[摘要]目的：探究海藻糖敷料對激光損傷兔動物模型皮膚的修復(fù)作用，并探索其體外促細胞生長、遷移和抗炎作用。方法：試驗兔脊柱兩邊各脫毛4個區(qū)域，隨機分為正常組（N）、模型組（M）、對照組（P）和實驗組（T）。除正常組外，其余各組使用激光照射造模；對照組及實驗組分別使用透明質(zhì)酸敷料及海藻糖敷料貼敷。于第0天、第3天、第7天、第14天和第21天對創(chuàng)面進行紅斑和焦痂、水腫程度評分，以評價海藻糖敷料對皮膚修復(fù)效果。以L929細胞及HaCaT細胞為研究對象探索海藻糖敷料體外促細胞生長、遷移和抗炎作用。將細胞分為空白組（培養(yǎng)基）、正常組（細胞液+培養(yǎng)基）、對照組（細胞液+培養(yǎng)基+透明質(zhì)酸）及實驗組（細胞液+培養(yǎng)基+海藻糖）。使用MTT比色法檢測各組L929細胞24 h、48 h及72 h增殖率，劃痕試驗檢測各組L929細胞6 h、12 h和24 h遷移力；使用TNF-α及IFN-γ誘導(dǎo)HaCaT細胞建立炎癥反應(yīng)模型后，24 h后檢測各組IL-6、IL-8和MDC表達水平。結(jié)果：創(chuàng)面給予敷料后7 d，實驗組水腫評分[（1.1±0.3）分]較模型組[（1.2±0.4）分]顯著降低（P＜0.05）；第14天，相較于模型組，實驗組及對照組水腫、紅斑焦痂評分有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。病理結(jié)果顯示，對照組、實驗組較模型組第14天炎細胞浸潤微有減少。細胞實驗結(jié)果顯示，與正常組相比，對照組和實驗組4 h、48 h及72 h的細胞增殖率均有明顯增加；與正常組相比，對照組及實驗組6 h、12 h和24 h的細胞遷移率均有明顯增加（P＜0.05）；與細胞炎癥模型組相比，實驗組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論：海藻糖敷料對激光所致兔皮膚屏障受損創(chuàng)面的組織炎癥、愈合有一定修復(fù)作用；其機制可能與其能促進細胞增殖、細胞遷移及抑制炎癥的功能相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]海藻糖；激光術(shù)；皮膚修復(fù)；細胞增殖；細胞遷移；炎癥

[中圖分類號]R751.05" " [文獻標(biāo)志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2024）11-0001-05

Research of the Effects of Trehalose Dressing on Skin Repair after Laser Surgery in Rabbits and Its Effects on Cell Proliferation， Migration and Anti-inflammatory in Vitro

XIAO Min1， CHEN Zhonghua2，3，4， WANG Yan2，3，4， LI Li1， ZHU Weiwei1

[ 1. Department of Pharmacy， West China Hospital， Sichuan University， Chengdu 610041， Sichuan， China; 2. Key Laboratory of Drug Targeting and Drug Delivery System （Sichuan University） Ministry of Education， West China School of Pharmacy， Sichuan University， Chengdu 610041， Sichuan， China; 3. Sichuan Engineering Laboratory for Plant-Sourced Drug， West China School of Pharmacy， Sichuan University， Chengdu 610041， Sichuan， China; 4. Sichuan Research Center for Precision Industrial Technology， West China School of Pharmacy， Sichuan University， Chengdu 610041， Sichuan， China ]

