摘 要：產(chǎn)酸酵母作為酸湯發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株，是影響酸湯產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素。本文通過形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)，對從酸湯樣品中分離出的產(chǎn)酸菌株進(jìn)行鑒定，并測定分析其產(chǎn)酸、耐酸和耐膽鹽能力。結(jié)果表明，RS-14為盔狀畢赤酵母（Pichia galeiformis），CS-16和CS-19為膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens），45、RS-13、RS-15、CS-21和CS-22為滿洲畢赤酵母（Pichia manshurica）。其中，菌株45的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，總酸含量達(dá)到41.47 g·L-1，且8株酵母菌均能在pH值為1.5和牛膽鹽濃度為0.70%的條件下生長，具有較高的耐酸性能和耐牛膽鹽性能。本研究通過對酸湯中產(chǎn)酸酵母的篩選及其性能測定，為開發(fā)酸湯純種發(fā)酵菌株和提升酸湯發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：酵母菌；酸湯；有機(jī)酸；耐膽鹽

Abstract： Acid-producing yeast， as the dominant strain in the fermentation process of sour soup， is the key factor affecting the quality of sour soup products. In this paper， the acid-producing strains isolated from sour soup samples were identified by morphology， physiology， biochemistry and molecular biology， and their acid production， acid resistance and bile salt resistance were determined and analyzed. The results showed that RS-14 was Pichia galeiformis， CS-16 and CS-19 were Pichia membranacefaciens， and 45、RS-13、RS-15、CS-21 and CS-22 were Pichia manshurica. Among them， strain 45 has the strongest acid production capacity， with a total acid content of 41.47 g·L-1， and all 8 strains of yeast can grow under the conditions of pH 1.5 and bile salt concentration of 0.70%， with high acid and bile salt resistance. In this study， the screening and performance determination of acid-producing yeast in sour soup provided theoretical support for the development of pure fermentation strains of sour soup and the improvement of the quality of sour soup fermentation products.

Keywords： yeast; sour soup; organic acid; bile salt tolerance

酸湯作為貴州省黔東南苗族、侗族的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，深受當(dāng)?shù)叵M(fèi)者的喜愛。酸湯有多種類型，主要分為白酸湯和紅酸湯等。傳統(tǒng)的白酸湯主要以米湯（糯米或秈米）為原料，通過自然發(fā)酵制作而成[1]；紅酸湯主要是由紅辣椒和紅番茄再輔以一定量的調(diào)味料分別發(fā)酵后再按照一定比例混合發(fā)酵制作而成[2]。紅酸湯是一種利用蔬菜自身附著的微生物或添加人工篩選的乳酸菌，在厭氧環(huán)境下發(fā)酵而成，深受消費(fèi)者喜愛的特色風(fēng)味食品。

在紅、白酸湯發(fā)酵過程中，因發(fā)酵環(huán)境和地理環(huán)境不同，微生物菌群組成存在差異，但乳酸菌（Lactobacillaceae）和酵母菌（Saccharomycetaceae）作為發(fā)酵產(chǎn)品的共性優(yōu)勢菌，在酸湯發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用[3]。何揚(yáng)波等[4]探究出納木雷氏乳桿菌（Lactobacillus namurensis）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）分別為辣椒酸湯和番茄酸湯的優(yōu)勢乳酸菌，漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）分別為兩種酸湯發(fā)酵后期的優(yōu)勢真菌。張璇[5]發(fā)現(xiàn)紅酸湯中的微生物主要為酵母菌、乳酸菌和芽孢桿菌等。王琪琪等[6]研究結(jié)果表明，在白酸湯中，屬水平上的乳桿菌屬、畢赤酵母屬和假絲酵母屬等為優(yōu)勢菌屬；辣椒紅酸湯中酵母屬、雙足囊菌屬和畢赤酵母屬為優(yōu)勢真菌屬；番茄紅酸湯中哈薩克斯坦酵母屬和畢赤酵母屬為優(yōu)勢真菌屬。石敏等[7]發(fā)現(xiàn)“凱里米酸湯”發(fā)酵中的主要菌群有乳桿菌和酵母菌等。綜上，酵母菌在酸湯食品的發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用[8-9]。

貴州省黔東南地區(qū)酸湯發(fā)酵主要采用農(nóng)家自釀法，通過自然發(fā)酵的方式進(jìn)行酸湯制作。但這種發(fā)酵方式存在酸湯制作周期長、有效成分含量低、易受周圍環(huán)境影響等問題，從而導(dǎo)致酸湯產(chǎn)品質(zhì)量無法得到有效保障。吳茂釗等[10]篩選出副干酪乳酸桿菌G1-3（Lactobacillus paracasei）和印迪卡有孢圓酵母G2-2（Torulaspora indica），由兩株菌復(fù)配發(fā)酵后制作的秈米白酸湯和糯米白酸湯中的總酸含量相較于自然發(fā)酵酸湯分別提高了5倍和18倍，且兩株菌復(fù)配發(fā)酵后的白酸湯感官品質(zhì)也優(yōu)于自然發(fā)酵。胡悅等[11]將用乳酸菌發(fā)酵4 d的番茄酸湯和辣椒酸湯按1∶1復(fù)配后接種于用酵母菌ym1-3發(fā)酵4 d的紅酸湯發(fā)酵體系中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株生長情況良好，可應(yīng)用于紅酸湯強(qiáng)化發(fā)酵模式系統(tǒng)研究；肖甜甜等[12]從貴州傳統(tǒng)特色民族食品苗家白酸湯中篩選出優(yōu)勢微生物乳酸菌和酵母菌，其中釀酒酵母YJ24菌株降糖率達(dá)72.84%，馬克斯克魯維酵母YJ1、曼氏畢赤酵母YX5菌株發(fā)酵產(chǎn)品感官得分較高。

