摘" 要： 馬立克?。∕D）是由馬立克病病毒（MDV）感染引起的一種重要的家禽免疫抑制病與腫瘤病，該病可用疫苗進(jìn)行預(yù)防和控制，但在長期免疫壓力下MDV的毒力持續(xù)增強(qiáng)，經(jīng)典MD疫苗已難以對當(dāng)前流行的特超強(qiáng)MDV（HV-MDV）變異株提供良好的免疫保護(hù)，亟需研發(fā)新一代MD高效疫苗。本文以HV-MDV變異株HNSQ01為親本毒株，在CEF上連續(xù)傳代之后，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對其meq基因進(jìn)行編輯，通過一系列試驗(yàn)鑒定和分析，最終建立一株meq基因編輯缺失的MD疫苗候選毒株，命名為SQ01Δmeq。1日齡SPF雞攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，在77 d試驗(yàn)周期內(nèi)，親本毒株HNSQ01不僅嚴(yán)重抑制感染雞生長并導(dǎo)致免疫抑制，而且導(dǎo)致100%的MD發(fā)病率、100%致死率及80%的肉眼觀察腫瘤發(fā)生率；但SQ01Δmeq未引起感染雞的生長及免疫抑制，而且MD發(fā)病率、致死率及腫瘤發(fā)生率均為0%，表明其對宿主無致病性，生物安全性良好。本研究建立的meq基因編輯缺失MDV毒株SQ01Δmeq，為后續(xù)研發(fā)新型高效的MD疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 馬立克??；MDV；meq；CRISPR/Cas9；基因編輯；基因缺失；新型疫苗

中圖分類號： S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5672-12

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-21

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（U21A20260）；河南省杰出青年科學(xué)基金（232300421009）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新項(xiàng)目（2024ZC096）

作者簡介：張" 多（1998-），女，河南永城人，碩士生，主要從事動物疫病防控技術(shù)研究，E-mail： 16696657142@163.com

*通信作者：羅" 俊，主要從事動物病毒學(xué)研究，E-mail： luojun593@aliyun.com；余祖華，主要從事動物分子免疫學(xué)研究，E-mail： yzhd05@163.com

Development and Pathogenicity Analysis of a meq-gene-edited Candidate Marek’s Disease Vaccine Strain Generated from a Hypervirulent MDV Variant

ZHANG" Duo1，2，3， TENG" Man2，3， ZHANG" Zhuo2，3，4， LIU" Jinling2，3， ZHENG" Luping2，3， GE" Siyu2，3，4， HAN" Fang1，2，3， LUO" Qin5， CHAI" Shujun2，3， ZHAO" Dong2，3， YU" Zuhua1*， LUO" Jun2，3，4*

（1.Laboratory of Functional Microbiology and Animal Health， College of Animal Science and Technology，

Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003，" China;

2.Institute for Animal Health amp; UK-China Center of Excellence for Research on Avian Disease， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002，" China;

3.Longhu Laboratory， Zhengzhou 450046，" China;

4.College of Public Health， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001，" China;

5.College of Veterinary Medicine， Henan University of Animal Husbandry and Economy， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract：" Marek's disease （MD）， caused by Marek's disease virus （MDV）， is one of the most important immunosuppressive and neoplastic diseases. It can be prevented and controlled with MD vaccines， but the virulence of epidemic MDV strains persistently increases under the highly immune pressure of widely used MD vaccines. Recent studies have found that the classical MD vaccines are no longer able to provide ideal immune protection for the current prevalent hypervirulent MDV （HV-MDV） variant， which implies the urgent need to develop a new generation of highly effective MD vaccines. Presently， we have used the newly isolated HV-MDV variant HNSQ01 as the parental virus， first passaged on CEF monolayers in vitro， to generate a meq gene-edited and knocked out mutant of SQ01Δmeq utilizing the CRISPR/Cas9-based gene editing technology. A series of experiments and analysis have demonstrated a stable MD vaccine candidate strain of SQ01Δmeq has been successfully generated. Furthermore， the pathogenicity analysis was performed with 1-day-old specific-pathogen-free （SPF） chickens for virus challenge experiments. During the 77-days animal experiments， the parental HNSQ01 had caused serious atrophy of host immune organs and inhibited the growth of virus-challenged birds， together with the 100% MD morbidity， 100% mortality and 80% gross tumor occurrence. However， SQ01Δmeq had not caused the immunosuppression or inhibited the growth of virus-challenged birds， together with the 0% rates of MD morbidity， mortality and tumor occurrence. Our data indicate that the generation of SQ01Δmeq provides an important basis for the future research and development of novel efficient genetically engineered MD vaccines.

