摘""要：番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya"ringspot"virus，"PRSV）是番木瓜生產(chǎn)上最嚴重的病害之一，其發(fā)病率高，傳播快，危害重。為及時發(fā)現(xiàn)感染PRSV的番木瓜植株，本研究建立了分別利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)和熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測番木瓜植株感染PRSV的方法，利用這2種方法檢測多株轉(zhuǎn)基因番木瓜與非轉(zhuǎn)基因番木瓜的PRSV含量，并對結(jié)果進行比較分析。結(jié)果表明：利用PRSV多肽抗原作為標準品制備的抗體建立的標準曲線擬合度較好，可用于ELISA法檢測PRSV；qRT-PCR法中選擇的內(nèi)參基因Cpa03g018830在番木瓜的不同生長階段均穩(wěn)定表達，可作為PRSV含量測定的內(nèi)參基因；ELISA法和qRT-PCR法對多株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因番木瓜植株中PRSV含量的檢測結(jié)果基本一致，表明這2種方法均可用于番木瓜植株中PRSV含量的檢測。利用這2種檢測手段，可及時發(fā)現(xiàn)并鏟除感染了PRSV的番木瓜植株，有效預(yù)防與控制PRSV傳播。

關(guān)鍵詞：番木瓜環(huán)斑病毒；酶聯(lián)免疫吸附；熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR中圖分類號：S436.67""""""文獻標志碼：A

Detection"of"Papaya"PRSV"Virus"Using"ELISA"and"qRT-PCR"Techniques

XIE"Xiuju1，"XIA"Qiyu1*，"HUO"Shanshan1，"DU"Xiaoxi1，"MAI"Xianjun2，"ZHANG"Yuliang1，"GUO"Anping1，"LI"Feng3，"KONG"Xiangyi2**，"ZHAO"Hui1**

1."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Hainan"Key"Laboratory"for"Biosafety"Monitoring"and"Molecular"Breeding"in"Off-Season"Reproduction"Regions，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"2."Sanya"Academy"of"Tropicalnbsp;Agriculture，"Sanya，"Hainan"572022，"China;"3."Bellagen"Biotechnology"Co.，"Ltd.，"Jinan，"Shandong"250300，"China

Abstract："Papaya"ringspot"virus"（PRSV）"is"one"of"the"most"serious"diseases"in"papaya"production，"with"high"incidence"rate，"rapid"transmission"and"serious"harm."To"detect"papaya"plants"infected"with"PRSV"in"a"timely"manner，"this"study"established"methods"for"detecting"papaya"plants"infected"with"PRSV"using"enzyme-linkednbsp;immunosorbent"assay"（ELISA）"and"fluorescence"quantitative"reverse"transcription"PCR"（qRT-PCR）."The"two"methods"were"used"to"detect"the"PRSV"content"of"multiple"transgenic"and"non"transgenic"papaya"plants，"and"the"results"were"compared."The"results"showed"that"the"standard"curve"established"using"PRSV"peptide"antigen"as"the"standard"and"antibodies"prepared"from"it"had"good"fitting，"and"could"be"used"for"ELISA"detection"of"PRSV;"The"reference"gene"Cpa03g018830"selected"in"qRT-PCR"method"was"stably"expressed"at"different"growth"stages"of"papaya"and"could"be"used"as"a"reference"gene"for"PRSV"content"determination;"The"detection"results"of"PRSV"content"in"multiple"transgenic"and"non"transgenic"papaya"plants"using"ELISA"and"qRT-PCR"methods"were"basically"consistent，"indicating"that"both"methods"can"be"used"for"the"detection"of"PRSV"content"in"papaya"plants."By"using"thee"two"detection"methods，"papaya"plants"infected"with"PRSV"can"be"detected"and"eradicated"in"a"timely"manner，"effectively"preventing"and"controlling"the"spread"of"PRSV.