Abstract： Objective" To evaluate the effects of trehalose dressing on skin repair after laser surgery in rabbits， and to explore its effects on cell proliferation， migration and anti-inflammatory in vitro. Methods" Four areas of hair were removed on each side of the spine in rabbits， which were randomly divided into normal group （N）， model group （M）， control group （P） and experimental group （T）. Except for the normal group， rabbits in the rest of the groups were irradiated by laser. The control group and the experimental group was treated by hyaluronic acid dressing and trehalose dressing respectively. To evaluate the effect of trehalose dressings on skin repair， erythema， eschar and edema was scored on day 0， 3， 7， 14， 21. L929 cells and HaCaT cells were used to explore effects of trehalose on cell proliferation， migration and anti-inflammatory in vitro. Cells were divided into blank group（cell culture medium， CCM）， normal group （cell+CCM）， control group （cell+CCM+ hyaluronic acid） and experimental group （cell+CCM+trehalose）. The growth of L929 cells was assayed by MTT method at 24h，48h and 72 h. The migration of L929 cells was assyed by cell scratch experiment at 6 h，12 h and 24 h. Level of IL-6， IL-8 and MDC was tested after TNF-α and IFN-γ induced inflammation in HaCaT cells after 24h. Results" On the 7th day， the edema score （1.1±0.3） in the experimental group was significantly lower than that in the model group （1.2±0.4） （P＜0.05）. On the 14th day， the edema， erythematous and eschar score of the experimental group and the control group had a downward trend compared with the model group， but there were no significant difference （P＞0.05）. The pathological results showed that， on the 14th day， the control group and the experimental group were slightly reduced in inflammatory cell infiltration compared with the model group. Results of cell experiment showed that compared with the normal group， proliferation rate of L929 cells was significantly increased in control group and experimental group at 24 h， 48 h and 72 h （P＜0.05）. Compared with the normal group， migration rate of L929 cells was significantly increased in control group and experimental group at 6 h，12 h and 24 h （P＜0.05）. Compared with the cellular inflammatory model group， level of IL-6， IL-8 and MDC was significantly decreased in experimental group （P＜0.01）. Conclusion" Trehalose have a certain repair effect on tissue inflammation and healing of laser-induced rabbit skin damage which may be related to its ability to promote cell proliferation， cell migration， and inhibit inflammation.

Key words： trehalose; laser surgery; skin repairing; cell proliferation; cell migration; inflammation

近年來，激光治療廣泛用于去除色斑、瘢痕痤瘡治療、除皺及改善光老化等皮膚問題。因其微創(chuàng)、治療痛苦小、治療效果佳等優(yōu)勢已成為醫(yī)療美容領(lǐng)域的熱點[1]。但激光治療術(shù)后會形成類似輕度燒傷的創(chuàng)面，引起皮膚紅斑、水腫，甚至滲血、脫屑、色素沉著、瘢痕形成等[2]。創(chuàng)傷修復(fù)過程中，成纖維細胞是參與修復(fù)的重要細胞，該細胞的增殖與遷移是組織修復(fù)與纖維化的重要病理基礎(chǔ)[3]。表皮角質(zhì)形成細胞（HaCaT細胞）為構(gòu)成皮膚表皮的主要細胞，主要起到抵御外源性損傷的作用，當(dāng)皮膚受到刺激后，HaCaT細胞會產(chǎn)生多種細胞因子，誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[4]；若炎癥因子過度活化，則會使成纖維細胞向組織局部大量遷移、侵襲，這是形成組織瘢痕及組織纖維化的主要因素之一[5]。

海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過α，α-1，1糖苷鍵連接的非還原性二糖，具有非特異性的抗脫水、抗冷凍、抗高滲保護、抗氧化、保濕等功能[3]，目前已廣泛用于日化產(chǎn)品中，在激光術(shù)后皮膚修復(fù)方面可能具有一定作用。本研究使用激光制造兔皮膚屏障損傷模型，評價海藻糖皮膚損傷修復(fù)作用；并以小鼠上皮樣成纖維細胞（L929細胞）為研究對象探索其體外對成纖維細胞增殖、遷移影響，以HaCaT細胞為研究對象，探索其體外抗炎作用，為海藻糖敷料用于激光術(shù)后皮膚修復(fù)提供理論依據(jù)。