Key words： Marek's disease; MDV; meq gene; CRISPR/Cas9; Gene editing; gene deletion; novel vaccine

*Corresponding authors：" LUO Jun， E-mail： luojun593@aliyun.com; YU Zuhua， E-mail： yzhd05@163.com

雞馬立克?。∕arek's disease，MD）是由馬立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）感染誘發(fā)的一種重要的家禽免疫抑制病與腫瘤?。?］。MDV可感染雞、火雞、鵪鶉等，引發(fā)宿主神經(jīng)損傷、免疫抑制及淋巴瘤組織增生，最終導(dǎo)致動物大批死亡，每年給全球養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。與MD有關(guān)的家禽皰疹病毒，曾分為三種不同血清型，包括血清Ⅰ型（MDV serotype 1，MDV-1）即禽α皰疹病毒2型（Gallid alphaherpesvirus 2，GaAHV-2）、血清Ⅱ型MDV（MDV serotype 2，MDV-2）即禽α皰疹病毒3型（Gallid alphaherpesvirus 3，GaAHV-3）和火雞皰疹病毒（Herpesvirus of turkeys，HVT），也被命名為火雞α皰疹病毒1型（Melleagrid alphaherpesvirus 1，MeAHV-1）［2］。其中，只有MDV-1分離株對宿主具有致病性和致瘤性。作為首個使用疫苗成功預(yù)防控制的病毒性腫瘤病，MD曾在20世紀(jì)末得到了良好的控制。但在MD疫苗長期使用的免疫壓力下，導(dǎo)致MDV流行毒株毒力不斷增強(qiáng)。根據(jù)對宿主的致病性，可將MDV-1分離株劃分為不同的致病型，包括溫和毒（mild MDV，mMDV）、強(qiáng)毒（virulent MDV，vMDV）、超強(qiáng)毒（very virulent MDV，vvMDV）以及特超強(qiáng)毒（very virulent plus MDV，vv+MDV）［3］。近年來，一些vv＋MDV毒株，特別是最近從MD疫苗免疫雞群發(fā)病病例中分離鑒定的特超強(qiáng)MDV（Hypervirulent MDV，HV-MDV）變異株［4-5］ ，被證實(shí)已全面突破了當(dāng)前廣泛使用的MD經(jīng)典疫苗的免疫保護(hù)，很可能是導(dǎo)致近期MD病例頻繁暴發(fā)的主要原因，給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害［6］。

meq基因是MDV最重要的致瘤基因［7］，全長1 020 bp，是MDV-1特有的基因。有研究表明meq基因與其他轉(zhuǎn)錄因子通過宿主和病毒基因的表達(dá)修飾在 MDV 誘導(dǎo)的T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。利用細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）和基因同源重組技術(shù)敲除MDV強(qiáng)毒株的meq基因后，病毒不再具有致瘤作用，這一發(fā)現(xiàn)揭示了meq基因在MDV致瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］。隨后，以meq基因?yàn)橹饕袠?biāo)進(jìn)行病毒基因組改造，構(gòu)建了一系列MD基因缺失疫苗候選毒株，如rMd5Δmeq、Md5BACΔMeqΔLORF9、686BAC-ΔMeqΔvIL8、rMSΔmeq以及SC9-1等［9-19］，成為21世紀(jì)以來新型MD疫苗研究的熱點(diǎn)［20］。受眾多未明因素的影響，對于絕大多數(shù)的meq基因缺失候選疫苗毒株而言，仍存在導(dǎo)致宿主免疫抑制或免疫保護(hù)效力不足的問題，難以走向商業(yè)化應(yīng)用。