Keywords："PRSV;"ELISA;"qRT-PCR

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.12.005

番木瓜（Carica"papaya"L.）是全球熱帶地區(qū)的重要出口水果和消費品之一[1-2]。番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya"ringspot"virus，"PRSV）是一種世界性的番木瓜病害，其發(fā)病率高，傳播快，危害重，是番木瓜生產(chǎn)上最嚴重的病害之一。PRSV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）Y病毒屬（Potyvirus）[3]，按寄主范圍的不同可劃分為P和W兩個株系，PRSV-P發(fā)生在大多數(shù)栽培番木瓜的熱帶、亞熱帶國家。PRSV-P感染的典型特征是在受感染的番木瓜果實上產(chǎn)生環(huán)斑癥狀[4]。除環(huán)斑外，PRSV還會產(chǎn)生一系列其他癥狀。如葉片出現(xiàn)花葉、萎黃和卷曲；葉柄和樹干上部呈現(xiàn)水浸油性條紋；幼葉變形，有時會產(chǎn)生類似于螨蟲損傷的皺縮癥狀。受PRSV感染的番木瓜植株表現(xiàn)出發(fā)育遲緩和花脫落等生理現(xiàn)象，導(dǎo)致產(chǎn)量嚴重下降。PRSV是通過蚜蟲進行傳播，在樹間傳播速度極快，發(fā)病的植株需及早鏟除。因此，為了及時發(fā)現(xiàn)番木瓜植株是否受到PRSV感染，亟需一種簡單、快速、靈敏的檢測PRSV的方法。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是一種結(jié)合抗原抗體免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)的方法，具有快速檢測出植物RNA病毒的優(yōu)點。自CLARK等[5]對ELISA檢測病毒的理論方法進行了研究和報道后，ELISA技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于植物病毒檢測。在之前的研究中，PRSV血清學(xué)檢測多以粗提病毒粒子為抗原，存在抗體制備效價低、制備繁瑣等缺點[6-8]，限制了PRSV病毒抗血清的應(yīng)用。近些年來，研究者利用分子生物學(xué)方法在大腸桿菌中高效表達病毒的外殼蛋白，用純化的蛋白免疫大白兔，制備?；钥寡澹瑸槔肊LISA技術(shù)建立病毒檢測體系研究奠定了基礎(chǔ)[9]。CHEN等[10]開發(fā)了一批H7亞型特異性單克隆抗體（mAb），并建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（DAS-ELISA）法測定H7蛋白的含量和檢測除H7HA亞型以外的甲型流感病毒，顯示出極好的靈敏度和高特異性。MARTINEZ"VIEDMA等[11]使用蟲媒病毒特異性肽對收集的339個樣本進行血清學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)基于多肽的多重ELISA在感染病毒后2周就可以高效識別寨卡病毒（ZIKV）抗體。

熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）因其快速、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點，廣泛地應(yīng)用于動物病毒和植物病毒檢測[12-13]。即使在中等質(zhì)量的DNA情況下，如從石蠟或福爾馬林固定組織中提取的DNA，熒光定量PCR也可以有效地用于病毒檢測[14-15]。qRT-PCR常用的2種方法有TaqMan探針法和SYBR"Green"I染料法，其中SYBR"Green"I染料法因其引物設(shè)計簡單、檢測成本低而被廣泛使用[16]。許多研究表明，qRT-PCR在量化病毒DNA方面是準確有效的，HARJU等[17]開發(fā)了qRT-PCR（TaqMan）測定法，用于甜菜壞死黃脈病毒（BNYVV）的特異性檢測，發(fā)現(xiàn)TaqMan的靈敏度是常規(guī)RT-PCR測定的10"000倍。CHENG等[18]開發(fā)了基于SYBR"Green"I的實時PCR檢測方法，用于正痘病毒的檢測和定量，該方法具有很高的重現(xiàn)性和可靠性，檢測速度更快且具有更高的靈敏度。COERTSE等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與TaqMan探針法相比，SYBR"Green"I檢測的靈敏度大于95%，表明染料法在病毒檢測中同樣具有較高的靈敏度。

