關(guān)鍵詞：靈芝；多糖；響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化；抗氧化活性

0 引言

靈芝（Ganodermalucidum）是著名的高等藥用真菌之一，古稱“瑞草”，俗稱“仙草”，我國首部中草藥文集《神農(nóng)本草經(jīng)》將靈芝列為上品[1]。近30年來研究人員對靈芝進(jìn)行了大量的研究，結(jié)果證明，靈芝具有多種藥理作用，如增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤、改善睡眠、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、防治心血管疾病、抗炎癥及保護(hù)肝臟等功效[2-12]。靈芝子實(shí)體多糖是靈芝的主要活性成分，也是研究最深入的一類化合物。靈芝子實(shí)體多糖的種類很多，從赤芝中分離靈芝子實(shí)體多糖GL-1以來，已經(jīng)分離出的靈芝子實(shí)體多糖達(dá)220多種[13]。已知靈芝子實(shí)體多糖的藥理活性有調(diào)節(jié)免疫力、抑制腫瘤、抑制細(xì)菌生長、保護(hù)肝臟作用、降低血糖、神經(jīng)保護(hù)和抗氧化等[14-19]。由于靈芝子實(shí)體多糖的提取和純化工藝較為復(fù)雜，因此研究最優(yōu)的提取工藝對于高效、高產(chǎn)地提取靈芝子實(shí)體多糖具有至關(guān)重要的意義。同時，這也將為靈芝子實(shí)體多糖的深入研究和有效利用提供科學(xué)的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

靈芝子實(shí)體，浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司；無水乙醇、苯酚、濃硫酸等，均為國產(chǎn)分析純；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，廣州化學(xué)試劑廠。

METTLERAE100型電子分析天平，梅特勒托利多公司；DFT-100型手提式高速中藥粉碎機(jī)，大德藥機(jī)有限公司；新一佳HH-2型恒溫水浴鍋，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；H-1微型渦旋混合器，上海嘉鵬科技有限公司；UV-7500型紫外可見分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝子實(shí)體多糖含量測定

1.2.1.1 供試樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取500mg（精確至±0.001g）樣品，加40倍水，在100°C下浸提3次，每次浸提1.0h，合并3次提取液。提取液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻；精密量取2mL，加入乙醇30mL，搖勻；4°C放置12h，取出，離心（4000r/min5min）。倒去上清液，加水溶解沉淀，沉淀溶解后轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，定容搖勻，即得靈芝子實(shí)體多糖待測液。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

100mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液制備：準(zhǔn)確稱取0.1000g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于100mL燒杯中，加水溶解，定容至1000mL容量瓶，儲存于4°C冰箱中備用。

分別精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于20mL具塞玻璃試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0mL。向試管中加入1.0mL5%苯酚溶液和5.0mL硫酸，靜置10min，充分混合，將試管放置于30°C水浴中，并保持20min，于490nm測吸光度，以蒸餾水作為空白對照，以葡聚糖或葡萄糖質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.3 硫酸苯酚法測定靈芝子實(shí)體多糖含量

精密吸取1mL待測液于20mL具塞玻璃試管中，按1.2.1.2的方法測定其吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出待測液中葡萄糖含量C（mg），總多糖含量E計(jì)算公式如下

1.2.2 熱水浸提法單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 浸提料液比對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響

精密稱取500mg靈芝子實(shí)體粉末，分別按料液比（水∶靈芝）10、20、30、40和50mL/g加入水進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在80°C條件下熱水浸提3次，3次提取時間均為1.0h，過濾、合并3次濾液，將濾液定容到適宜容量瓶中，測定吸光度，計(jì)算提取率，每個試驗(yàn)3個重復(fù)。

1.2.2.2 浸提時間對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響

精密稱取500mg靈芝子實(shí)體粉末，按料液比（水∶靈芝）40mL/g加水，在80°C條件下熱水浸提3次，分別提取20、30、40、50和60min，過濾、合并3次濾液，將濾液定容到適宜容量瓶中，測定吸光度，計(jì)算提取率，每個試驗(yàn)3個重復(fù)。

1.2.2.3 浸提溫度對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響

精密稱取500mg靈芝子實(shí)體粉末，按料液比（水∶靈芝）40mL/g，分別在60、70、80、90和100°C條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，熱水浸提3次，每次1.0h，過濾、合并3次濾液，將濾液定容到適宜容量瓶中，測定吸光度，計(jì)算提取率，每個試驗(yàn)3個重復(fù)。

