摘""要：溶血磷酸?；D移酶（lysophosphatidyl"acyltransferase，LPAT）是控制溶血磷脂酸生成磷脂酸的關鍵酶，在植物磷脂合成中發(fā)揮重要作用。橡膠樹（Hevea"brasiliensis）是生產天然橡膠的重要來源，其在國防、醫(yī)療、高端制品等領域具有不可替代的作用，具有很高的社會價值和經濟價值。本研究采用分子生物學技術在橡膠樹膠乳中成功克隆出2個HbLPAT基因家族中負責磷脂合成的關鍵基因，分別命名為HbLPAT2a和HbLPAT2b，其編碼序列全長分別為1161"bp和939"bp，分別編碼了386個和312個氨基酸。HbLPAT2a和HbLPAT2b均含有1個PLN02380的溶血磷脂酸?；D移酶功能結構域和高度保守的NH（X）4D基序。HbLPAT2a有3個跨膜結構域，HbLPAT2b有1個跨膜結構域，二者均無信號肽，為親水性蛋白，且含有多個磷酸化位點。亞細胞定位分析表明，HbLPAT2a和HbLPAT2b蛋白均定位于內質網上。不同組織部位表達分析表明，HbLPAT2a和HbLPAT2b基因均在橡膠樹種子中的表達量最高，推測其具有脂質合成功能，而在膠乳中，HbLPAT2a和HbLPAT2b的表達量在HbLPAT基因家族中位居前2位。本研究結果有助于了解HbLPAT2a和HbLPAT2b在橡膠樹膠乳磷脂合成過程中的功能，為后期橡膠樹膠乳品質的遺傳改良提供科學依據。

關鍵詞：橡膠樹；HbLPAT2；生物信息學分析；表達分析中圖分類號：S794.1""""""文獻標志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"HbLPAT2"Gene"from"Hevea"brasiliensis

WANG"Xiaolin1，2，"QU"Peng2，"GAN"Mingyang1，2，"QIU"Jian1，"FAN"Ruishen1*

1."Rubber"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."College"of"Tropical"Crops，"Yunnan"Agricultural"University，"Pu’er，"Yunnan"665099，"China

Abstract："Lysophosphatidyl"acyltransferase"（LPAT），"a"key"enzyme"which"controls"the"production"of"lysophosphatidic"into"phosphatidic，"plays"an"important"role"in"phospholipid"biosynthesis"in"plants."Hevea"brasiliensis"is"an"important"source"for"the"production"of"natural"rubber，"which"has"an"irreplaceable"role"in"the"fields"of"national"defense，"medical"treatment，"high-end"products，"and"has"high"social"and"economic"value."Cloning"and"analysis"of"HbLPAT2"in"H."brasiliensis"would"provide"scientific"basis"for"further"exploration"of"its"phospholipid"biosynthesis"function"and"the"effect"of"phospholipid"on"nature"rubber."In"this"study"HbLPAT2"was"cloned"from"the"latex"of"the"H."brasiliensis"by"molecular"biologynbsp;techniques，"and"the"bioinformatics"analysis，"expression"analysis"and"subcellular"localization"analysis"were"performed."In"this"study，"two"key"genes"responsible"for"phospholipid"biosynthesis"in"the"HbLPAT"gene"family"were"successfully"cloned"from"the"latex"of"the"H."brasiliensis，"named"HbLPAT2a"and"HbLPAT2b，"the"full"length"coding"sequence"of"HbLPAT2a"and"HbLPAT2b"genes"was"1161"bp"and"939"bp，"encoding"386"and"312"amino"acids."Both"HbLPAT2a"and"HbLPAT2b"contained"a"PLN02380"lysopyatidyl"acyltransferase"functional"domain"and"contained"a"highly"conserved"NH（X）4D"motif;"HbLPAT2a"protein"had"3"transmembrane"domains，"and"HbLPAT2b"protein"had"1"transmembrane"domain，"both"of"which"had"no"signal"peptide，"were"hydrophilic"proteins，"and"contained"multiple"phosphorylation"sites."The"subcellular"localization"analysis"showed"that"both"HbLPAT2a"and"HbLPAT2b"proteins"were"located"in"the"endoplasmic"reticulum."In"different"organs，"the"highest"expression"level"of"HbLPAT2a"and"HbLPAT2b"was"found"in"seeds，"suggesting"that"they"have"a"lipid"biosynthesis"function."However，"in"the"latex"of"H."brasiliensis，"the"first"and"second"expression"level"of"whole"HbLPAT"gene"family"were"HbLPAT2a"and"HbLPA2b."The"result"is"helpful"to"understanding"that"HbLPAT2a"and"HbLPAT2b"play"an"important"role"in"the"phospholipid"biosynthetic"pathway"in"latex"of"H."brasiliensis"and"to"providing"a"scientific"basis"for"genetic"improvement"of"latex"quality"of"H."brasiliensis.