以往的研究中，病毒抗體的制備步驟繁瑣，而本研究采用多肽抗原制備PRSV的多克隆抗體，建立了簡單易行的ELISA檢測番木瓜植株中PRSV病毒含量的方法；并以番木瓜單拷貝基因為內(nèi)參基因，首次建立了qRT-PCR檢測番木瓜植株P(guān)RSV病毒含量的方法，并對2種檢測方法得到的番木瓜植株中PRSV的含量進行比較。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""轉(zhuǎn)基因番木瓜與非轉(zhuǎn)基因番木瓜均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院。轉(zhuǎn)基因番木瓜共18株，包括1株轉(zhuǎn)入海南PRSV的CP基因的T0代番木瓜、6株轉(zhuǎn)入海南PRSV的輔助成分-蛋白酶基因（HC-Pro）發(fā)夾結(jié)構(gòu)的T0代番木瓜苗、8株轉(zhuǎn)入海南PRSV的復(fù)制酶基因（Nib）發(fā)夾結(jié)構(gòu)的T0代番木瓜苗、3株轉(zhuǎn)入海南PRSV的CP基因全長的T1代番木瓜；非轉(zhuǎn)基因番木瓜共6株；非轉(zhuǎn)基因且無PRSV癥狀的番木瓜組培脫毒苗1株。

1.1.2""試劑耗材""植物RNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Q3"SYBR"qPCR"Master"Mix購自吐露港生物科技有限公司；PCR平蓋八排管購自甄選（Labselect）公司；脫脂奶粉購自國賽生物技術(shù)有限公司，96孔酶聯(lián)板購自康寧公司；TMB雙組分顯色試劑盒和Goat"Anti-Rabbit"IgG/HRP購自北京索萊寶科技有限公司。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2""方法

1.2.1""ELISA法測定番木瓜植株的PRSV含量""（1）PRSV的多克隆抗體制備。制備多克隆抗體的抗原肽的氨基酸序列為：DQVPPPTKSVHHEGC，使用的載體為血藍蛋白載體KLH，由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成抗原及抗體。

（2）標準曲線繪制。以合成的抗原PRSV-1（93.4%"pure）為標準品進行梯度稀釋，繪制吸光度與濃度的標準曲線。首先將標準品配制成1000"ng/mL的母液，準備13只1.5"mL的離心管，編號為S1～S12、CK（對照），分別加入400"μL"coating"buffer稀釋液；吸取400"μL母液至S1管，進行2倍稀釋，吹打10次，混勻，渦旋振蕩5"s，從S1管中吸取400"μL液體至S2管，吹打混勻，繼續(xù)以上步驟，進行2倍梯度稀釋直至稀釋到S12。將配置好的梯度稀釋液進行間接法ELISA實驗，加入顯色液30"min后測定吸光度，繪制標準曲線。

（3）番木瓜植株的PRSV含量測定。在常年發(fā)?。≒RSV）的番木瓜果園中選擇不同生長階段的番木瓜植株樣品共24株，包括18株轉(zhuǎn)基因番木瓜（編號為：CP-1-3、H-1-6、H-1-10、H-1-22、H-2-15、H-3-4、Hc-n-35、N-1-8、N-2-21、N-2-31、N-n-17、N-n-20、N-n-23、N-n-24、N-n-26、YK-1-9、YK-2-11、YK-2-13）和6株非轉(zhuǎn)基因番木瓜（編號為：F-5、F-16、F-25、F-28、F-30、F-50）。每株均在生長期為11、13、14、18、19、21個月時采集葉片（編號為：11M、13M、14M、18M、19M、21M），每個樣品取0.3"g，其中，取0.15"g用于ELISA實驗，剩余樣品放–80"℃保存。另取1株非轉(zhuǎn)基因且無PRSV癥狀的番木瓜組培脫毒苗的葉片作為陰性對照，以稀釋100倍的抗原作為陽性對照。所有樣品進行間接ELISA實驗，測定吸光度。若樣品OD值/陰性對照OD值≥2.0，則將該植株判定為PRSV陽性；若樣品OD值/陰性對照OD值lt;2.0，則將該植株判定為PRSV陰性[20]。將判定為陽性的樣品代入標準曲線中，計算出PRSV含量，并將不同時期樣本PRSV含量的數(shù)據(jù)繪制成熱圖。