1.2.2.4 溶劑提取次數(shù)對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響

精密稱取500mg靈芝子實(shí)體粉末，按料液比（水∶靈芝）40mL/g，在80°C條件下分別浸提1、2、3和4次條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每次提取時間為1.0h，過濾、合并3次濾液，將濾液定容到適宜容量瓶中，測定吸光度，計(jì)算提取率，每個試驗(yàn)3個重復(fù)。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝子實(shí)體多糖提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）進(jìn)行3因素3水平編碼，因素水平及編碼如表1所示。采用響應(yīng)面優(yōu)化法對靈芝子實(shí)體多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。最后以靈芝子實(shí)體多糖提取率為響應(yīng)值，利用軟件Design-expertV12對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定最佳提取工藝。

1.2.4 靈芝子實(shí)體多糖抗氧化活性試驗(yàn)

1.2.4.1 總還原力

參考ZOUC等[20]的測定方法并做部分修改，取2mL待測樣品加入2mLpH值6.6的磷酸緩沖溶液（c=0.20mol/L）然后加入1%鐵氰化鉀2mL充分混勻，再在50°C的恒溫情況下加熱20min。之后將混合物快速冷卻至室溫并加入10%三氯乙酸2mL，進(jìn)行充分混勻。然后在4°C下以3000r/min的速度離心10min，并取2mL上層清液加入2mL蒸餾水。接著加入0.1%FeCl30.4mL，混合均勻并靜置10min。最后在700nm波長下測定吸光度A700，每個處理進(jìn)行3個重復(fù)試驗(yàn)。使用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，維生素C作為陽性對照。

1.2.4.2 對DPPH自由基清除作用

參考BRAND-WILLIAMSW等[21]的測定方法并做部分修改，配制濃度為0.2mmol/L的DPPH溶液于棕色瓶中，4°C保存。然后在10mL的試管中加入2mL樣品待測液后加入2mLDPPH溶液均勻混合。置于暗處反應(yīng)30min后在517nm處測定其吸光度（Ai），同時測定空白吸光度（Ac）及DPPH溶液本底吸光度（Aj）。

DPPH自由基清除率計(jì)算公式為

1.2.4.3 對羥基自由基（·OH）的清除作用

參考SMIRNOFFN等[22]的測定方法并做部分修改，取1mL樣品溶液，依次加入6mmol/L的FeSO4溶液1mL，混合均勻后再加入6mmol/L的H2O2溶液1mL，再次混勻，靜置10min，再加入6mmol/L的水楊酸溶液1mL，搖勻，靜置30min后，于510nm處測其吸光值。清除率計(jì)算公式為

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，葡萄糖含量在0～100μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果較準(zhǔn)確。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 最佳料液比確定

分別采用不同的料液比，考察靈芝子實(shí)體多糖提取率，研究料液比對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，料液比10～50mL/g，當(dāng)其他條件相同時，隨著料液比的增大，靈芝子實(shí)體多糖提取率也增大。當(dāng)料液比lt;20mL/g時，由于溶劑水無法完全浸沒靈芝樣品，導(dǎo)致多糖提取率低；當(dāng)料液比gt;20mL/g時，靈芝子實(shí)體多糖提取率呈現(xiàn)先顯著升高然后趨于平衡趨勢。當(dāng)料液比gt;40mL/g時，多糖提取率增加不明顯，考慮到能耗，確定最佳料液比40mL/g。

2.2.2 浸提最佳時間確定

分別采用不同的浸提時間，考察靈芝子實(shí)體多糖提取率，研究浸提時間對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，提取時間20～60min，當(dāng)其他條件一定時，隨著時間的延長多糖提取率也呈上升趨勢，在提取時間60min時，提取率最大。因此確定浸提最佳時間60min。

2.2.3 浸提最佳溫度確定

分別采用不同的浸提溫度，考察靈芝子實(shí)體多糖提取率，研究浸提溫度對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，提取溫度60～100°C，其他條件不變時，隨著靈芝子實(shí)體提取溫度的升高，靈芝子實(shí)體多糖提取率也升高，其中多糖提取率在100°C條件下比90°C有較大升高，因此確定最佳浸提溫度100°C。

2.2.4 浸提最佳提取次數(shù)確定

分別浸提不同的次數(shù)，考察靈芝子實(shí)體多糖提取率，研究浸提次數(shù)對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增多，靈芝子實(shí)體多糖含量提取率呈上升的趨勢，其中到達(dá)3次時，提取已經(jīng)非常的充分。當(dāng)提取超過3次以后，多糖提取率變化不大，考慮到能耗，取浸提最佳提取次數(shù)3次。