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯是一種新型高效的遺傳操作技術(shù)，幾乎可以靶向編輯任何一種基因。目前，該技術(shù)也被廣泛用于病毒學(xué)研究［21］，其中已被編輯研究過的病毒多為DNA病毒，包括MDV在內(nèi)的皰疹病毒［21-23］。在此前的研究中［24-29］，我們已開展了一系列的MDV基因編輯研究，包括病毒的蛋白編碼基因meq、pp38以及非編碼RNA基因如miRNAs。在最近的研究中［29，30］，我們還成功的將該技術(shù)應(yīng)用于MDV特異性單克隆抗體的篩選和鑒定，充分展示了CRISPR/Cas9基因編輯的技術(shù)優(yōu)勢。當(dāng)前，疫苗免疫雞群頻繁暴發(fā)MD，經(jīng)典MD疫苗對新出現(xiàn)的HV-MDV變異株免疫保護(hù)效力低下，迫切需要研發(fā)新一代高效的MD疫苗［4-6］。2019年以來，受多種因素疊加影響，如新冠疫情暴發(fā)、MDV毒力增強(qiáng)以及疫苗免疫效力下降等，國內(nèi)雞群暴發(fā)大規(guī)模家禽腫瘤病，其中HV-MDV變異株的流行及感染是主要誘因［6］。此前研究發(fā)現(xiàn)，已分離鑒定的HV-MDV變異株中，HNSQ01似乎毒力最強(qiáng)，可導(dǎo)致SPF感染雞100%的MD發(fā)病率、86.7%的死亡率以及63.3%的腫瘤發(fā)生率［5］。為獲得更好的抗原性，本研究以HNSQ01為親本毒株，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建meq基因缺失毒株，以期為后續(xù)新型高效的MD疫苗創(chuàng)制奠定重要基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 細(xì)胞和病毒

雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast，CEF），用9～10日齡SPF雞胚制備，SPF種蛋購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。HV-MDV變異株HNSQ01［5］，此前分離鑒定并保存于液氮。從液氮中取出HNSQ01，在6孔板CEF單層上連續(xù)傳代，每隔3～4 d傳代一次，每隔5代保種一次，液氮凍存?zhèn)溆?。其中，P6代用于動物攻毒試驗(yàn)，P25代用于meq基因編輯。MDV的傳代培養(yǎng)及效價測定，均按此前報道進(jìn)行［31］。

1.2" 主要試劑

M199 培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），均購自Gibco公司；TPB（tryptone phosphate broth）培養(yǎng)基，購自BD公司；0.25% Trypsin-EDTA （1×） 胰蛋白酶消化液、無血清細(xì)胞凍存液、青鏈霉素雙抗，均購自新賽美公司；蛋白酶K溶液（10 mg·mL-1）、1 mol·L-1 Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mol·L-1 EDTA 溶液（pH 8.0），均購自 Solarbio 公司；Ex Taq DNA聚合酶、DH5α感受態(tài)、DNA膠回收試劑盒，均購自TaKaRa公司；BbsⅠ-HF限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶，均購自NEB公司；DyLight 594 Goat Anti-Mouse IgG和DyLight 488 Goat Anti-Mouse IgG，均購自Abbkine公司；質(zhì)粒提取試劑盒Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ，購自O(shè)mega公司；轉(zhuǎn)染試劑Trans IT-X2TM Dynamic Delivery System，購自Mirusbio 公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，購自TIANGEN公司；FastStart Universal SYBR Green MasterBak，購自ROCHE公司。鼠源抗MDV-pp38單抗31G7和MDV-Meq單抗8G11-B2由此前制備保存［29-30］。

1.3" 質(zhì)粒和引物

pMD18T-gB、pMD18T-OVO質(zhì)粒和pX459-gR-F3/pX459-gR-R2質(zhì)粒，均為此前制備保存［25，28，31］；根據(jù)MDV標(biāo)準(zhǔn)毒株GX0101的基因組（GenBank Acc. No. JX844666.1）設(shè)計引物，用于meq基因編輯PCR檢測的引物對meq-9F/meq-2R、用于測定MDV和宿主基因拷貝數(shù)的qPCR引物對yg-gB-F/yg-gB-R和yg-OVO-F/yg-OVO-R、用于MDV基因相對表達(dá)水平分析的逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR（RT-qPCR）引物對gB-F/gB-R、meq-F/meq-R、pp38-F/pp38-R、RLORF4-F/RLORF4-R以及RLORF5a-F/RLORF5a-R，如表1列示，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4" 實(shí)驗(yàn)動物

