度為4 mmol·L-1，CaCl2濃度為3 mmol·L-1時，病毒的礦化效率為98.25%（圖2B）。以上結(jié)果表明病毒在Na2HPO4濃度為4 mmol·L-1，CaCl2濃度為3 mmol·L-1時病毒礦化效果較好。

2.3" 礦化LaSota株生物學(xué)特性分析

為了對比LaSota株病毒在4 mmol·L-1 Na2HPO4，3 mmol·L-1 CaCl2條件下礦化前后的病毒增殖滴度差異，將礦化和未礦化病毒分別感染BHK-21細(xì)胞并測定細(xì)胞滴度（TCID50）。結(jié)果顯示礦化與未礦化病毒的TCID50無顯著差異，表明礦化對NDV LaSota株在細(xì)胞上的增殖滴度無顯著影響（圖3A）。

測定礦化病毒在BHK-21細(xì)胞上的生長曲線，同時設(shè)置未礦化病毒作為對照組。結(jié)果顯示，在4 mmol·L-1 Na2HPO4和3 mmol·L-1 CaCl2條件下礦化的病毒在感染細(xì)胞24 h之后開始增殖，120 h后達(dá)到平臺期；未礦化病毒在48 h達(dá)到生長平臺期。礦化病毒增殖速度遲于未礦化組，但最終兩組的病毒滴度相似（圖3B）。這表明生物礦化對病毒增殖有延遲作用，但不影響病毒最終的細(xì)胞滴度。

將礦化與未礦化LaSota株病毒分別與雞新城疫血凝抑制陽性血清進(jìn)行中和反應(yīng)，結(jié)果顯示，在4 mmol·L-1 Na2HPO4，3 mmol·L-1 CaCl2條件下礦化病毒的滴度下降平均值為103.0，未礦化組滴度下降平均值為105.95 TCID50·mL-1，礦化病毒滴度下降程度顯著低于未礦化組（圖3C）。結(jié)果表明NDV LaSota株經(jīng)礦化后能夠顯著降低抗體對病毒的中和反應(yīng)。

測定4 mmol·L-1 Na2HPO4和3 mmol·L-1 CaCl2條件下礦化的病毒與未礦化病毒的熱穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，礦化的病毒在56 ℃水浴中處理15 min，病毒滴度降低了103.0 TCID50·mL-1，與NDV TS09-C耐熱株相似；而未礦化病毒在處理10 min后，滴度下降了107.3 TCID50·mL-1（圖3D），說明生物礦化能顯著提升NDV LaSota株的熱穩(wěn)定性。

2.4" SPF雛雞免疫后的抗體水平

將4 mmol·L-1 Na2HPO4和3 mmol·L-1 CaCl2條件下礦化的LaSota株病毒以及未礦化病毒通過飲水方式免疫SPF雛雞。免疫后抗體水平的測定結(jié)果顯示，礦化病毒組在免疫14 d后NDV抗體顯著提升，28 d后抗體水平最高（HI效價(jià)達(dá)到24.4），隨后逐步降低；未礦化病毒組在免疫14 d后效價(jià)達(dá)到23，隨后逐步降低。免疫14 d后礦化病毒組的抗體水平均高于未礦化病毒組，在28、35和42 d時差異顯著（圖4）。結(jié)果表明，礦化病毒在機(jī)體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)時間有一定延遲，但對抗體水平的提升有顯著作用，能夠提升病毒的免疫原性。

2.5" SPF雛雞免疫后的攻毒保護(hù)效果

在免疫42和78 d后，用NDV F48E9強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示，礦化病毒組和未礦化病毒

*.Plt;0.05；**. Plt;0.01

組在免疫42 d后攻毒存活率均為100%，且未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀；礦化病毒組在免疫78 d后攻毒的保護(hù)率為60%，而未礦化病毒組的保護(hù)率為20%；對照組在攻毒后全部死亡（表1）。表明生物礦化的病毒能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更長的免疫保護(hù)周期。

3" 討" 論

傳染性疾病對畜禽業(yè)的健康發(fā)展造成嚴(yán)重威脅，接種疫苗是一種最經(jīng)濟(jì)、最有效的控制傳染病的方法。但活疫苗需要低溫條件來保持有效的免疫原性，冷鏈系統(tǒng)不完善時，無法保證活疫苗的有效性。因此，開發(fā)熱穩(wěn)定性優(yōu)良的疫苗具有廣泛的應(yīng)用前景。生物礦化是自然界中廣泛存在的現(xiàn)象，能夠提升生物體對外界不利條件的抵抗能力［18］。而且病毒在一定條件下也能實(shí)現(xiàn)礦化，礦化病毒的耐熱性會顯著提升，在機(jī)體以外環(huán)境中的生存能力也得以提升［19］。因此，利用生物礦化開發(fā)耐熱活疫苗是一項(xiàng)極具吸引力的研究。常見的可用于生物礦化材料有磷酸鈣、碳酸鈣、二氧化硅等，其中磷酸鈣具有高度生物相容性、環(huán)保和安全等特點(diǎn)，是礦化疫苗的理想材料［20-21］。本研究以NDV LaSota株為研究對象，系統(tǒng)性地評估了生物礦化開發(fā)活疫苗的可行性。