2.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

按照響應(yīng)面試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，靈芝子實(shí)體多糖提取結(jié)果如表2所示。

2.3.1 模型建立與顯著性分析

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Design-expertV12軟件對自變量編碼的X1、X2、X3進(jìn)行回歸分析并建立模型，得到回歸方程

通過Design-ExpertV12軟件進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表3所示。

由表3可知，模型Plt;0.01，說明該模型的回歸方程是極顯著的。失擬項(xiàng)為0.0110lt;0.05，模型R2為0.99gt;0.90，說明模型的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。3個因素對多糖提取率的影響從大到小依次為液料比、提取溫度和提取時間。此外，X1、X2、X3、X1X2、X2X3、X、X的P值均lt;0.01，說明它們對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響極顯著；X的0.01

2.3.2 因素間交互作用的響應(yīng)面分析

液料比X1、溫度X2、提取時間X3的交互效應(yīng)分析結(jié)果如圖6、圖7和圖8所示。

由圖6、圖7和圖8可知，X1X2、X1X3和X2X3對多糖提取率交互效應(yīng)的交互所成圖像均是拋物線，說明提取料液比、提取溫度和提取時間對靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響均比較大，在具體試驗(yàn)操作中，適當(dāng)增加液料比、提取溫度和提取時間，多糖提取率都會隨之增加。

2.3.3 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert的Numerical對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知，最適提取料液比50mL/g、提取時間60min、提取溫度100°C，在此條件下多糖提取率3.22%。在此理論最佳條件下進(jìn)行試驗(yàn)，靈芝子實(shí)體多糖提取率2.96%，與模型預(yù)測值僅相差0.26個百分點(diǎn)，表明此方法可行。

2.4 靈芝粗多糖抗氧化活性測定

2.4.1 總還原力

由圖9可知，樣品質(zhì)量濃度0.04～0.20mg/mL時，靈芝子實(shí)體多糖和維生素C總還原能力隨著濃度增加呈現(xiàn)上升趨勢，在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)靈芝子實(shí)體多糖總還原能力相對于維生素C總還原能力低，在0.04mg/mL濃度時為0.46，0.2mg/mL時為0.82。

2.4.2 對DPPH自由基清除作用

由圖10可知，濃度0～1mg/mL時，DPPH自由基清除率隨著靈芝子實(shí)體多糖含量的升高而呈上升趨勢，維生素C對DPPH自由基清除率能力顯著高于靈芝子實(shí)體多糖，在濃度0.2mg/mL時維生素C對DPPH自由基清除率高達(dá)95.21%，而同濃度下靈芝子實(shí)體多糖對DPPH自由基清除率15.75%。當(dāng)質(zhì)量濃度1mg/mL時，靈芝子實(shí)體多糖對DPPH自由基清除率69.13%，維生素C對DPPH自由基清除率高達(dá)98.37%。經(jīng)計(jì)算靈芝子實(shí)體多糖對DPPH自由基清除率50%時，IC50=0.67mg/mL，顯示靈芝子實(shí)體多糖對DPPH自由基具有一定清除作用。

2.4.3 對羥基自由基（·OH）清除作用

由圖11可知，濃度0～0.24mg/mL時，羥基自由基（·OH）清除率隨著靈芝子實(shí)體多糖含量的升高也呈上升趨勢；濃度0.04mg/mL時，靈芝子實(shí)體多糖對羥基自由基（·OH）清除率24.9%，維生素C對羥基自由基（·OH）清除率46.2%；濃度0.2mg/mL時，靈芝子實(shí)體多糖對羥基自由基清除率33.8%，維生素C對羥基自由基（·OH）清除率54.5%。經(jīng)計(jì)算靈芝子實(shí)體多糖對羥基自由基（·OH）清除率50%時，IC50=0.46mg/mL，顯示靈芝子實(shí)體多糖對羥基自由基（·OH）比對DPPH自由基具有更好清除作用。

3 結(jié)束語

數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，最適提取料液比（水∶靈芝）50mL/g、提取時間60min、提取溫度100°C，在此條件下多糖提取率2.96%。本研究采用響應(yīng)面法對靈芝子實(shí)體提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，工藝優(yōu)化結(jié)果具有提取率高、穩(wěn)定可行、設(shè)備簡單和成本相對可控等優(yōu)點(diǎn)。靈芝子實(shí)體多糖對DPPH自由基、羥基自由基（·OH）的IC50分別為0.67和0.46mg/mL，表明靈芝粗多糖具有較強(qiáng)抗氧化能力，為靈芝子實(shí)體多糖在功能性食品及多元化開發(fā)利用中打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。