1.2.2""qRT-PCR法測定番木瓜植株的PRSV的含量""（1）RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。取1.2.1（3）中的24株番木瓜剩余的葉片提取RNA。另采集1株番木瓜組培脫毒苗的葉片0.15"g，提取RNA。以獲得的RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，–80"℃保存待用。

（2）引物設(shè)計及驗證。通過DNAMAN軟件對比39株來源于海南不同地區(qū)不同PRSV株系的NIb序列[21]，選取其保守序列，使用生工生物工程（上海）股份有限公司官網(wǎng)引物設(shè)計工具進行qRT-PCR引物設(shè)計（NIb-F：nbsp;5'-AGTGGTCAGCCT TCGACAGT-3'，"NIb-R：5'-CCTTCGTGTCGTAA CCAGCC-3'）。以番木瓜Cpa03g018830基因為內(nèi)參基因（830-F："5'-TTCGAACGAGTCTGCA GT GG-3'，"830-R："5'-ACCACCTGAACCCAGGC TAA-"3'），并對其表達量進行穩(wěn)定性檢測。隨機選擇3份感染PRSV的番木瓜的cDNA為模板，進行熒光定量PCR實驗，驗證內(nèi)參基因Cpa03g018830和目的基因NIb引物的有效性。反應(yīng)體系為：2×Q3"SYBR"qPCR"Master"Mix"10"μL，引物（10"μmol/L）各0.4"μL，cDNA模板"1"μL，加無菌水至20"μL。擴增程序為：95"℃預(yù)變性30"s；95"℃"10"s，58"℃"30"s，40個循環(huán)；融解曲線為95"℃"15"s，60"℃"60"s，95"℃"15"s。反應(yīng)結(jié)束后，通過擴增曲線及熔解曲線判定引物是否有效。

（3）內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性檢測。采用熒光定量PCR對不同生長階段番木瓜葉片Cpa03g-"018830基因的表達量進行穩(wěn)定性測定，以CT值的波動情況評價其是否能應(yīng)用于本研究的內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.2（2）。

（4）番木瓜植株的PRSV含量測定。以番木瓜組培脫毒苗為參照，使用qRT-PCR測定24個轉(zhuǎn)基因番木瓜和非轉(zhuǎn)基因番木瓜的不同生長階段樣品中的PRSV含量。以CPa03g018830為內(nèi)參基因，以PRSV的NIb基因為目的基因，進行qRT-"PCR擴增，每個樣品3次重復(fù)，反應(yīng)體系及擴增程序同1.2.2（2）。得出每個樣品的CT值后，利用2–ΔΔCT法進行相對定量分析，計算每個樣品PRSV的相對含量，并將不同時期樣品的數(shù)據(jù)繪制成熱圖。并與ELISA法測定的PRSV含量進行比較分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""ELISA法測定PRSV的含量

2.1.1""標準曲線的繪制""依據(jù)ELISA實驗的標準品的吸光度與濃度的結(jié)果（表1）繪制出標準曲線（圖1），標準曲線公式為"（R2=0.9998）。此公式R2值大于0.99，表明線性公式擬合較好，可用于后續(xù)實驗樣品的PRSV含量計算。

2.1.2""番木瓜植株的PRSV含量測定""各個時期轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株樣品的PRSV的含量如圖2所示，非轉(zhuǎn)基因番木瓜在11個月的時候就能檢測到少量的PRSV，在14個月的時候，非轉(zhuǎn)基因番木瓜的病毒含量達到較高的水平，隨后，PRSV含量持續(xù)升高。大部分轉(zhuǎn)基因植株感染前期只能檢測到少量的PRSV，隨著感染時間的推移，病毒含量也開始升高，在18個月的時候病毒含量達到較高的水平，部分植株的PRSV含量仍然在較低的水平，個別植株的病毒含量在后期反而降低。