Keywords："Hevea"brasiliensis;"HbLPAT2;"bioinformatics"analysis;"expression"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.12.003

橡膠樹（Hevea"brasiliensisaa）屬大戟科（Euphorbiaceae）三葉橡膠樹屬（Hevea）植物，迄今為止已有100多年的栽培歷史[1]。橡膠樹原產于巴西，于1904年引入我國云南，現主產區(qū)為海南和云南[2-3]。橡膠樹是商用天然橡膠（nature"rubber，NR）的主要來源，NR作為一種重要的工業(yè)材料，綜合性能優(yōu)異，具有不可替代的作用，廣泛應用于航空航天、工農業(yè)、交通運輸、醫(yī)療衛(wèi)生等領域[4]。NR由橡膠樹乳管細胞中排出的膠乳加工而來，膠乳的實質是乳管的細胞質，其主要成分為橡膠烴，并含有少量的脂質和蛋白質等非膠物質。NR中的脂質（主要是磷脂）和蛋白質作為支點與橡膠烴構成網狀結構，其含量不僅直接影響NR的品質，也進一步影響其工藝操作性能與產品使用性能，是NR優(yōu)于合成橡膠的根本原因[5-7]。目前，提高膠乳品質是我國橡膠樹育種的重要方向之一。

脂質是一類高溶于非極性溶劑而低溶于水的有機生物分子，其化學本質是醇類和脂肪酸形成的酯類物質及其衍生物[8]。脂肪酸的酯化最終合成油脂是在內質網中通過Kennedy途徑實現[9]，參與該途徑的酶主要有3-磷酸甘油?；D移酶（glycerol-3-phosphate"acyltransferase，GPAT）、溶血磷酸酰基轉移酶（lysophosphatidyl"acyltransferase，LPAT）和二酰甘油?；D移酶（diacyl glycerol"acyltransferase，DGAT）[10]，其中LPAT在磷脂合成中起到關鍵作用。甘油三酯合成的第一步反應是GPAT催化脂酰-CoA與3-磷酸甘油在sn-1位發(fā)生酯化反應生成溶血磷脂酸酶（lysopho sphatidic"acid，LPA）[11-12]，然后由LPAT在sn-2位發(fā)生酯化反應生成磷脂酸（phosphatidic"acid，PA）[10]，再由磷脂酸磷酸化酶（phosphatidic"acid"phosphatase，"PAP）脫去磷酸基團反應生成二酰甘油酯（diacylgycerol，DAG），最后DAG在sn-3發(fā)生催化脫酰基生成三?；视王ィ╰riacylglycerol，TAG）[12]。

