摘要" 為篩選能使枯草芽孢桿菌黑色變種穩(wěn)定產(chǎn)生黑色素的酪氨酸培養(yǎng)基配方，本試驗通過單因素實驗法對酪氨酸培養(yǎng)基進行優(yōu)化，探討酪氨酸（L-酪氨酸，濃度分別為0、0.5、1.0、2.0和3.0 g/L）、碳源（葡萄糖，濃度分別為0、0.5、1.0、2.0和3.0 g/L）、氮源（胰蛋白胨，濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 g/L）、氨基酸（干酪素，濃度分別為0、10.0、20.0、40.0和60.0 mL/L）及誘導(dǎo)時間（24、48、72和96 h）對枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生黑色素的影響，并對富捷牌環(huán)氧乙烷滅菌ATCC 9372生物指示劑等4種指示劑進行適應(yīng)性驗證。結(jié)果表明，L-酪氨酸、葡萄糖、胰蛋白胨和干酪素的最優(yōu)添加量分別為0.5 、0.5 、0.5 g/L和10 mL/L；最優(yōu)培養(yǎng)時間在72～96 h。該條件下能較好地誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌黑色變種穩(wěn)定產(chǎn)生黑色素。研究結(jié)果為枯草芽孢桿菌黑色變種的篩選、培養(yǎng)及進一步應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞" 枯草芽孢桿菌黑色變種；酪氨酸；選擇性培養(yǎng)基；生物指示劑

中圖分類號" Q93-3" " " "文獻標識碼" A" " " "文章編號" 1007-7731（2024）23-0040-06

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.23.009

Optimization of Bacillus subtilis var. niger selective medium

YU Siyi" " GONG Haiyan

（Shanghai Environmental Monitoring Center， Shanghai 200235， China）

Abstract" To screen the tyrosine medium formula that could make Bacillus subtilis var. niger produce melanin stably ， the tyrosine medium was optimized by single factor experiment method， and the effects of Tyrosine （L-tyrosine， 0， 0.5， 1.0， 2.0 and 3.0 g/L， respectively）， carbon source （glucose， 0， 0.5， 1.0， 2.0 and 3.0 g/L， respectively）， nitrogen source （tryptone， 1.0， 2.0 and 3.0 g/L， respectively），amino acid （casein ，0， 10.0， 20.0， 40.0 and 60.0 mL/L， respectively） and induction time （24， 48， 72 and 96 h） on the production of melanin by Bacillus subtilis var. niger were investigated. The adaptability of 4 kinds of indicators， including ATCC 9372 biological indicator sterilized by Fujie brand ethylene oxide， was verified. The results showed that" the optimal addition amounts of L-tyrosine， glucose， tryptone and casein were 0.5， 0.5， 0.5 g/L and 10 mL/L， respectively. The optimal culture time was 72～96 h. Under this condition， the Bacillus subtilis var. niger could be induced well， and the melanin produced was stable. The results provided a reference for the screening， culture and further application of Bacillus subtilis var. niger.

Keywords" Bacillus subtilis var. niger; tyrosine; selective medium; biological indicator

枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillus subtilis var. niger）又稱萎縮芽孢桿菌，無危害性，其芽孢對熱、紫外線、電離輻射和某些化學(xué)物質(zhì)的抗性較強，在《中國藥典》[1]和GB 15981—2021《消毒器械滅菌效果評價方法》[2]中作為干熱消毒、環(huán)氧乙烷和其他液體化學(xué)消毒的生物指示劑，或用于醫(yī)藥物品消毒、無菌保證和微生物實驗室滅菌效果的評價等[3-4]。

Fritze等[5]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌黑色變種可在含有酪氨酸的培養(yǎng)基中形成黑色素，但其形成穩(wěn)定性有待進一步提高。因此，探索一種能使枯草芽孢桿菌黑色變種穩(wěn)定產(chǎn)生黑色素的培養(yǎng)基對于菌株的培養(yǎng)具有重要意義。本研究參考酪氨酸基礎(chǔ)培養(yǎng)基（ISP medium No.7）配方[6]，對培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，尋找一種既不影響枯草芽孢桿菌黑色變種的正常生長，又能穩(wěn)定產(chǎn)生黑色素的培養(yǎng)基，為枯草芽孢桿菌黑色變種的篩選、培養(yǎng)及進一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試芽孢菌株為枯草芽孢桿菌黑色變種（ATCC 9372），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC 21608）。

1.1.2" 培養(yǎng)基和試劑 營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、蛋白胨、胰蛋白胨、酪氨酸、葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、L?天冬酰胺、L?酪氨酸、干酪素和氫氧化鈉，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱（BSD-250，上海博迅）；超凈工作臺（BLB-1300，蘇州凈化）；pH計（F2，Mettler Toledo）；分析天平（ME204E，Mettler Toledo）；高壓蒸汽滅菌器（LDZF-50 L，上海申安）。