2.2""qRT-PCR法測定番木瓜植株中PRSV的含量

2.2.1""引物驗證""隨機選擇3份感染PRSV的番木瓜葉片樣品對引物進行驗證，結(jié)果（圖3）表明，利用內(nèi)參基因Cpa03g018830和目的基因NIb的引物擴增后，均有明顯的擴增曲線，且熔解曲線均具有唯一的吸收峰，因此這2對引物可用于qRT-PCR法檢測番木瓜的PRSV含量。

2.2.2""Cpa03g018830基因的穩(wěn)定性驗證""qRT-"PCR分析中的定量循環(huán)值（CT）反映目的基因的表達量，CT值越低，目的基因的表達量越高。對不同階段的番木瓜葉片Cpa03g018830基因的qRT-PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，番木瓜植株各生長期該基因的CT值在23.37～23.72之間（圖4）。這表明各生長期的番木瓜植株Cpa03g018830基因的表達量較穩(wěn)定。為了進一步綜合評估Cpa03g 018830基因在番木瓜不同生長時期的穩(wěn)定性，將熒光定量實驗得到的CT值進行校正，綜合geNorm進一步分析數(shù)據(jù)。geNorm分析原理是將候選內(nèi)參基因的CT值轉(zhuǎn)換成相對表達量（M），M值較小時，表示基因的穩(wěn)定程度較高，如果Mgt;1.5，則表示此基因并不適宜用作內(nèi)參基因[22]。Cpa03g018830基因的geNorm分析如圖5所示，各生長期Cpa03g 018830基因的M值都在1.5以下，說明Cpa03g018830基因在番木瓜的不同生長階段均穩(wěn)定表達，因此可作為PRSV含量測定的內(nèi)參基因。

2.2.3""qRT-PCR法測定番木瓜植株的PRSV含量""各個生長時期的轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株對照樣本中PRSV的積累量如圖6所示，6棵非轉(zhuǎn)基因番木瓜植株中，隨著時間的推移，PRSV含量逐漸升高，在18個月的時候，病毒含量均急劇升高至較高的水平；轉(zhuǎn)基因番木瓜植株中，在受到PRSV侵染前期，大部分轉(zhuǎn)基因番木瓜植株的PRSV含量都較低，隨著病毒侵染時間的推移，大部分轉(zhuǎn)基因植株中的PRSV含量都開始上升，但一些植株的PRSV含量仍在較低的水平，少數(shù)植株中的PRSV含量上升至較高的水平后又逐漸減低。

3""討論

PRSV作為一種世界性的番木瓜病毒，番木瓜被其侵染后無法得到有效防治，嚴重影響番木瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，PRSV感染番木瓜后的早期檢測至關(guān)重要，一旦發(fā)現(xiàn)感染植株，應(yīng)立即將其連根拔除并銷毀，可有效延緩PRSV的傳播速度，降低發(fā)病率。

常用的檢測病毒的方法有qRT-PCR法和ELISA法。BRUISSO等[23]開發(fā)了多重TaqMan的qRT-PCR分析方法，用于檢測9種不同的病毒，并與ELISA法進行比較，發(fā)現(xiàn)大部分情況下，2種實驗方法可獲得相同的結(jié)果，但在某些情況下，僅可通過2種技術(shù)之一檢測到病毒。TORRE等[24]基于TaqMan技術(shù)建立了qRT-PCR方法，用來檢測3種在葫蘆中傳播的種子病毒，并將這些檢測方法與DAS（雙抗夾心）-ELISA進行了比較，其靈敏度分別是DAS-ELISA法測定的南瓜花葉病毒（SqMV）和黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的1000倍和10"000倍，說明qRT-PCR分析方法較DAS-ELISA靈敏度更高。然而，RNA檢測具有許多局限性，如時間久、成本高昂，且必須在專門的實驗室中進行。XIANG等[25]通過酶ELISA和金免疫層析測定（GICA）對血液進行SARS-"CoV-2"IgG/IgM檢測，在候選血液指標中，與標準的RNA檢測相比，通過ELISA檢測的血清IgG和IgM具有最佳的一致性和有效性，表明該方法可用于初步的病毒篩選，以滿足沒有RNA檢測能力的實驗室的檢測需求，或作為RNA檢測的補充。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，抗體制備技術(shù)不斷完善。為了建立更好的番木瓜植株中的PRSV檢測方法，本研究以直接合成的多肽抗原制備PRSV的多克隆抗體，建立了ELISA檢測PRSV病毒的方法，無需病毒的提取制備或原核表達等繁瑣的步驟，極大地簡化了抗體制備的步驟，縮短了實驗時間。此外，本研究以番木瓜中穩(wěn)定表達的基因Cpa03g018830為內(nèi)參基因，首次建立了番木瓜植株中PRSV含量的qRT-PCR的相對定量檢測方法，該方法無需制備PRSV的標準品及建立標準曲線，操作簡單，經(jīng)濟實用，適合大批量的樣品檢測。