本研究中在優(yōu)化不同CaCl2濃度礦化病毒時，發(fā)現(xiàn)隨著鈣離子濃度增加，粒徑從200 nm增加到1 045 nm。Zhou等［22］在AIV礦化過程中發(fā)現(xiàn)，禽類腸道中含有鈣離子的體液為誘發(fā)AIV的礦化提供了合適的微環(huán)境，鈣離子發(fā)生聚合反應(yīng)，沉積在病毒表面，以包裹病毒，使病毒粒徑由120 nm變?yōu)榱?25～126 nm。在本研究中，礦化的鈣離子濃度相較于禽類腸道高，導(dǎo)致NDV經(jīng)礦化后，粒徑較大。另外，Du等［13］對口蹄疫（FDMV）病毒樣顆粒（VLPs）進(jìn)行礦化，發(fā)現(xiàn)大量磷酸鹽吸附在VLP表面的天冬氨酸和谷氨酸負(fù)電性位點(diǎn)上，使其粒徑從30 nm增加至136 nm。因此，病毒或蛋白表面相關(guān)活性基團(tuán)吸附磷酸鈣，或者溶液中的鈣離子相互作用聚合沉積在病毒或蛋白表面從而發(fā)生生物礦化，使其粒徑發(fā)生不同程度的增大。

在細(xì)胞上測定病毒滴度時發(fā)現(xiàn)，礦化處理不影響病毒的最終增殖滴度。Wang等［23］礦化人腸道病毒 71 型（enterovirus 71， EV71）發(fā)現(xiàn)，礦化疫苗與普通疫苗具有相似的復(fù)制能力和生長特性。而在本研究過程中，隨著礦化濃度的升高，礦化病毒的增殖速度緩于未礦化病毒，但最終增殖滴度相似。這可能由于病毒經(jīng)過礦化后，磷酸鈣外殼變厚，粒徑也隨之變大，這影響了病毒與細(xì)胞的結(jié)合能力，從而直接影響病毒的感染速率。通過對NDV LaSota株礦化后，在56 ℃下的耐熱性能顯著提升，與TS09-C耐熱株相似。Wang等礦化EV71疫苗后，發(fā)現(xiàn)在37 ℃下儲存約1周仍保持疫苗有效性［24-25］；Du等［13］在FDMV VLPs表面完整覆蓋磷酸鈣外殼后，在37 ℃下儲存 11 d后仍能夠保持其免疫原性。因此，病毒經(jīng)礦化后，隔絕了與水溶液的直接相互作用，減少從外部水溶液至內(nèi)部的熱傳遞，改善了疫苗的耐熱性。

在本研究中，免疫SPF雛雞14 d起，礦化的病毒免疫組雞群的NDV抗體水平均高于未礦化病毒免疫組，相似的結(jié)果出現(xiàn)在Koppad等［12］的研究中，其將礦化NDV滅活疫苗免疫商品雞后，雞群的抗體水平顯著高于未礦化疫苗免疫組。這表明生物礦化能提升疫苗的免疫原性。根據(jù)抗體水平趨勢，78 d的抗體水平接近于空白對照組的水平，但在78 d時進(jìn)行攻毒，仍然具有一定的保護(hù)效果。這與礦化病毒通過飲水免疫進(jìn)入機(jī)體后，內(nèi)體和溶酶體的酸性物質(zhì)使礦物外殼逐漸降解，釋放病毒粒子［26］，同時在細(xì)胞免疫以及黏膜免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用有關(guān)［27-28］。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)礦化病毒免疫組的抗體達(dá)到最高水平的時間顯著長于未礦化病毒免疫組，可能是因?yàn)榈V化NDV免疫后具有一定的緩釋效果，能夠持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。Min等［29］發(fā)現(xiàn)礦化的蛋白質(zhì)并沒有導(dǎo)致紅細(xì)胞快速溶血，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因是在pH 7.4的生理?xiàng)l件下CaP形成穩(wěn)定的外殼，藥物釋放速度放緩［30］。因此，緩釋可能是礦化疫苗的一個新的特點(diǎn)和優(yōu)勢。

綜上所述，礦化后不影響病毒的最終增殖滴度，其次還增強(qiáng)了耐熱性與免疫原性，不僅能提供良好的免疫保護(hù)效果，而且在機(jī)體內(nèi)具有一定的緩釋作用，增加了免疫保護(hù)期。本研究以生物礦化工程為基礎(chǔ)，為新城疫耐熱疫苗的研制提供了數(shù)據(jù)支撐，同時也為各種疫病耐熱疫苗的相關(guān)研究及應(yīng)用開辟了新途徑。

4" 結(jié)" 論

本研究優(yōu)化了NDV LaSota株的礦化條件，在4 mmol·L-1 Na2HPO4，3 mmol·L-1 CaCl2條件下最佳。生物礦化延緩病毒的增殖速度，但不影響病毒的增殖滴度，降低病毒與抗體的中和反應(yīng)并提升其熱穩(wěn)定性，并可通過飲水免疫的方式對SPF雛雞提供較好的保護(hù)效果。本研究證實(shí)通過生物礦化開發(fā)新城疫耐熱活疫苗是一條切實(shí)可行的思路，也為開發(fā)其他病毒耐熱活疫苗提供參考和借鑒。

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（編輯" 白永平）