1.2 培養(yǎng)條件

取枯草芽孢桿菌黑色變種（CICC 21608）凍干菌種管，無菌條件下打開，用刻度移液管吸取適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，吹打數(shù)次，使其融化分散。取含5～10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管，滴入少許菌種懸液，置36 ℃復(fù)蘇培養(yǎng)18～24 h。用接種環(huán)取復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平皿上，于36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。挑取營養(yǎng)瓊脂平皿上的單菌落接種于酪氨酸培養(yǎng)基上，于36 ℃培養(yǎng)24～96 h。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化 參考ISP medium No.7基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，以L-天冬酰胺0.5 g、L-酪氨酸0.5 g、磷酸氫二鉀0.5 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鈉0.5 g、瓊脂20.0 g、微量鹽溶液1 mL和蒸餾水1 000 mL作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，采用單因素實驗法探討培養(yǎng)基中酪氨酸、葡萄糖、干酪素和胰蛋白胨濃度及培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生黑色菌落的影響?；A(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基的成分及各成分含量見表1。

配制不同含量的L-酪氨酸優(yōu)化培養(yǎng)基（1 000 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入L-酪氨酸0、0.5、1.0、2.0和3.0 g）、葡萄糖（碳源）優(yōu)化培養(yǎng)基（1 000 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入葡萄糖0、0.5、1.0、2.0和3.0 g）、胰蛋白胨（氮源）優(yōu)化培養(yǎng)基（1000 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入胰蛋白胨0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 g）和干酪素（氨基酸）優(yōu)化培養(yǎng)基（1 000 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加干酪素10.0、20.0、40.0和60.0 mL），以每皿25～30 mL制備平皿，冷卻凝固后備用。在優(yōu)化培養(yǎng)基平皿上分別涂布接種0.1 mL 濃度3.0×103 cfu/mL的枯草芽孢桿菌黑色變種菌液，在培養(yǎng)24、48、72和96 h后分別計數(shù)優(yōu)化培養(yǎng)基平皿上的黑色菌落數(shù)。

1.3.2 誘導(dǎo)時間優(yōu)化 考慮到溫度和pH對黑色素的產(chǎn)生影響不大，而培養(yǎng)時間對其影響較明顯，因而在培養(yǎng)條件方面主要針對培養(yǎng)時間開展研究。試驗設(shè)定了24、48、72和96 h 4個不同的誘導(dǎo)時間，研究并優(yōu)化枯草芽孢桿菌黑色變種穩(wěn)定產(chǎn)生黑色素的誘導(dǎo)時間。

1.4 優(yōu)化培養(yǎng)基適用性驗證

為驗證優(yōu)化培養(yǎng)基的效果，采用市面上的枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)品進行驗證。分別為富捷牌環(huán)氧乙烷滅菌ATCC 9372生物指示劑、鑫四環(huán)牌生物指示劑ATCC 9372菌片、鴻雍牌ATCC 9372生物指示劑和3M牌環(huán)氧乙烷滅菌生物培養(yǎng)指示劑。

1.5 測定指標和方法

采用稀釋涂布平板計數(shù)法測定活菌量。取待測發(fā)酵液稀釋104～105 倍，分別吸取100 μL于選擇培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒將稀釋菌液涂抹均勻。為防止在培養(yǎng)過程中被污染，將培養(yǎng)皿用封口膜密封后，于36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～96 h，計數(shù)各培養(yǎng)皿菌落數(shù)及黑色菌落數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.1.1 L-酪氨酸含量 培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中不含L-酪氨酸時，培養(yǎng)至96 h仍未見有黑色菌落形成；當酪氨酸濃度在0.5～3.0 g/L時，培養(yǎng)期間有不同程度的黑色菌落形成。由此可見，酪氨酸是合成黑色素的前提。由表2可知，當培養(yǎng)基中L-酪氨酸濃度在0.5～1.0 g/L時，培養(yǎng)48 h即可見黑色菌落形成，至72 h黑色菌落形成率達100%；當L-酪氨酸濃度為2.0 g/L時，培養(yǎng)72 h才開始形成明顯的黑色菌落，培養(yǎng)至96 h時黑色菌落形成占比99.2%；當酪氨酸濃度為3.0 g/L時，培養(yǎng)96 h才形成明顯黑色菌落，且黑色菌落形成占比94.7%。由此可見，培養(yǎng)基中最優(yōu)酪氨酸濃度0.5 g/L，此時黑色菌落形成速率較快，且培養(yǎng)72 h后黑色菌落形成率100%。