1日齡SPF雞，購自北京勃林格殷格瀚維通生物技術(shù)有限公司，于正壓隔離器中飼養(yǎng)。動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物疫病防控研究所動物倫理審查委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：LLSC41023016）。

1.5" pX459-gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及病毒感染

提前1 d于24孔板中制備好CEF單層，按照Trans IT-X2TM Dynamic Delivery System（Mirusbio，美國）說明書操作，取pX459-gR-F3和pX459-gR-R2質(zhì)粒，等量混合后分別共轉(zhuǎn)染4孔CEF單層（500 ng·孔-1），38.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后分別接種不同劑量（50、100、150和200 μL）親本毒株HNSQ01（p25代，病毒效價為15 257 PFU·100 μL-1）。設(shè)置兩個未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對照孔，其中一孔接種100 μL的HNSQ01病毒液作為MDV感染陽性對照，另一孔不接種病毒作為CEF陰性對照，置38.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后消化CEF取樣進(jìn)行PCR鑒定。

1.6" PCR 分析及病毒克隆純化

上述樣品，每孔各取出一半病毒/細(xì)胞混懸液，提取總DNA進(jìn)行PCR鑒定，并用1％瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分析。選取PCR擴(kuò)增顯示基因編輯剪切效率較高的樣品孔的另一半病毒/細(xì)胞混懸液，進(jìn)行連續(xù)有限稀釋，分別轉(zhuǎn)接到已鋪滿CEF單層的6孔板4～6個細(xì)胞孔中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。顯微操作挑取MDV單噬斑，逐個轉(zhuǎn)接到24孔板CEF單層上（1個·孔-1），同上培養(yǎng)48 h，然后消化細(xì)胞取樣，同上進(jìn)行PCR鑒定分析。根據(jù)PCR鑒定結(jié)果，連續(xù)進(jìn)行2～3輪的病毒單噬斑克隆純化，直至PCR鑒定及DNA測序分析證實(shí)獲得完全純化的meq基因缺失病毒克隆。將其擴(kuò)大培養(yǎng)并收集凍存，測定病毒效價后置于液氮中備用。同時，將meq基因缺失毒株連續(xù)傳代15代，分別收集第1～5、10、15代病毒樣品，進(jìn)行PCR分析鑒定毒株的傳代穩(wěn)定性。

1.7" 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）

從液氮中取出HNSQ01及其meq基因缺失毒株，分別接種CEF單層并培養(yǎng)3～4 d，待觀察到病毒噬斑形成后，根據(jù)此前報道的方法［29-30］，固定并封閉細(xì)胞，依次孵育MDV-pp38單抗31G7（1∶50 000）、DyLight 488 Goat Anti-Mouse IgG（1∶1 000）、MDV-meq單抗8G11-B2（1∶2 000）以及DyLight 594 Goat Anti-Mouse IgG（1∶1 000），進(jìn)行IFA染色。最后置于熒光顯微鏡（ZEISS公司，德國）下觀察結(jié)果。

1.8" 逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR（RT-qPCR）

用HNSQ01及其meq基因缺失毒株分別感染CEF單層，待形成典型病毒噬斑后消化離心收集細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞/病毒總RNA然后逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。按照此前報道的qPCR方法［24，32-33］，以cDNA為模板、ICP4為內(nèi)參，利用SYBR GreenⅠRT-qPCR 法分別檢測MDV基因gB、meq、pp38、RLORF4以及RLORF5a的相對轉(zhuǎn)錄水平。每個試驗(yàn)均設(shè)置三個獨(dú)立重復(fù)。