LPAT是控制溶血磷脂酸生成磷脂酸的關鍵酶[13]，根據LPAT基因家族的亞細胞定位及進化起源，可將該基因家族分為2類：質體型LPATs和微粒體型LPATs[14]。質體型LPATs對軟脂酸底物有強烈的偏好性，具有典型的原核酶類特征[10，"15]。微粒體型LPATs種類較多，主要參與真核途徑的膜脂及油脂合成[16]。前人在擬南芥中已對LPAT基因家族進行了較為系統(tǒng)的研究，AtLPAT基因家族成員有5個，其中，AtLPAT1定位在葉綠體，屬于質體型；AtLPAT2定位于內質網中，屬于微粒體型；AtLPAT3亞細胞定位目前不清楚，但是該基因對花可以特異性表達，其功能暫時不清楚；AtLPAT4、AtLPAT5的亞細胞定位和功能目前均尚不明確[10]。已有研究表明，擬南芥（Arabidopsis"thaliana）定位在內質網上的AtLPAT2參與了磷脂的從頭合成途徑，在擬南芥生長發(fā)育各個階段起著重要的作用，而且它能通過刺激磷脂的合成而參與擬南芥對低磷脅迫的響應[17-19]；在花生（Arachis"hypogaca）中，超表達AhLPAT2能顯著提高種子的含油量[20]；在蓖麻（Ricinus"communis）中，超表達RcLPAT2不僅能提高其總含油量，也能提高油脂（TAG）中的不飽和脂肪酸的含量[21]。

提高膠乳品質是當前我國橡膠樹育種研究的重要方向之一，增加磷脂含量可提升天然橡膠的加工性能[2]，這使得通過脂質含量的改變來提高膠乳品質成為可能。目前有關橡膠樹油脂合成路徑的研究較少，脂質積累路徑不清，嚴重影響橡膠樹脂質和磷脂的遺傳改良，成為提高膠乳品質的主要障礙。借助已知的油脂合成途徑以及油料植物改良思路，本研究選擇橡膠樹磷脂積累和油脂合成路徑上的關鍵基因HbLPAT2為研究對象，對其進行序列、結構和系統(tǒng)發(fā)育等生物信息學分析，并通過基因表達分析以及亞細胞定位驗證了解橡膠樹HbLPAT2的基因結構及分子特征，為進一步研究橡膠樹HbLPAT2基因在膠乳磷脂合成過程中的功能提供理論依據，對橡膠樹高品質膠乳品種的選育及遺傳改良具有一定的參考價值。

1""材料與方法

1.1""材料

供試材料為10年生的熱研73397橡膠樹組培苗植株，種植于中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所儋州試驗場三隊（19°31′10″N，109°29′41″E）。橡膠樹割制為S/2"d4（1/2樹圍、每4"d割1刀，不涂乙烯利）。于2023年8月連續(xù)采集3刀的膠乳樣品，收集5～10"min流出的膠乳，割膠當天同時采集其他組織。膠乳用液氮速凍后，放于離心管，其他組織使用錫紙包好，立即放入液氮速凍后于–80"℃冰箱保存，用于RNA提取。

1.2""方法

1.2.1""橡膠樹RNA的提取及cDNA的合成""取50～100"mg組織樣品，液氮磨碎后，按照RNA提取試劑盒（TranGen，"EasyPure"Plant"RNA"Kit）說明書提取總RNA，使用NanoDrop"2000（Thermo"Scientific）檢測RNA的純度和濃度。取檢測合格的RNA進行反轉錄，使用反轉錄試劑盒（Thermo"Scientific，"RevertAid"First"Strand"cDNA"Synthesis"Ki）合成cDNA。

1.2.2""HbLPAT2的克隆與鑒定""根據課題組已有的橡膠樹膠基因組和膠乳轉錄組數據[22]，共獲得6條注釋為LPAT的Unigene序列，通過NCBI的Blast功能進行對比，找到HbLPAT2基因，分別命名為HbLPAT2a和HbLPAT2b。用Premier"6.0軟件設計特異引物（表1），以稀釋后的膠乳cDNA為模板，使用高保真酶（Vazyme，2×Phanta"Flash"Master"Mix）進行擴增，擴增體系及PCR反應程序同說明書。PCR擴增產物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用膠回收試劑盒（Agarose"Gel"DNA"Extraction"Kit"Ver.4.0，Takara）將正確條帶進行膠回收，加A尾連接T載體后（TA-cloning"Kit，TaKaRa）轉換大腸桿菌DH5-α感受態(tài)細胞，涂板過夜培養(yǎng)后通過菌落PCR篩選陽性克隆，送至北京擎科生物科技有限公司廣州分公司測序。