采用以上2種方法對24株轉(zhuǎn)基因番木瓜及非轉(zhuǎn)基因番木瓜的不同生長階段的樣品進行了PRSV病毒的檢測，并對檢測得到的PRSV的含量進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同的樣品用2種方法測定的病毒含量大部分都較為一致，少數(shù)結(jié)果不一致的可能為樣品采樣誤差導(dǎo)致。從整體變化趨勢可以看出，非轉(zhuǎn)基因番木瓜從開始感染PRSV到發(fā)病，PRSV含量持續(xù)升高，一旦病毒侵襲，則毫無抵抗能力，直至減產(chǎn)死亡。而大部分轉(zhuǎn)基因番木瓜株系則表現(xiàn)出對PRSV較好的抗性，即使初期受到病毒侵襲，PRSV含量開始上升，但隨著small"RNA的基因沉默開始發(fā)揮作用，病毒含量又開始降低。然而，部分轉(zhuǎn)基因番木瓜株系在感染PRSV后含量持續(xù)增加，可能是由于插入位點干擾了番木瓜代謝過程，從而影響RNAi對抗病毒的作用；或者是由于不同株系在田間自然發(fā)病時期存在差異，導(dǎo)致small"RNA尚未開始發(fā)揮抗病作用。

綜上所述，本研究建立的檢測PRSV的ELISA法與qRT-PCR法可以共同使用，提高番木瓜植株早期感染PRSV的檢出率，可為PRSV的實驗室診斷、含量測定提供支持，提高檢測效率，減少工作量。

參考文獻

[1]"麥新敏."2006—2016年廣東四大佳果出口分析研究[D]."廣州："華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2017.MAI"X"M."Analysis"and"study"on"the"export"of"four"major"fruits"in"Guangdong"from"2006"to"2016[D]."Guangzhou："South"China"Agricultural"University，"2017."（in"Chinese）

[2]"禾本."墨西哥："全球最大番木瓜出口國[J]."中國果業(yè)信息，"2021，"38（7）："40.HE"B."Mexico："the"world's"largest"papaya"exporter[J]."China"Fruit"Industry"Information，"2021，"38（7）："40."（in"Chinese）

[3]"TRIPATHI"S，"SUZUKI"J"Y，"FERREIRA"S"A，"GONSALVES"D."Papaya"ringspot"virus‐P："characteristics，"pathogenicity，"sequence"variability"and"control[J]."Molecular"Plant"Pathology，"2008，"9（3）："269-280.

[4]"JENSEN"D"D."Papaya"virus"diseases"with"special"reference"to"papaya"ringspot[J]."Phytopathology，"1949，"39（3）："191-211.

[5]"CLARK"M"F，"ADAMS"A"N."Characteristics"of"the"microplate"method"of"enzyme-linked"immunosorbent"assay"for"the"detection"of"plant"viruses[J]."Journal"of"General"Virology，"1977，"34（3）："475-483.

[6]"GONSALVES"D，"ISHI"M."Purification"and"serology"of"Papaya"ring"spot"virus[J]."Phytopathology，"1980，"70："1028-"1032.