1.9" 病毒增殖曲線測定

取HNSQ01及其meq基因缺失毒株，分別接種6孔板CEF單層（100 PFU·孔-1）。病毒感染24、48、72、96和120 h后，分別消化收集細(xì)胞，液氮凍存?zhèn)溆?。將上述各時間點(diǎn)的病毒感染細(xì)胞各取一半，按此前報道進(jìn)行MDV的PFU效價測定［31］；另外一半病毒感染細(xì)胞樣品，用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，分別提取細(xì)胞/病毒總DNA，并用NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher公司、美國）測定濃度后備用。取pMD18T-gB和pMD18T-OVO標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，將其分別進(jìn)行10倍比稀釋建立qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過SYBR GreenⅠPCR測定上述樣品中MDV gB基因的拷貝數(shù)，再根據(jù)公式計算gB基因的拷貝數(shù)/（×106細(xì)胞）。上述每個試驗(yàn)均設(shè)置三個獨(dú)立重復(fù)。

1.10" 動物攻毒試驗(yàn)

1日齡SPF雞75只，隨機(jī)分為3組，包括CEF陰性對照組（34只）、HNSQ01攻毒組（27只）和meq基因缺失毒株攻毒組（26只），分別置正壓隔離器內(nèi)正常飼養(yǎng)。1日齡時，攻毒組分別腹腔注射HNSQ01（P6代）或meq基因缺失毒株（P50代）感染的CEF懸液2 000 PFU·（200 μL·只）-1；陰性對照組腹腔注射等體積的CEF懸液。攻毒后每日觀察各組的臨床癥狀、發(fā)病及死亡情況，病死雞進(jìn)行剖檢并觀察腫瘤發(fā)生情況。攻毒后每間隔一周，每組各取5只雞稱重。感染后第14和21天，每組各取4只雞安樂死，采集胸腺、法氏囊和脾稱重，記錄并計算免疫器官指數(shù)。計算公式：免疫器官指數(shù)=［免疫器官重量（g）/體重（g）］×100。至第77天整個試驗(yàn)結(jié)束時，將所有存活雞進(jìn)行安樂死、剖檢觀察內(nèi)臟器官腫瘤發(fā)生情況，同時每組各取3只雞，采集肝和脾，送樣至武漢賽維爾生物科技有限公司制備組織切片，并進(jìn)行HE染色，觀察組織病理變化情況。最終根據(jù)全程試驗(yàn)記錄，統(tǒng)計各組的MD發(fā)病率、死亡率和肉眼腫瘤發(fā)生率，繪制各組試驗(yàn)雞的存活曲線。

1.11" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用生物學(xué)軟件GraphPad Prism Version 9.5（GraphPad Software公司、美國），統(tǒng)計分析MDV基因相對表達(dá)水平、繪制病毒增殖曲線以及動物攻毒試驗(yàn)存活曲線。使用生物學(xué)軟件SPSS 25.0（IBM公司、美國），統(tǒng)計分析動物攻毒試驗(yàn)雞各組之間體重、免疫器官指數(shù)、MD發(fā)病率、死亡率以及腫瘤發(fā)生率的差異顯著性。以Plt;0.05檢驗(yàn)各組之間差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" meq基因編輯缺失毒株的構(gòu)建及PCR鑒定

分別提取gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/病毒感染、陽性對照及陰性對照CEF總DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。電泳分析結(jié)果顯示，質(zhì)粒未轉(zhuǎn)染/HNSQ01感染CEF中，僅擴(kuò)增出約1 121 bp的meq基因野生型條帶；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/不同劑量病毒感染CEF中，同時擴(kuò)增出約1 121 bp的野生型條帶和約196 bp的meq基因編輯小條帶；陰性對照CEF未擴(kuò)增出任何產(chǎn)物（圖1A）。將meq基因編輯小條帶切膠回收并純化克隆，DNA測序分析結(jié)果與預(yù)期完全相符。將上述基因編輯效率最高的病毒/細(xì)胞懸液進(jìn)行有限稀釋，接種6孔板CEF單層，連續(xù)進(jìn)行3輪病毒單噬斑的克隆純化及PCR鑒定，最終獲得一株meq基因完全編輯缺失的MDV毒株，命名為SQ01Δmeq（克隆號為C6-2-1）。將其進(jìn)行連續(xù)傳代，PCR檢測結(jié)果顯示p1～ p15代次的子代病毒中，均只擴(kuò)增出約196 bp的特異性條帶（圖1B），表明該毒株的meq基因被成功編輯缺失且未發(fā)生回復(fù)突變，傳代穩(wěn)定性良好。