1" 資料和方法

1.1 試驗動物及細胞、主要試劑與儀器：普通級新西蘭兔14只，2.0～2.5 kg，雌雄各半，由邳州市東方養(yǎng)殖有限公司提供，合格證號為SCXK（蘇）2017-0002。L929細胞（小鼠上皮樣成纖維細胞）由四川大學(xué)華西藥學(xué)院孫遜教授實驗室贈予。HaCaT細胞（人永生化角質(zhì)形成細胞）由四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院張舒羽教授贈予。DMEM培養(yǎng)基，批號319-005-CL，WISENT（Canada）；二甲基亞砜（DMSO），批號2094C359，Amresco（USA）；Penicillin-Streptomycin，批號SK180925，MRC（Netherlands）；胎牛血清，批號10099，Gibco Thermo Fisher Scientific，Inc.；DMEM，批號319-005-CL，WISENT（Canada）；胰酶，批號SNT-001，尚恩生物（中國武漢）；海藻糖敷料（產(chǎn)品名稱：皮膚修護無菌敷料，陜械注準(zhǔn)20212140098，211201，西安德諾海思）；透明質(zhì)酸敷料（產(chǎn)品名稱：皮膚修護敷料，陜械注準(zhǔn)20142140032，211148，陜西佰傲再生醫(yī)學(xué)）；MTT（HY-15924，美國MCE）；人白細胞介素6（IL-6）；酶聯(lián)免疫分析試劑盒（SP10234，塞培生物）；人巨噬細胞來源的趨化因子（MDC）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（SP10226，塞培生物）；IFN-γ蛋白（HY-P7025，美國MCE）；TNF-α蛋白（HY-P7058，美國MCE）；家用激光筆，型號DH-006，廣州市白云區(qū)韓大電子廠造；切片機，Leica Rm2235、Leica-Asp200型全自動封閉式組織脫水機、Leica-EG1160型石蠟包埋機、Leica HI1220型病理組織烤片機，均由德國徠卡公司生產(chǎn)；ST-360酶標(biāo)儀（上海科華）；SW-CJ型潔凈工作臺（蘇州安泰）；MCO-15AC型二氧化碳孵箱（日本Sanyo）；OBSERVER D1/AX10 cam HRC倒置顯微熒光鏡（德國卡爾蔡司）；BDS 300倒置生物顯微鏡（重慶奧特）；L500臺式低速離心機（湖南湘儀）；DK-8AXX電熱恒溫水槽（上海恒科）。

1.2 方法

1.2.1 皮膚修復(fù)試驗：14只新西蘭兔，脊柱兩邊各脫毛4個區(qū)域（2 cm×2 cm），隨機分為正常組（N）、模型組（M）、對照組（P）和實驗組（T）。除正常組外，其他組使用激光筆90°垂直于背部脫毛區(qū)域照射，每次照射前在照射部分涂抹冷凝膠進行保護，最終使皮膚出現(xiàn)灼傷，呈較嚴(yán)重紅斑，形成淺表性損傷。造模后，按照分組貼敷樣品：對照組貼透明質(zhì)酸敷料，實驗組貼海藻糖敷料，正常及模型組不做處理，每次貼敷20 min，第1周每天貼敷1次，之后第10天貼敷1次，共計9次。參考《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）“皮膚刺激性/腐蝕性試驗”評分標(biāo)準(zhǔn)，于0 d、3 d、7 d、14 d和21 d對創(chuàng)面進行紅斑和焦痂、水腫程度評分，以考察創(chuàng)面恢復(fù)情況。在各觀察點進行創(chuàng)面及周圍皮膚全層皮下組織取材，福爾馬林液固定，石蠟包埋并切片后進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚屏障損傷修復(fù)及炎癥恢復(fù)情況。

1.2.2 MTT比色法檢測L929細胞增殖率：L929細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，保持培養(yǎng)箱37℃、5% CO2、pH值7.2～7.4，相對濕度95%～98%；取處于對數(shù)生長期的L929細胞，胰酶消化、離心，調(diào)整細胞濃度約為l×104個/毫升。分別設(shè)空白組（僅含培養(yǎng)基）、正常組（細胞液+培養(yǎng)基）、對照組（細胞液+培養(yǎng)基+透明質(zhì)酸原液）、實驗組（細胞液+培養(yǎng)基+海藻糖原液），其中透明質(zhì)酸原液及海藻糖原液∶培養(yǎng)基=1∶9（V/V）。

于空白組孔中加入200μl培養(yǎng)基，其余組各孔中加入200μl細胞液，置孵箱孵育過夜，待細胞貼壁后，棄去每孔（除空白組）中的培養(yǎng)基。加樣孔分別加入已經(jīng)配好的樣液200μl。加樣完成后CO2孵箱中放置24 h、48 h、72 h后每孔加入MTT 20μl，繼續(xù)孵育3 h后棄去含MTT的細胞培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl后置搖床低速震蕩10～15 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測定各孔吸光度OD值，計算細胞增殖率[7]：細胞增殖率=（加樣組OD值-正常組OD值）/正常值OD值×100%。