[7]"陳枝楠，"林孔勛，"范懷忠."番木瓜環(huán)斑病毒檢測技術(shù)研究[J]."中國病毒學(xué)，"1993，"9（3）："263-270.CHEN"Z"N，"LIN"K"X，"FAN"H"Z."Studies"on"techniques"of"detecting"Papaya"ring"spot"virus[J]."Virologica"Sinica，"1993，"9（3）："263-270."（in"Chinese）

• 肖火根，"范懷忠."植物組織粗汁液中的番木瓜環(huán)斑病毒的DAC-ELISA檢測技術(shù)[J]."中國病毒學(xué)，"1994，"9（3）："249-"255.XIAO"H"G，"FAN"H"Z."Studies"on"the"detection"of"Papaya"ring"spot"virus"in"infected"tissue"of"plant"by"ELISA[J]."Virologica"Sinica，"1994，"9（3）："249-255."（in"Chinese）
• 趙芹，"李華平，"謝大森，"何曉明，"張曙光，"羅少波."番木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因原核表達蛋白的抗血清制備及其檢測應(yīng)用[J]."園藝學(xué)報，"2012，"39（8）："1457-1464.ZHAO"Q，"LI"H"P，nbsp;XIE"D"S，"HE"X"M，"ZHANG"S"G，"LUO"S"B."Preparation"of"antiserum"of"prokaryotic"expression"protein"of"papaya"ring"spot"virus"coat"protein"gene"and"its"detection"application[J]."Acta"Horticulture"Sinica，"2012，"39（8）："1457-"1464."（in"Chinese）
• CHEN"L，"RUAN"F，"SUN"Y，"CHEN"H，"LIU"M，"ZHOU"J，"QIN"K."Establishment"of"sandwich"ELISA"for"detecting"the"H7"subtype"influenza"A"virus[J]."Journal"of"Medical"Virology，"2019，"91（6）："1168-1171.
• MARTINEZ"VIEDMA"M"D"P，"PANOSSIAN"S，"GIFFORD"K，"GARCíA"K，"FIGUEROA"I，"PARHAM"L，"PICKETT"B"E."Evaluation"of"ELISA-based"multiplex"peptides"for"the"detection"of"human"serum"antibodies"induced"by"Zika"virus"infection"across"various"countries[J]."Viruses，"2021，"13（7）："1319.
• PASIN"F，"KULASEKARAN"S，"NATALE"P，"SIMóN-"MATEO"C，"GARCíA"J"A."Rapid"fluorescent"reporter"quantification"by"leaf"disc"analysis"and"its"application"in"plant-virus"studies[J]."Plant"Methods，"2014，"10（1）："1-12.

[13]"CANDLAN"E"P，"KHORAN"F"P，"HANA"L."Molecular"identification"of"peste"des"petits"ruminants"virus"in"wild"goat"and"domestic"small"ruminants"by"real-time-PCR"technique"in"Erbil-Iraq[J]."Iraqi"Journal"of"Veterinary"Sciences，"2017，"31（1）："51-54.