2.2" meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq的 IFA 鑒定

為了分析meq基因的編輯缺失是否影響MDV病毒噬斑的形成，以HNSQ01和SQ01Δmeq分別感染CEF單層，形成典型MDV噬斑后固定細(xì)胞，分別用MDV pp38和Meq蛋白特異性單抗進(jìn)行IFA染色。結(jié)果顯示，兩個毒株感染的CEF細(xì)胞中，均可觀察到形態(tài)相似且綠色熒光特異性染色的MDV噬斑，說明pp38蛋白均正常表達(dá)；紅色熒光特異染色的Meq蛋白僅在HNSQ01病毒噬斑中正常表達(dá)，而在SQ01Δmeq病毒噬斑中均未見表達(dá)（圖2）。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)SQ01Δmeq毒株的meq基因被完全編輯缺失，且其缺失不影響pp38蛋白的表達(dá)及病毒噬斑的形成。

2.3" meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq的基因表達(dá)及體外增殖

以 ICP4為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR分別檢測MDV gB、meq、pp38、RLORF4以及RLORF5a在HNSQ01和SQ01Δmeq感染CEF中的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與HNSQ01相比，除了未檢測到meq基因表達(dá)之外，其他基因如gB、pp38、RLORF4和RLORF5a在SQ01Δmeq感染CEF中均正常表達(dá)，且與親本毒株的表達(dá)水平無顯著性差異（Pgt;0.05）（圖3A）。分別收集HNSQ01和SQ01Δmeq感染的CEF并提取總DNA，用SYBR GreenⅠqPCR檢測病毒感染后不同時間點(diǎn)gB基因和宿主OVO基因拷貝數(shù)，繪制病毒體外增殖曲線。結(jié)果顯示，隨著感染時間增加病毒基因拷貝數(shù)也持續(xù)增加，且HNSQ01和SQ01Δmeq的增殖曲線基本相似（圖3B），在感染后24、48、72、96 以及120 h均無顯著性差異（P＞0.05）。利用IFA染色，對上述同批次樣品進(jìn)行的PFU效價滴定結(jié)果，亦顯示HNSQ01和SQ01Δmeq具有相似的增殖曲線（圖3C），兩個毒株在任一時間點(diǎn)的病毒效價均無顯著差異（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，meq基因的編輯缺失不影響所檢測基因的表達(dá)，也不影響SQ01Δmeq的體外復(fù)制能力。

2.4" SQ01Δmeq感染對SPF雞的生長及免疫器官的影響

分別用HNSQ01（p6代）和SQ01Δmeq（p50代）感染1日齡SPF雞，以CEF細(xì)胞為陰性對照，進(jìn)行動物攻毒試驗(yàn)，并于攻毒后每隔一周對試驗(yàn)雞進(jìn)行稱重。結(jié)果顯示（圖4A），除了最后兩周因HNSQ01攻毒雞全部死亡無法統(tǒng)計之外，自14 dpi到63 dpi的任一檢測時間點(diǎn)HNSQ01攻毒組與CEF陰性對照組之間試驗(yàn)雞的體重均存在差異性顯著（Plt;0.05），同時HNSQ01組攻毒和SQ01Δmeq攻毒組之間也均存在顯著差異性，而SQ01Δmeq攻毒組與CEF陰性對照組之間均無顯著性差異（Pgt;0.05）。在攻毒后14 dpi和21 dpi，分別對各組雞的免疫器官指數(shù)進(jìn)行分析。統(tǒng)計結(jié)果顯示（圖4B～D），HNSQ01攻毒組的胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾指數(shù)與CEF陰性對照組及SQ01Δmeq攻毒組均存在顯著性差異（Plt;0.05），而SQ01Δmeq攻毒組和CEF陰性組相比，除了在14 dpi時脾臟指數(shù)明顯偏高之外，其它時間點(diǎn)的免疫器官指數(shù)均無顯著差異（Pgt;0.05）。上述數(shù)據(jù)表明，meq基因的編輯缺失顯著消除了病毒對宿主產(chǎn)生的生長抑制和免疫抑制。