1.2.3""HbLPAT2a和HbLPAT2b的生物信息學分析""利用生物信息學分析相關軟件（表2）對HbLPAT2a和HbLPAT2b進行生物信息學分析。

1.2.4""HbLPAT2a和HbLPAT2b的表達分析""使用Premier"6.0軟件設計qRT-PCR檢測的引物（表1）。以HbActin為內參基因，按照熒光定量試劑盒（TB"GREEN?"Premix"Ex"TaqTM"II."ROX"plus，TaKaRa）說明書進行定量反應。實驗結果采用2?ΔΔCt方法計算相對表達量，每組實驗重復3次。

1.2.5""HbLPAT2a和HbLPAT2b的亞細胞定位驗證""以pCAM-1300-GFP為表達載體，選擇BamH"I為單酶切位點，設計HbLPAT2a和HbLPAT2b的同源臂，使用同源重組克隆酶（ClonExpress"Ultra"One"Step"Cloning"Kit"V2，Vazyme）將HbLPAT2a和HbLPAT2b連接到表達載體上，構成HbLPAT2-"GFP重組質粒。將重組質粒轉入大腸桿菌，測序成功后（方法同1.2.2）使用質粒提取試劑盒（Plasmid"Mini"Kit"I，Omega）提取質粒，將質粒轉入農桿菌GV3101（p19）感受態(tài)，篩選陽性菌株培養(yǎng)。將HbLPAT2-GFP與內質網maker"CFP-"HDEL按1∶1比例注射煙草表面，同時注射空載體作為對照，培養(yǎng)2～3"d。用煙草葉片制作臨時切片，在共聚焦顯微鏡中觀察，低倍鏡下找到綠色熒光，20倍鏡觀察并拍照。

2""結果與分析

2.1""HbLPAT基因家族的鑒定及表達分析

以橡膠樹膠乳轉錄組數據為基礎，將擬南芥LPAT基因家族蛋白序列與橡膠樹蛋白序列進行對比，共鑒定出6個橡膠樹LPAT基因家族成員。使用MEGA軟件構建系統(tǒng)進化樹，根據序列比對和聚類分析結果（圖1）將6個LPAT基因家族成員分別命名為HbLPAT1、HbLPAT2a、HbLPAT2b、HbLPAT3、HbLPAT4、HbLPAT5。在橡膠樹膠乳中對HbLPAT基因家族成員進行表達分析發(fā)現，有4個基因在膠乳中表達，其中HbLPAT2b相對表達量最高，顯著高于其他3個基因；其次為HbLPAT2a，顯著高于HbLPAT1和HbLPAT5；未檢測到HbL PAT3和HbLPAT4（圖2）。

2.2""HbLPAT2的克隆及蛋白序列分析

以橡膠樹膠乳cDNA為模板，進行PCR擴增，不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05）。

克隆出2個長度分別為2397"bp和1719"bp的基因片段，經膠回收和陽性克隆測序，獲得1161"bp的HbLPAT2a和939"bp的HbLPAT2b的蛋白質編碼序列（coding"sequence，"CDS）。CDD預測結果表明，HbLPAT2a和HbLPAT2b蛋白均具有1個完整的溶血磷脂酸酰基轉移酶功能結構域（圖3A，圖3B）。目前LPAT2基因已在多種植物中被成功克隆并公布了序列，?；D移酶功能在部分植物中也得到了驗證，如擬南芥、耬斗菜（Aqu i legia"coerulea）、茶樹（Camellia"sinensis）、蜜柑（Citrus"unshiu）、古柯（Erythroxylum"novogranatense）、麻風樹（Jatropha"curcas）、白羽扇豆（Lupinus"albus）、木薯（Manihot"esculenta）、銀白楊（Populus"alba）、美洲黑楊（Populus"deltoides）、大葉櫟（Quercus"lobata）、歐洲栓皮櫟（Quercus"suber）、時鐘花（Turnera"subulata）、油桐（Vernicia"fordii）等。將上述植物的LPAT2與橡膠樹LPAT2的蛋白序列比對發(fā)現，在HbLPAT2中含有5個LPAT2蛋白保守基序（圖3C），分別是NH（X）4D（Motif"I）、LPVIGW（Motif"II）、VLALFVEGTRF（Motif"III）、N（X）LIPRIKGFV（Motif"IV）和MRSFVPA（X）4T（X）（Motif"V）。Motif"I的組氨酸（H）及天冬氨酸（D）殘基是酰