• LU"S，"LI"X，"CALDERONE"R，"ZHANG"J，"MA"J，"CAI"W，"XI"L."Whole"blood"nested"PCR"and"real-time"PCR"amplification"of"Talaromyces"marneffei"specific"DNA"for"diagnosis[J]."Medical"Mycology，"2016，"54："162-168.
• NORLELAWATI"A"T，"MOHD"DANIAL"G，"NORA"H，"NADIA"O，"ZATUR"RAWIHAH"K，"NOR"ZAMZILA"A，"NAZNIN"M."Detection"of"SYT-SSX"mutant"transcripts"in"formalin-fixed"paraffin-embedded"sarcoma"tissues"using"one-step"reverse"transcriptase"real-time"PCR[J]."The"Malaysian"Journal"of"Pathology，"2016，"38："11-18.
• ABEL"P"P，"NELSON"R"S，"DE"B，"HOFFMANN"N，"ROGERS"S"G，"FRALEY"R"T，"BEACHY"R"N."Delay"of"disease"development"in"transgenic"plants"that"express"the"tobacco"mosaic"virus"coat"protein"gene[J]."Science，"1986，"232（4751）："738-743.
• HARJU"V"A，"SKELTON"A，nbsp;CLOVER"G"R"G，"RATTI"C，"BOONHAM"N，"HENRY"C"M，"MUMFORD"R"A."The"use"of"real-time"RT-PCR"（TaqMan）"and"post-ELISA"virus"release"for"the"detection"of"Beet"necrotic"yellow"vein"virus"types"containing"RNA"5"and"its"comparison"with"conventional"RT-PCR[J]."Journal"of"Virological"Methods，"2005，"123（1）："73-80.
• CHENG"W，"HE"X，"JIA"H，"CHEN"G，"WANG"C，"ZHANG"J，"JING"Z."Development"of"a"SYBR"Green"I"real-time"PCR"for"detection"and"quantitation"of"orthopoxvirus"by"using"ectromelia"virus[J]."Molecular"and"Cellular"Probes，"2018，"38："45-50.
• COERTSE"J，"MORTLOCK"M，"GROBBELAAR"A，"MOOLLA"N，"MARKOTTER"W，"WEYER"J."Development"of"a"pan-filoviridae"SYBR"green"qPCR"assay"for"biosurveillance"studies"in"bats[J]."Viruses，"2023，"15（4）："987.
• 苗得園，"楊兵，"李富強，"張培君，"龔玉梅，"李永清，"付磊，"高配亮."單抗夾心LAB-ELISA檢測豬偽狂犬病病毒的研究[J]."華北農(nóng)學(xué)報，"2001，"16（1）："127-131.MIAO"D"Y，"YANG"B，"LI"F"Q，"ZHANG"P"J，"GONG"Y"M，"LI"Y"Q，"FU"L，"GAO"P"L."Study"of"monoclonal"antibodies"sandwich"LAB-ELISA"detecting"Pseudorabies"virus"[J]."North"China"Journal"of"Agronomy，"2001，"16（1）："127-131."（in"Chinese）

[21]"趙輝，"張雨良，"孔華，"賈瑞宗，"朱蕓，"郭安平，"曾會才，"彭明."番木瓜環(huán)斑病毒海南株系植物RNAi表達載體的構(gòu)建[J]."熱帶作物學(xué)報，"2015，"36（12）："2210-2215.ZHAO"H，"ZHANG"Y"L，"KONG"H，"JIA"R"Z，"ZHU"Y，"GUO"A"P，"ZENG"H"C，"PENG"M."Construction"of"plant"RNAi"expression"vector"in"Hainan"strains"of"Papaya"ringspot"virus[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2015，"36（12）："2210-2215."（in"Chinese）

[22]"吳建陽，"何冰，"杜玉潔，"李偉才，"魏永贊."利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析的方法[J]."現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，"2017，"691（5）："278-281.WU"J"Y，"HE"B，"DU"Y"J，"LI"W"C，"WEI"Y"Z."Analysis"method"of"systematically"evaluating"stability"of"reference"genes"using"geNorm，"NormFinder"and"BestKeeper[J]."Modern"Agricultural"Science"and"Technology，"2017，"691（5）："278-281."（in"Chinese）

[23]"BRUISSON"S，"LEBEL"S，"WALTER"B，"PREVOTAT"L，"SEDDAS"S，"SCHELLENBAUM"P."Comparative"detection"of"a"large"population"of"grapevine"viruses"by"TaqMan"RT-qPCR"and"ELISA[J]."Journal"of"Virological"Methods，"2017，"240："73-77.

[24]"TORRE"C，"AGüERO"J，"GóMEZ-AIX"C，"ARANDA"M"A."Comparison"of"DAS-ELISA"and"qRT-PCR"for"the"detection"of"cucurbit"viruses"in"seeds[J]."Annals"of"Applied"Biology，"2020，"176（2）："158-169.

[25]"XIANG"J，"CHEN"Z，"ZHOU"J，"TIAN"D，"RAN"X，"ZHANG"Z，"ZHOU"Y."Comparative"analysis"of"the"main"haematological"indexes"and"RNA"detection"for"the"diagnosis"of"SARS-"CoV-2"infection[J]."BMC"Infectious"Diseases，"2020，"20（1）："1-7.