2.1.2 碳源含量 為探討碳源對枯草芽孢桿菌黑色變種的生長影響，以葡萄糖作為碳源代表。結(jié)果見圖1和表3。由圖1可知，當基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不添加葡萄糖時，培養(yǎng)24 h時后枯草芽孢桿菌黑色變種生長情況明顯較添加葡萄糖的差，菌落數(shù)量少且個體小，表明碳源是構(gòu)成微生物細胞的碳架和供給微生物生長、繁殖及運動所需能量的物質(zhì)，培養(yǎng)基中增加碳源可以促進枯草芽孢桿菌黑色變種的生長。由表3可知，當培養(yǎng)基中葡萄糖濃度在0.5～2.0 g/L時，培養(yǎng)96 h黑色菌落形成率均達100%。其中，當培養(yǎng)基中葡萄糖濃度在0.5～1.0 g/L時，培養(yǎng)48 h時出現(xiàn)黑色菌落，至72 h黑色菌落占比分別為100%、99.8%，而當葡萄糖濃度在1.5～2.0 g/L時，培養(yǎng)72 h時才出現(xiàn)黑色菌落，黑色菌落產(chǎn)生速度開始逐漸變慢，這可能與細菌的生長特性相關(guān)，枯草芽孢桿菌黑色變種雖然能利用酪氨酸酶分解酪氨酸產(chǎn)生黑色素，但當其生長的培養(yǎng)基中含有豐富的碳源、氮源時，優(yōu)先利用碳源、氮源進行生長。因此，葡萄糖的最優(yōu)添加濃度0.5 g/L，培養(yǎng)72 h時，枯草芽孢桿菌黑色變種黑色菌落形成率達100%。

2.1.3 氮源含量 為探討氮源對枯草芽孢桿菌黑色變種的生長影響，以胰蛋白胨作為氮源代表。試驗結(jié)果見圖2和表4。由圖2可知，當基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不添加胰蛋白胨時，培養(yǎng)24 h后平皿上幾乎沒有枯草芽孢桿菌黑色變種菌落生長，直至培養(yǎng)72 h才出現(xiàn)明顯菌落生長，96 h后形成黑色菌落比例較高。而在添加胰蛋白胨的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24 h后即出現(xiàn)菌落且生長良好，個體較大；培養(yǎng)48 h開始出現(xiàn)黑色菌落，至72 h黑色菌落占比高達100%?？梢姡醋鳛槲⑸锖铣傻鞍踪|(zhì)的主要原料之一，是微生物生長不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，增加氮源可以明顯促進枯草芽孢桿菌黑色變種的生長。

由表4可知，當培養(yǎng)基中胰蛋白胨濃度在0.5～5.0 g/L時，培養(yǎng)96 h后黑色菌落形成率均達100%。其中，當培養(yǎng)基中胰蛋白胨濃度在0.5～4.0 g/L時，培養(yǎng)48 h時均開始形成黑色菌落，黑色菌落占比72.5%～90.0%，且胰蛋白胨濃度為0.5 g/L時黑色菌落形成率最高，培養(yǎng)至72 h時黑色菌落占比均達到100%；而當胰蛋白胨濃度為5.0 g/L時，培養(yǎng)48 h時黑色菌落占比0，培養(yǎng)72 h出現(xiàn)黑色菌落，菌落生長速度有所減緩。由此可見，胰蛋白胨最優(yōu)添加濃度0.5 g/L，在該濃度下枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生黑色菌落時間早、比例高。

2.1.4 氨基酸含量 為探討氨基酸對枯草芽孢桿菌黑色變種的生長影響，以干酪素作為氨基酸代表，結(jié)果見表5。由表5可知，干酪素的加入對加速枯草芽孢桿菌黑色變種的黑色菌落形成具有一定的促進作用，當干酪素濃度10.0 mL/L時，48 h的黑色菌落占比最高，而繼續(xù)添加干酪素后，48 h黑色菌落的形成率反而降低，72、96 h的菌落黑化率均為100%。因此干酪素的最優(yōu)添加量為10.0 mL/L。

綜上，L-酪氨酸、葡萄糖、胰蛋白胨和干酪素的最優(yōu)添加濃度分別為0.5 、0.5 、0.5 g/L和10 mL/L。優(yōu)化后每1 000 mL枯草芽孢桿菌黑色變種培養(yǎng)基的成分見表6。

2.2 培養(yǎng)時間優(yōu)化

將枯草芽孢桿菌黑色變種接種于優(yōu)化后的酪氨酸培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h時，無黑色菌落生成，隨著培養(yǎng)時間的增加，黑色素不斷生成，黑色菌落逐漸生成，誘導(dǎo)48 h時；黑色菌落生成比占比99.3%，培養(yǎng)72～96 h可得到較為明顯和穩(wěn)定的黑色菌落，占比達100%。因此，枯草芽孢桿菌黑色變種的最優(yōu)培養(yǎng)時間在72～96 h。