基轉移酶催化活性的重要功能位點；Motif"III中則含有EGT-Box，它不但是酰基轉移酶的功能位點，還含有?；D移酶作用底物溶血磷脂酸的結合位點。此外，不同物種間的LPAT2序列在C端部分的差異性略大于N端。

2.3""橡膠樹HbLPAT2蛋白的生物信息學分析

蛋白質理化特性分析結果如表3所示，橡膠樹HbLPAT2a和HbLPAT2b的相對分子質量分別為43.23"kDa和35.41"kDa，原子總數分別為6208和5058，理論等電位點分別為9.53和5.02；脂肪系數分別為109.38和109.68，不穩(wěn)定系數分別為41.20和39.73，均大于39，推測其屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性系數分別為0.231和0.200，均屬于親水性蛋白。亞細胞定位、跨膜結構域和信號肽預測表明，HbLPAT2a和HbLPAT2b均定位于內質網，HbLPAT2a有3個跨膜結構域，HbLPAT2b有1個跨膜結構域，二者均無信號肽，屬于非分泌型蛋白。HbLPAT2a具有33個潛在的磷酸化位點，HbLPAT2b具有26個潛在的磷酸化位點。二級結構域預測表明，HbLPAT2a和HbLPAT2b的α-螺旋（α-helix）分別為44.82%和47.44%，無規(guī)則卷曲（random"coil）分別為34.20%和29.49%，是構成HbLPAT蛋白的主要結構元件，而延伸鏈（extended"strand）和β-轉角（β-turn）分散于整個蛋白中，分別占17.36%～17.95%和3.63%～5.13%。

2.4""橡膠樹HbLPAT2s的表達分析

實時熒光定量分析結果表明，HbLPAT2a和HbLPAT2b在橡膠樹的根、葉片、種子、花、樹皮和膠乳組織部位中均有表達，二者在種子中的相對表達最高，顯著高于其他組織；其次為花，也顯著高于另外4個組織部位；在剩余4個組織中的表達量由高到低依次為膠乳、樹皮、樹根和樹葉，差異不顯著（圖4）。

2.5""橡膠樹HbLPAT2的亞細胞定位

為了進一步研究HbLPAT2a和HbLPAT2b的功能及細胞內的表達部位，本研究構建了HbLPAT2-"GFP的融合蛋白，利用農桿菌侵染的方法在煙草葉表皮細胞共表達HbLPAT2-GFP和細胞內質網定位的CFP-HDEL。亞細胞定位分析結果表明，空載的GFP信號在細胞中分散表達，HbLPAT2a和HbLPAT2b的GFP信號呈點狀分布并與內質網定位的CFP信號重合（圖5），說明HbLPAT2a和HbLPAT2b定位于細胞的內質網上，與之前的蛋白亞細胞定位預測結果相同。

3""討論

天然橡膠具有彈性強、可塑性高、回彈力強、抗沖擊力強以及散熱性良好等諸多性能，可用于生產包括航空輪胎和醫(yī)用手套在內的50多萬種橡膠制品，對運輸、醫(yī)藥和國防等行業(yè)至關重要。

天然橡膠之所以具有高彈性是源于其具有較大的分子量和交互網絡結構，雙親性的磷脂與橡膠鏈α端相連有利于天然橡膠形成分支結構。此外，磷脂作為天然橡膠中最重要的非膠物質之一還顯著影響膠乳的產量和穩(wěn)定性，并且對生膠的硫化特性和抗氧老化性能也有一定影響[2]。鑒定參與橡膠樹磷脂生物合成的酰基轉移酶，對于理解這些基因在膠乳代謝和膠乳品質調控中的功能具有重要的意義。隨著分子生物學的發(fā)展，大量研究表明，LPAT參與調控植物磷脂合成積累過程，介導?；?CoA連接到甘油骨架sn-2位上的?；磻?，催化LPA生成PA，是磷脂磷脂生物合成的一個限速酶。目前，LPAT基因已在多種植物中被克隆出來，并對其基因功能進行了初步驗證，如紫蘇（Perilla"frutescens）、花生、水稻（Oryza"sativa）等[23-25]，但在橡膠樹中未見報道。