當(dāng)前，國內(nèi)關(guān)于貴州黔東南酸湯的探究已涵蓋多個維度，包括乳酸菌的特性探索、代謝產(chǎn)物與風(fēng)味組分的分析、發(fā)酵流程的優(yōu)化策略、營養(yǎng)價值評估、微生物群落多樣性及其對酸湯質(zhì)量的效應(yīng)和對人體健康益處的探討[13-20]。但在酵母菌的篩選、多元菌株共培養(yǎng)技術(shù)以及針對酸湯中醋酸菌與產(chǎn)酸酵母的產(chǎn)酸效能及耐酸特性方面的研究較少。本研究從貴州黔東南市面上及自制的酸湯樣品中分離并遴選出產(chǎn)酸活性顯著的菌株，并對產(chǎn)酸酵母的耐受力與產(chǎn)酸性能進(jìn)行分析，旨在豐富紅、白酸湯發(fā)酵工藝的微生物資源庫，搭建酸湯產(chǎn)酸微生物數(shù)據(jù)庫，以期為食品企業(yè)制作高質(zhì)量酸湯提供科學(xué)依據(jù)與菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自制白酸湯、苗吳記白酸湯、紅酸湯，貴州苗吳記食品科技有限責(zé)任公司；氯化鈉、碳酸鈣和氫氧化鈉，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水葡萄糖，上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動微生物生長曲線分析儀RTS-1C，北京立信宏達(dá)科技有限責(zé)任公司；醫(yī)用離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司；自動菌落計數(shù)儀，上海磐麥科技有限公司；pH計，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基制備

YPD培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖2 g，蛋白胨1 g，酵母浸出粉0.5 g，瓊脂2 g，自然pH值；酵母菌產(chǎn)酸篩選培養(yǎng)基（100 mL）：在YPD培養(yǎng)基中添加CaCO3 1 g，瓊脂2 g；碳源同化試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基（100 mL）：（NH4）2SO4 0.50 g，KH2PO4 0.10 g，MgSO4 0.05 g，CaCl2 0.01 g，NaCl 0.01 g，酵母膏0.02 g，其他碳源2 g；氮源同化試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖2 g，MgSO4 0.05 g，酵母膏0.02 g，KH2PO4 0.1 g；產(chǎn)類淀粉化合物培養(yǎng)基（100 mL）：KH2PO4 0.10 g，（NH4）2SO4 0.50 g，MgSO4 0.05 g，CaCl2 0.01 g，NaCl 0.01 g，酵母膏0.1 g，葡萄糖3 g。

1.4 實驗方法

1.4.1 產(chǎn)酸菌株的篩選

從凱里酸湯樣品中稱取1 mL新鮮樣品加入50 mL滅菌離心管中，加入無菌水9 mL，于30 ℃、180 r·min-1搖床中振蕩30 min，制成懸浮液。取100 μL接種于10 mL的YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng)2 d。將培養(yǎng)液稀釋至10-4、10-5、10-6后，取各稀釋度培養(yǎng)液100 μL，涂布于含1%碳酸鈣的YPD培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，挑選并保存具有不同形態(tài)特征的單一菌落菌株。

1.4.2 菌株鑒定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

（1）形態(tài)學(xué)鑒定。將篩選得到的酵母菌株接種至YPD固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，觀察并記錄單個菌落形態(tài)。用接種環(huán)挑取單個菌落，均勻涂布于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察[21]。

（2）生理生化實驗。菌株糖發(fā)酵、碳源同化（麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和甘露醇）和氮源同化（蛋白胨、酵母膏、尿素、牛肉膏和硫酸銨）實驗等參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》，用于檢驗菌株對各種糖發(fā)酵、碳源及氮源的利用情況，并記錄結(jié)果[22]。

（3）分子生物學(xué)鑒定。采用DNA提取試劑盒對酵母DNA進(jìn)行提取。以提取的酵母DNA為模板，以26S rRNA基因通用引物NL1（5’ -GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3’）和NL4（5’ -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）為上下游引物，進(jìn)行26S rDNA片段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Po1ymerase Chain Reaction，PCR），而后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京擎科生物有限公司測序，所得基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性對比分析，選取同源性高的序列，用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。

1.4.3 菌株的產(chǎn)酸特性

接種1%菌懸液于YPD培養(yǎng)基中，空白組不接菌，然后將兩組平板同時置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液總酸度根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》（GB 12456—2021）中的酸堿指示劑滴定法對樣品進(jìn)行測定，發(fā)酵液pH值依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》（GB 5009.237—2016）進(jìn)行測定，每組重復(fù)3次。