2.5" SQ01Δmeq感染對SPF雞的致病性及致瘤性

根據(jù)整個動物試驗(yàn)77 d內(nèi)的觀察記錄，首先扣除攻毒后一周內(nèi)可能因應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致早期死亡的雞只（CEF陰性對照、HNSQ01和SQ01Δmeq攻毒組分別為10、9和2只）和14 d、21 d安樂死的雞（8只·組-1），剩余雞納入有效統(tǒng)計數(shù)據(jù)，根據(jù)每日記錄的各組死亡數(shù)繪制存活曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個試驗(yàn)周期內(nèi)CEF陰性對照組和SQ01Δmeq攻毒組試驗(yàn)雞均未觀察到發(fā)病和死亡，而HNSQ01組自攻毒后第2周開始發(fā)病，此后陸續(xù)死亡，至64 dpi時全部死亡無存活（圖5）。對各組死亡雞和存活雞全部進(jìn)行剖檢觀察，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)HNSQ01攻毒組的MD發(fā)病率為100%（10/10）、死亡率為100%（10/10）、肉眼觀察腫瘤發(fā)生率為80.0%（8/10），而CEF對照組和SQ01Δmeq攻毒組的上述指標(biāo)均為0%（0/16和0/16）。試驗(yàn)結(jié)束時每組隨機(jī)挑選3只雞的肝臟和脾臟進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，結(jié)果如圖6所示，HNSQ01攻毒組的肝臟和脾臟中均可觀察到典型的T淋巴細(xì)胞炎性侵潤和組織增生性腫瘤灶，MD腫瘤發(fā)生率為100%（3/3），而CEF陰性對照組和SQ01Δmeq攻毒組試驗(yàn)雞的兩種內(nèi)臟組織均無異常，腫瘤發(fā)生率均為0%（0/3）。

3" 討" 論

MD是人類史上第一個使用疫苗免疫成功預(yù)防的腫瘤病。自1970年HVT疫苗首次商品化應(yīng)用于雞群，先后歷經(jīng)了以不同血清型疫苗毒株研制MD單價疫苗的發(fā)展史（如HVT/MDV-3的FC-126、MDV-2的SB-1和MDV-1的CVI988），隨后二價疫苗、三價疫苗、基因缺失或插入的基因工程疫苗等也得以不斷研究和優(yōu)化［20］。然而，MD疫苗在雞群中的長期使用，加速了MDV的持續(xù)進(jìn)化，導(dǎo)致產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的毒株［34］。近年來，全球各地不斷暴發(fā)MD疫情［35］。作為世界第一養(yǎng)禽大國，中國雞群MD的流行及暴發(fā)亦更加頻繁［6，34］。MD疫苗免疫雞群中vv+MDV和HV-MDV變異株的陸續(xù)報道，表明當(dāng)前國內(nèi)雞群流行的MDV毒力早已進(jìn)化，并且最新研究證實(shí)此前廣泛使用的經(jīng)典MD商品疫苗已不能對新出現(xiàn)的超強(qiáng)毒株或變異株起到良好免疫保護(hù)［5］。究其原因，很可能是由于現(xiàn)有MD疫苗的親本毒株均分離自20世紀(jì)70～80年代，在歷經(jīng)數(shù)十年后，這些年代久遠(yuǎn)的MD疫苗毒株無論是從遺傳距離上還是從病毒抗原性上，都難以為當(dāng)前已發(fā)生進(jìn)化和變異的MDV流行毒株提供良好的免疫保護(hù)［4-5］。

