摘 要：本研究采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Solid Phase Extraction-Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，SPE-UHPLC-MS/MS）對(duì)豬肉中氯苯胺靈的殘留進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化氣相色譜-質(zhì)譜條件，建立了氯苯胺靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，氯苯胺靈在0.50～100.00 μg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.996 4。平均加標(biāo)回收率為85.25%～92.75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.83%～3.07%。該方法回收率好、精密度高，適用于豬肉中氯苯胺靈的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；豬肉；氯苯胺靈

Application of SPE-UHPLC-MS/MS in the Determination of Chlorpheniramine Residues in Pork

WANG Dan

（Qin’an County Food and Drug Inspection and Testing Centre， Qin’an 741600， China）

Abstract： This study used solid phase extraction ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （SPE-UPLC-MS/MS） to detect residues of chlorpheniramine in pork. By optimizing the gas chromatography-mass spectrometry conditions， a standard curve for chlorpheniramine was established. The results showed that chlorpheniramine had a good linear relationship between 0.50 μg·L-1 and 100.00 μg·L-1， with a correlation coefficient of 0.996 4. The average recovery rate of spiked samples is 85.25% to 92.75%， and the relative standard deviation is 1.83%～3.07%. This method has good recovery rate and high precision， and is suitable for rapid and accurate detection of chlorpheniramine in pork.

Keywords： solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; pork; chlorpheniramine

氯苯胺靈是一種廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)領(lǐng)域的抗組胺藥物，主要用于治療動(dòng)物的過(guò)敏性疾病。然而，由于其在動(dòng)物體內(nèi)的殘留對(duì)人體健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)，特別是在食品安全日益受到重視的背景下，監(jiān)測(cè)食品中藥物殘留成為重要的研究課題。豬肉作為人們?nèi)粘ｏ嬍持谐Ｒ?jiàn)的肉類(lèi)食品，其安全性直接影響到消費(fèi)者的健康[1-2]。在國(guó)際上，為了檢測(cè)氯苯胺靈及其他獸藥殘留，已經(jīng)開(kāi)發(fā)并應(yīng)用了多種分析方法。傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)，如氣相色譜和液相色譜，雖然具有一定靈敏度和選擇性，但在處理復(fù)雜樣品基質(zhì)時(shí)往往面臨干擾問(wèn)題。近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用逐漸成為獸藥殘留檢測(cè)分析的主流技術(shù)。這些技術(shù)不僅提高了檢測(cè)的靈敏度，還有效減少了基質(zhì)效應(yīng)[3-4]。在國(guó)內(nèi)，針對(duì)氯苯胺靈的研究相對(duì)較少，但隨著食品安全法規(guī)的不斷完善和消費(fèi)者對(duì)食品安全意識(shí)的提高，相關(guān)研究正在逐漸增加。研究人員開(kāi)始關(guān)注使用固相萃取與高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）相結(jié)合的方法，優(yōu)化樣品前處理和分析條件，以提高氯苯胺靈的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。因此，開(kāi)發(fā)出高效、靈敏的檢測(cè)方法，確保豬肉中氯苯胺靈的殘留水平符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)，具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉，購(gòu)自超市；氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg·L-1），上?？?jī)祥生物科技有限公司；無(wú)水氯化鈉（分析純），四川源盛達(dá)化工有限公司；甲酸、甲醇、乙腈、氯化鈉和正己烷（色譜純），均購(gòu)自美國(guó)Merck公司；乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB SCIEX QTRAP 5500+型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；HES-24B真空固相萃取裝置，美國(guó)Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

①氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確吸取1.0 mL氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg·L-1），用甲醇稀釋后定容至25 mL容量瓶中，即得氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（40 mg·L-1）。②氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密量取1.0 mL氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋?zhuān)渲贸?.0 mg·L-1氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液。③氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別吸取12.50 μL、25.00 μL、56.25 μL、112.50 μL、225.00 μL、1 125.00 μL和2 500.00 μL氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至1 L，即得0.50 μg·L-1、1.00 μg·L-1、2.25 μg·L-1、4.50 μg·L-1、9.00 μg·L-1、45.00 μg·L-1和100.00 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

樣品粉碎→試樣（3 g試樣放入50 mL離心管）+10.0 mL乙腈→超聲提取5 min→均質(zhì)15 min→2 g氯化鈉+3 g無(wú)水氯化鈉→均質(zhì)3 min，10 000 r·min-1，離心3 min→取上清液7 mL→2 mL正己烷（乙腈飽和）（均質(zhì)2 min，10 000 r·min-1，離心2 min）→取提取液5 mL→45 ℃氮吹→定容→待測(cè)。

甲醇5 mL+水5 mL→活化固相萃取柱→乙腈水溶液（5 mL，30%）→乙腈8 mL洗脫→45 ℃氮吹，濃縮至0.5 mL→乙腈-0.2%甲酸水（V/V）溶液（1∶1，V/V）→過(guò)0.22 μm PTFE濾膜→待測(cè)。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。流動(dòng)相A：0.2%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；洗脫順序：B（15%，0～1.00 min）→B（15%→ 90%，1.00～5.00 min）→B（90%，5.00～8.00 min）→B（90%→ 15%，8.00～8.01 min）→B（15%，8.01～10.00 min）；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。