2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基適用性驗證

將4種枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)品接種于優(yōu)化后的酪氨酸培養(yǎng)基上，于36 ℃培養(yǎng)96 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種生物指示劑在36 ℃培養(yǎng)72～96 h后均能100%產(chǎn)生黑色菌落（圖3）。由此可見，利用本研究改良后的酪氨酸培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌黑色變種穩(wěn)定產(chǎn)生黑色素。

3 結(jié)論與討論

酪氨酸在酪氨酸氧化酶的催化作用下氧化生成二羥苯丙氨酸（多巴），繼續(xù)氧化生成多巴醌，再進一步氧化閉環(huán)生成5，6-二羥吲哚，再轉(zhuǎn)化成5，6-吲哚二醌，在酶的作用下，最終氧化聚合形成黑色素[7-8]。本試驗進一步驗證了酪氨酸是枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生黑色素并形成黑色菌落的關(guān)鍵物質(zhì)。試驗結(jié)果表明，葡萄糖、胰蛋白胨以及干酪素分別作為碳源、氮源及氨基酸均能促進菌體快速生長，但過量的碳源、氮源和氨基酸會影響枯草芽孢桿菌黑色變種分解利用酪氨酸的效率，與馬頂虹[9]研究結(jié)果一致。因此，培養(yǎng)基成分的合理配比對是確保枯草芽孢桿菌黑色變種快速穩(wěn)定產(chǎn)生黑色菌落的關(guān)鍵。優(yōu)化后的酪氨酸培養(yǎng)基可以使枯草芽孢桿菌黑色變種的培養(yǎng)時間穩(wěn)定在72～96 h，解決了枯草芽孢桿菌黑色變種在含有酪氨酸的培養(yǎng)基中黑色素形成不穩(wěn)定的問題，為枯草芽孢桿菌黑色變種的選擇性培養(yǎng)及篩選提供參考。

本研究采用了單因素實驗法探討了不同培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌黑色變種形成黑色素的影響，但未考慮各因素之間的相互作用。響應(yīng)面法是目前較為常用的微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法之一，是一種處理復(fù)雜關(guān)系和優(yōu)化多種因素的實驗統(tǒng)計方法[10]，可縮短優(yōu)化時間、提高應(yīng)用可信度[11]。張夢菲等[12]通過響應(yīng)面法優(yōu)化暹羅芽孢桿菌產(chǎn)大環(huán)內(nèi)酯的發(fā)酵培養(yǎng)條件，得出的發(fā)酵培養(yǎng)基明顯提高菌株的大環(huán)內(nèi)酯產(chǎn)量。后續(xù)可以根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，以碳源、氮源、氨基酸、酪氨酸、無機鹽和培養(yǎng)時間等作為影響因素設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗，進一步優(yōu)化培養(yǎng)基各組分的添加比例，提高黑色菌落的生長效率，為枯草芽孢桿菌黑色變種的應(yīng)用和檢測鑒定提供基礎(chǔ)。黑色素被定義為由酚類前體氧化聚合而產(chǎn)生的棕色到黑色的高分子量色素，具有保護生物體免受不同的外界壓力，包括紫外線照射、高溫和活性氧等，還可以結(jié)合金屬離子和自由電子，從而發(fā)揮氧化還原作用[13]。隨著明黑色素在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用范圍的擴大[14-16]，結(jié)合枯草芽孢桿菌黑色變種具有的非致病性、易培養(yǎng)和生產(chǎn)快等優(yōu)勢[17]，可考慮將其應(yīng)用于黑色素規(guī)模化生產(chǎn)。

綜上，本研究通過單因素實驗法探討培養(yǎng)基中酪氨酸、葡萄糖、胰蛋白胨和干酪素濃度及培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生黑色菌落的影響。優(yōu)化后的酪氨酸培養(yǎng)基配方為每1 000 mL培養(yǎng)基中含胰蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，L-天冬酰胺1.0 g，L-酪氨酸0.5 g，干酪素溶液10.0 mL，微量鹽溶液1.0 mL，瓊脂20.0 g，余量為蒸餾水。采用優(yōu)化培養(yǎng)基36 ℃培養(yǎng)箱下培養(yǎng)72～96 h可得到穩(wěn)定的黑色菌落。通過4種枯草芽孢桿菌黑色變種驗證其適用性，結(jié)果表明該條件有利于誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌黑色變種穩(wěn)定產(chǎn)生黑色素，為該物種的選擇性培養(yǎng)及篩選提供參考。

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（責(zé)任編輯：胡立萍）