1.2.3 劃痕試驗檢測L929細胞遷移力：L929細胞培養(yǎng)同1.2.2。將細胞接種到12孔板中（1×104個/孔），分為：正常組（細胞液+培養(yǎng)基）、對照組（細胞液+培養(yǎng)基+透明質(zhì)酸原液）及實驗組（細胞液+培養(yǎng)基+海藻糖原液）。置孵箱孵育，待其完全貼壁且長滿孔板后，用1 ml注射器針頭沿孔板中軸垂直劃線，用PBS清洗3次去除脫落細胞。更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)和含樣品無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，于0、6、12、24 h在10倍光學(xué)顯微鏡下拍照。用PS軟件測量0、6、12、24 h后的劃痕面積，計算細胞遷移率[7]：細胞遷移率=固定劃痕區(qū)細胞移行總面積/初始劃痕面積×100%。

1.2.4 IL-6、IL-8和MDC表達水平測定[8]：使用TNF-α及IFN-γ誘導(dǎo)HaCaT細胞，建立細胞炎癥模型，檢測各組IL-6、IL-8及MDC的表達水平。HaCaT細胞培養(yǎng)方法同上述L929細胞。分為空白組（培養(yǎng)基）、正常組（細胞液+培養(yǎng)基）、模型1組（細胞液+培養(yǎng)基+TNF-α）、模型2組（細胞液+培養(yǎng)基+IFN-γ）、實驗1組（細胞液+培養(yǎng)基+TNF-α+海藻糖原液）、實驗2組（細胞液+培養(yǎng)基+IFN-γ+海藻糖原液）。

將HaCaT細胞接種于六孔板中，106個/孔，37℃、5% CO2條件下過夜培養(yǎng)。細胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入不含血清DMEM培養(yǎng)基2 ml。模型組和實驗組均先加入TNF-α及IFN-γ造模，終濃度均為10 ng/ml，正常組及空白組加入等量PBS。實驗組中取海藻糖敷料原液，按1∶9比例加入細胞培養(yǎng)基中。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后收集細胞培養(yǎng)上清液。按ELISA試劑盒說明書檢測上清液中IL-6、IL-8和MDC表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，使用單因素方差分析比較多組之間的平均數(shù)。作圖使用Graph pad Prism 5.0，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1 皮膚修復(fù)影響：激光造創(chuàng)后，皮膚肉眼可見較嚴(yán)重淡褐紅色灼傷斑，3 d內(nèi)紅斑顏色加深、結(jié)痂并伴有輕微水腫，第4～7天持續(xù)伴有紅斑結(jié)痂和水腫，第8天痂殼開始逐漸脫落，創(chuàng)面范圍慢慢縮小，水腫程度徐徐減輕，第21天紅斑結(jié)痂、水腫消失，創(chuàng)面完全愈合。見圖1。創(chuàng)面給予敷料后7 d，模型組和對照組水腫評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），實驗組水腫評分顯著低于模型組（P＜0.05）。第14天，相較于模型組，對照組及實驗組水腫評分有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；相較于模型組，對照組及實驗組紅斑焦痂評分也有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1～2。病理結(jié)果顯示：造創(chuàng)后第0天，模型組表皮和部分真皮凝固性壞死，真皮膠原纖維腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂，可見極少量炎細胞浸潤，說明激光照射可損傷皮膚結(jié)構(gòu)，并引發(fā)炎癥，提示造模成功。模型組、對照組和實驗組在造創(chuàng)后第3天均可見表皮和部分真皮凝固性壞死，大量炎細胞浸潤及部分肉芽組織填充；第7天出現(xiàn)部分上皮化和角質(zhì)化；第14天三組均完全上皮化及角化，對照組、實驗組較模型組炎細胞浸潤微有減少；第21天三組均有較多毛囊和膠原纖維形成。見圖2。

2.2 細胞增殖率影響：在24 h、48 h及72 h，對照組、實驗組的細胞增殖率均高于正常組（均P＜0.05），對照組與實驗組細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 細胞遷移力影響：在6 h、12 h和24 h，對照組、實驗組的細胞遷移力均高于正常組（均P＜0.05），對照組與實驗組細胞遷移力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

2.4 炎癥因子影響：與正常組相比，模型1組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平明顯升高（均P＜0.001），與模型1組相比，實驗1組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平明顯降低（均P＜0.001），實驗1組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組相比，模型2組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平明顯升高（均P＜0.001），與模型2組相比，實驗2組細胞上清液中IL-6、IL-8和MDC的表達水平也明顯降低（P＜0.01）。見表5。