（2）質(zhì)譜條件。ESI模式；離子源溫度：550 ℃；掃描模式：正離子掃描模式。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照1.3.3氣相色譜-質(zhì)譜條件，將氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg·L-1）、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（0.50 μg·L-1、1.00 μg·L-1、2.25 μg·L-1、4.50 μg·L-1、9.00 μg·L-1、45.00 μg·L-1、100.00 μg·L-1）依次進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，以氯苯胺靈的峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

1.3.5 回收率與精密度

在1.3.3氣相色譜-質(zhì)譜條件下，準(zhǔn)備5 g（精確至0.01 g）空白樣品，向空白樣品中添加0.003 mg·kg-1、0.006 mg·kg-1、0.060 mg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2進(jìn)行樣品前處理，平行測(cè)定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

將過(guò)濾后的樣品提取液注入高效液相色譜儀，記錄注入量。根據(jù)Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm×2.1 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）色譜柱的特性，選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。記錄保留時(shí)間、峰面積和峰形狀等關(guān)鍵參數(shù)。Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）色譜柱的保留時(shí)間和峰形效果均優(yōu)于其他兩種色譜柱。因此，被選為氯苯胺靈的分離色譜柱。

2.2 固相萃取柱的選擇

不同類(lèi)型的固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）柱在樣品凈化方面的效果存在差異。本研究對(duì)4種SPE柱進(jìn)行了比較，包括陽(yáng)離子交換SPE柱ProElut PXC（60 mg/3 mL）、陰離子交換SPE柱ProElut PXA（60 mg/3 mL）、硅酸鎂SPE柱ProElut Florisil（200 mg/3 mL）以及親水親脂平衡SPE柱ProElut PLS（200 mg/6 mL），以評(píng)估它們對(duì)氯苯胺靈的保留能力。由圖1可知，親水親脂平衡SPE柱的保留量最高，達(dá)到98.3%。這表明親水親脂平衡SPE柱在樣品凈化過(guò)程中對(duì)氯苯胺靈具有較高的親和力，能夠有效地捕獲目標(biāo)化合物。這種高保留量與其特殊的填料特性有關(guān)，該填料使其在極性和非極性分子之間實(shí)現(xiàn)良好的平衡。陽(yáng)離子交換SPE柱和陰離子交換SPE柱的保留量分別為88.7%和85.3%。這兩種柱雖然表現(xiàn)不及親水親脂平衡SPE柱，但仍然具有較高的保留能力，適合在一定條件下進(jìn)行氯苯胺靈的凈化。這與它們的填料成分和孔隙結(jié)構(gòu)有關(guān)。硅酸鎂SPE柱的保留量最低，僅為60.2%。這表明其在凈化氯苯胺靈時(shí)效果較差，是由于其對(duì)該類(lèi)化合物的親和力不足。硅酸鎂SPE柱通常用于分離極性較強(qiáng)的化合物，因此在處理氯苯胺靈時(shí)面臨一定的挑戰(zhàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇親水親脂平衡SPE柱作為固相萃取柱。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及檢出限

在實(shí)驗(yàn)中，將氯苯胺靈質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，以氯苯胺靈峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=3 004.096 8X+517.960 8。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r2為0.996 4，接近于1，檢出限為2.5 μg·L-1，表明質(zhì)量濃度與峰面積之間存在良好的線性關(guān)系。

2.4 回收率與精密度

在不同添加水平（0.003 mg·kg-1、0.006 mg·kg-1和0.060 mg·kg-1）下測(cè)定氯苯胺靈的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。每個(gè)添加水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn)。由表1可知，氯苯胺靈的平均回收率為85.25%～92.75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.83%～3.07%，表明本實(shí)驗(yàn)所開(kāi)發(fā)的SPE-UHPLC-MS/MS法在不同濃度下均能有效檢測(cè)氯苯胺靈殘留，且具有較高的準(zhǔn)確性和精密度。隨著添加水平的提高，回收率和精密度均有所改善，尤其是在0.060 mg·kg-1濃度水平下，表現(xiàn)出最佳的檢測(cè)性能。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本文建立的方法對(duì)6個(gè)超市的60批次豬肉樣品進(jìn)行全面的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，所有樣品均未檢測(cè)出氯苯胺靈殘留。這一結(jié)果不僅表明了本研究方法的有效性和可靠性，也反映出這些超市銷(xiāo)售的豬肉產(chǎn)品在氯苯胺靈方面符合相關(guān)安全標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)對(duì)這些樣品的檢測(cè)，驗(yàn)證了該方法實(shí)際應(yīng)用在豬肉樣品檢測(cè)中的可行性。

3 結(jié)論

本研究成功開(kāi)發(fā)了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，能夠有效檢測(cè)豬肉中氯苯胺靈殘留，具有良好的分析性能。通過(guò)對(duì)氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，氯苯胺靈的質(zhì)量濃度與峰面積之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2為0.996 4，確保了定量分析的可靠性。氯苯胺靈的加標(biāo)回收率為85.25%～92.75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.83%～3.07%，表明該方法在樣品前處理和分析過(guò)程中的準(zhǔn)確性和精密度均較高。SPE-UHPLC-MS/MS法具有快速、靈敏和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于豬肉及其他動(dòng)物源性食品中氯苯胺靈的檢測(cè)，能夠?yàn)槭称钒踩O(jiān)管提供有效的技術(shù)支持。

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