為了研制免疫原性更好的MD疫苗候選毒株，本研究選取從國內(nèi)MD疫苗免疫發(fā)病雞群臨床病例中最新分離鑒定的毒力最強(qiáng)之一的HV-MDV變異株HNSQ01為親本毒株，首先將其在CEF上連續(xù)傳代，以降低其對宿主潛在的免疫抑制，然后利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建其meq基因缺失毒株并分析其對宿主的致病性和安全性，以期為后續(xù)研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型高效MD疫苗提供重要材料。通過一系列的試驗(yàn)研究，如PCR擴(kuò)增、電泳分析、病毒單噬斑克隆、純化鑒定以及DNA測序分析，最終獲得一株可穩(wěn)定傳代且無回復(fù)突變的meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq（病毒克隆號C6-2-1）。進(jìn)一步的IFA染色和RT-qPCR分析顯示，meq基因的編輯缺失沒有影響MDV噬斑形成及代表性MDV基因的表達(dá)。利用qPCR分析和PFU效價滴定，測定的病毒體外增殖曲線結(jié)果顯示，兩個毒株均具有相似的增殖曲線，表明meq基因的編輯缺失不影響其體外復(fù)制能力。雖然通過兩種方法檢測的病毒體外增殖曲線的變化趨勢不完全相同，這可能與前者可檢測到全部病毒總DNA而后者僅能檢測到有活性的病毒有關(guān)。更進(jìn)一步的SPF雞攻毒試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在持續(xù)77 d的整個試驗(yàn)周期內(nèi)，親本毒株HNSQ01攻毒雞至64 d時全部發(fā)病死亡，致病率和致死率均為100%，MD腫瘤發(fā)生率高達(dá)80%，這與此前期報道的結(jié)果基本一致［5］，而SQ01Δmeq攻毒雞和CEF模擬對照組在試驗(yàn)全程均未見發(fā)病或死亡，存活雞剖檢中也未觀察到任何雞發(fā)生內(nèi)臟腫瘤，并且最終對隨機(jī)挑選的雞的肝、脾組織進(jìn)行病理切片和HE染色觀察，也未發(fā)現(xiàn)任何T淋巴細(xì)胞浸潤及腫瘤發(fā)生，這充分表明meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq對宿主沒有致病性和致瘤性，生物安全性良好。

同時，在攻毒后14 d和21 d對各組試驗(yàn)雞免疫器官指數(shù)監(jiān)測的結(jié)果也顯示，HNSQ01導(dǎo)致了感染雞嚴(yán)重的胸腺和法氏囊萎縮，并且脾明顯增大，三項(xiàng)免疫器官指數(shù)與SQ01Δmeq攻毒組和CEF陰性對照組均存在顯著性差異，而SQ01Δmeq攻毒組與CEF陰性對照組之間，除了脾稍有增大之外其他兩項(xiàng)免疫器官指數(shù)均無顯著性差異，這很可能與我們在meq基因編輯前后對HNSQ01在CEF上進(jìn)行了連續(xù)傳代有關(guān)，有效消除了SQ01Δmeq對宿主潛在的免疫抑制性，與此前研究報道的結(jié)果相似［9，17］。此外，整個試驗(yàn)過程中SQ01Δmeq攻毒雞生長狀況良好且體重增加正常，與HNSQ01嚴(yán)重影響雞體重增加形成了鮮明的對比。上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)充分說明，meq基因的編輯缺失完全消除了HV-MDV變異株HNSQ01的對宿主的免疫抑制性、致病性和致瘤性。下一步，非常有必要盡快開展SQ01Δmeq對其親本毒株以及其它vv+MDV和HV-MDV變異株的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，并且同時與其他MD商品疫苗尤其是最新研發(fā)的meq基因缺失疫苗進(jìn)行對比試驗(yàn)，以評估其商業(yè)應(yīng)用前景。綜上所述，本文以HV-MDV變異株為親本毒株，建立了meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq，為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型高效MD疫苗的設(shè)計和創(chuàng)制奠定了重要基礎(chǔ)。

4" 結(jié)" 論

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，本文以HV-MDV變異株HNSQ01為親本毒株成功構(gòu)建了一個穩(wěn)定傳代的meq基因缺失毒株并命名為SQ01Δmeq。相關(guān)研究結(jié)果表明，meq基因的編輯缺失未影響SQ01Δmeq的體外復(fù)制、噬斑形成及其它病毒基因的正常表達(dá)，對宿主雞無致病性和致瘤性，且不會引起免疫器官萎縮，生物安全性良好，為后續(xù)創(chuàng)制新型高效的MD疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。

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（編輯" 白永平）