本研究克隆獲得的2個橡膠樹HbLPAT2基因，序列分析表明HbLPAT2共有5個保守的Motifs，具有高度保守性。其中Motif"I（NHXXXXD）為膜結合的O-?；D移酶（MBOAT）家族，其組氨酸（H）及天冬氨酸（D）是催化酰基轉移酶活性的重要位點，Motif"III（VLALFVEGTRF）上的EGT-"Box不但是?；D移酶的功能位點，還是與?；D移酶作用底物溶血磷脂酸的結合位點[26-27]，基因結構的高度保守意味著它們在植物磷脂生物合成過程中發(fā)揮著相似的功能。同時發(fā)現這2個蛋白均具有完整的PLN02380（1～374，1～312）溶血磷脂酸?；D移酶功能結構域，推測HbLPAT2很可能參與橡膠樹膠乳的磷脂生物合成和代謝調控。生物信息學分析發(fā)現HbLPAT2a和HbLPAT2b分別有3個跨膜結構域和1個跨膜結構域，均無信號肽，為親水性蛋白，且含有多個磷酸化位點。HbLPAT2的跨膜結構域均位于N端，這些跨膜區(qū)有助于HbLPAT2錨定于膜上。磷酸位點作為修飾位點，可激活或抑制染色質構型，調控基因座的轉錄。HbLPAT2a和HbLPAT2b蛋白分別具有33個和26個潛在的磷酸化位點（數量最多的為絲氨酸），說明可逆磷酸化調控在實現HbLPAT2蛋白的功能上具有一定作用，在以后的分子育種中可以對它加以利用。如AtWRI1受蔗糖非發(fā)酵相關蛋白激酶（SNF1-related"protein"kinase）KIN10介導降解，其70位點的蘇氨酸和166位點的絲氨酸發(fā)揮了重要作用，2個位點突變后能夠增強AtWRI1蛋白的穩(wěn)定性[28]。

亞細胞定位預測和驗證均表明HbLPAT2a和HbLPAT2b定位于內質網上，這與大部分調控磷脂合成基因的定位相同。膠乳中HbLPAT家族成員表達量分析結果表明，HbLPAT2的表達量顯著高于另外4個HbLPATs，在擬南芥的AtLPAT家族成員中，AtLPAT2定位于內質網且參與了磷脂的合成。在底物選擇上更偏好18：1-CoA[10]，橡膠樹膠乳中的脂肪酸主要為棕櫚酸（C16：0）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）和亞油酸（C18：2），這4個主要脂肪酸中3個為C18脂肪酸，這可能是橡膠樹膠乳的HbLPATs中HbLPAT2表達量高的原因。HbLPAT2a和HbLPAT2b在橡膠樹不同組織中的表達分析結果表明，二者均在種子中的相對表達最高，顯著高于其他組織，其次為花。種子作為植物合成油脂的主要場所，絕大多數負責油脂合成相關的基因均在種子中高表達，花作為生殖器官，在開花過程中也需要大量脂質的合成[29]，這也解釋了HbLPAT2為何會在橡膠樹種子和花中的表達量顯著高于其他組織。而在其他組織部位中，膠乳的HbLPAT2表達量最高，考慮到與其他組織部位相比膠乳中豐富的磷脂含量，再結合之前的研究結果，說明HbLPAT2是橡膠樹膠乳中主要負責磷脂合成的基因，但是否為唯一負責磷脂合成的基因，還需要后續(xù)實驗進行驗證。

4""結論

本研究通過分子生物學手段首次克隆出了橡膠樹HbLPAT2a和HbLPAT2b兩個基因并完成了生物信息學分析和表達分析，結果初步表明HbLPAT2a和HbLPAT2b參與了橡膠樹膠乳磷脂的生物合成。后續(xù)將進一步探究HbLPAT2a和HbLPAT2b通過參與磷脂合成過程對膠乳品質的影響，為橡膠樹膠乳品質的遺傳改良提供科學基礎和分子靶標。

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