3" 討論

選擇性光熱作用理論是激光治療的理論基礎(chǔ)，運用激光器發(fā)出特定的波長的光波，作用于皮膚靶組織，光能在皮膚靶組織中被吸收并轉(zhuǎn)化為熱能，使靶組織被破壞或剔除。雖然激光治療具有療效好、副作用小、治療安全性高等優(yōu)點，但術(shù)后護理措施不恰當(dāng)，紅斑、感染、色素沉著、瘢痕形成等不良反應(yīng)風(fēng)險將增加。針對激光術(shù)后的護理，除了常規(guī)的冰敷、防曬等措施外，市場上能確切緩解激光術(shù)后皮膚損傷及促進皮膚修復(fù)的產(chǎn)品較少[10]。目前，該類產(chǎn)品主要以含透明質(zhì)酸的產(chǎn)品為主，少部分產(chǎn)品以含膠原蛋白、甘油等為主；且大部分的醫(yī)用功能性敷料不含有修復(fù)液，因此在促進創(chuàng)面細胞恢復(fù)方面無明顯優(yōu)勢[11]。

在高溫、高壓、干燥等惡劣條件下，海藻糖可通過穩(wěn)定細胞膜、維持蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的活性，繼續(xù)維持生命過程和有機體生物學(xué)特征，因此它有“生命之糖”的稱號。該功能使得海藻糖可用于疫苗、血清、細胞甚至器官的保存。其膜保護機制主要有三種假說：水替代學(xué)說、玻璃轉(zhuǎn)換學(xué)說及優(yōu)先排阻學(xué)說[12]。水替代學(xué)說認為海藻糖通過替代細胞膜中的水分與膜上磷脂等結(jié)構(gòu)結(jié)合來維持細胞的結(jié)構(gòu)；玻璃轉(zhuǎn)換學(xué)說認為海藻糖會在高溫下形成運動微弱、擴散系數(shù)低的玻璃態(tài)，從而保護蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)；優(yōu)先排阻學(xué)說認為海藻糖不是直接結(jié)合生物分子而是將殘留水阻滯在生物分子之間來發(fā)揮作用[12]。同時，有研究報道了海藻糖還具有促細胞生長的作用，但其機制尚不清楚[13]。因此，海藻糖敷料可能對激光術(shù)后皮膚修復(fù)具有一定效果。本實驗將兔使用激光造模后，評估其對創(chuàng)面水腫、紅斑及焦痂效果，結(jié)果顯示：造創(chuàng)后7 d，實驗組較模型組水腫評分明顯降低，而對照組水腫評分降低不明顯；造創(chuàng)后14 d，實驗組及對照組較模型組炎細胞浸潤均微有減少；上述結(jié)果提示海藻糖敷料較透明質(zhì)酸在激光術(shù)后皮膚水腫修復(fù)效果更佳，同時可能有促進炎癥消退的作用。

傷口的愈合包含止血期、炎癥期、上皮形成期、纖維增生期和成熟期[14-15]。在炎癥反應(yīng)階段，中性粒細胞、巨噬細胞等移行至傷口處，同時炎癥反應(yīng)因子釋放，導(dǎo)致組織水腫；炎癥期通常在3 d內(nèi)結(jié)束，感染等因素可造成炎癥期延長、傷口愈合減慢[16]。在上皮形成階段，基底細胞增殖和上皮細胞移行是兩個重要事件，該過程最終形成上皮淺層，阻擋細菌和其他異物[17]。

本文從細胞生長、遷移及炎癥因子水平影響方面進行進一步研究。結(jié)果顯示，海藻糖組細胞增殖率及遷移率相較于正常組均有明顯升高，IL-6、IL-8及MDC的表達水平均較細胞炎癥模型組顯著降低，提示海藻糖敷料促進激光術(shù)后皮膚修復(fù)的機制可能為：①促進上皮細胞的增殖與遷移；②抑制炎癥因子如IL-6、IL-8和MDC等的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，加速皮膚修復(fù)。因此，海藻糖敷料對于激光術(shù)后皮膚修復(fù)可能具有一定效果。

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[收稿日期]2023-01-17

本文引用格式：肖敏，陳重華，王燕，等.海藻糖敷料對激光損傷兔皮膚屏障功能的修復(fù)及體外促細胞生長、遷移和抗炎作用研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2024，33（11）：1-5.