1.4.4 耐酸、耐膽鹽性能評價

（1）耐酸性能評價。按照2%接種量將活化的酵母菌種子液分別接種到pH值為1.0、1.5、2.5和3.5的生理鹽水中，于37 ℃培養(yǎng)0 h、3 h后用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，每組重復(fù)3次，以不調(diào)節(jié)pH值的生理鹽水作為對照。

（2）耐牛膽鹽性能評價。按照2%接種量將活化的酵母菌種子液分別接種至牛膽鹽含量為0%、0.03%、0.10%、0.30%、0.50%和0.70%的生理鹽水中，于37 ℃培養(yǎng)0 h、4 h后用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，每組重復(fù)3次，以未加牛膽鹽的生理鹽水作為對照。酵母菌存活率計算公式為

n=A1/A2×100%（1）

式中：n表示存活率，%；A1表示鹽酸處理3 h或牛膽鹽處理4 h后的最終活菌數(shù)，CFU·mL-1；A2表示鹽酸或牛膽鹽處理處理0 h時的活菌數(shù)，CFU·mL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸酵母菌的分離

將從YPD篩選培養(yǎng)基中分離純化得到的23株酵母菌進(jìn)行產(chǎn)酸能力測定。結(jié)果表明，有8株酵母菌具有較好的產(chǎn)酸效果，并將其分別命名為45、RS-13、RS-14、RS-15、CS-16、CS-19、CS-21和CS-22。8株酵母菌在YPD固體培養(yǎng)基上生長72 h后，細(xì)胞形態(tài)和菌落形態(tài)見圖1。

2.2 生理生化測定

8株產(chǎn)酸酵母菌的生理生化實驗結(jié)果見表1、表2、表3。由表1和表2可知，各菌株可利用7個碳源，包括麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和甘露醇，但不產(chǎn)氣。由表3可知，各菌株可利用5個氮源，包括尿素、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏和硫酸銨。綜上，表明8株產(chǎn)酸酵母菌對于碳源、氮源具有廣譜性，能夠充分利用營養(yǎng)物質(zhì)以供自身生長。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

由圖2可知，將篩選出的8株菌株測序所得26S rRNA序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，可判定RS-14為盔狀畢赤酵母（Pichia galeiformis），CS-16和CS-19為膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens），45、RS-13、RS-15、CS-21和CS-22為滿洲畢赤酵母（Pichia manshurica）。

2.4 菌株產(chǎn)酸能力

由圖3可知，8株產(chǎn)酸酵母發(fā)酵48 h后的產(chǎn)酸能力由強(qiáng)至弱排序為45gt;CS-22gt;RS-15gt;CS-21gt;RS-13gt;CS-19gt;RS-14gt;CS-16，對應(yīng)的總酸含量分別為41.47 g·L-1、41.31 g·L-1、40.07 g·L-1、36.86 g·L-1、30.25 g·L-1、26.88 g·L-1、23.04 g·L-1和14.13 g·L-1。

與空白對照（未接菌培養(yǎng)基，pH值為6.01）相比，8株產(chǎn)酸酵母菌的pH值均呈現(xiàn)下降趨勢，其中45、RS-13、RS-14、RS-15、CS-16、CS-19、CS-21和CS-22的pH值分別降低了43.76%、42.76%、35.44%、44.59%、35.94%、40.27%、43.43%和42.76%，原因可能是此類菌株能夠借助糖類代謝途徑，生成乳酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸和檸檬酸等多種有機(jī)酸，導(dǎo)致發(fā)酵液中的pH值降低。

2.5 酵母菌耐酸能力分析

由于人胃液中含有大量的胃蛋白酶和鹽酸，標(biāo)準(zhǔn)胃液環(huán)境的pH值在2.0～3.5，餐后食物在人體胃液中停留的時間一般低于3 h，且因稀釋作用，pH值會呈現(xiàn)升高趨勢。與細(xì)菌和霉菌等產(chǎn)酸菌相比，酵母菌具有更強(qiáng)的酸耐受性[23-24]。而酸湯發(fā)酵過程中的pH值通常維持在3.0～4.0，顯示出較弱的酸性條件。因此，若微生物菌株能展現(xiàn)出更強(qiáng)的耐酸特性，則其在胃液環(huán)境中存活的可能性也隨之增加。由表4可知，在未調(diào)pH值的生理鹽水中培養(yǎng)3 h后，8株酵母菌的活菌數(shù)為4.30×105～1.10×106 CFU·mL-1；在pH=3.5的生理鹽水中培養(yǎng)3 h后，8株酵母菌的活菌數(shù)為6.30×105～3.13×106 CFU·mL-1，其中CS-16菌株的存活率最高為590.57%。在pH=2.5的生理鹽水中培養(yǎng)3 h后，8株酵母菌的活菌數(shù)為4.40×105～1.70×106 CFU·mL-1，其中RS-15菌株的存活率最高為380.77%。在pH=1.5的生理鹽水中培養(yǎng)3 h后，8株酵母菌的活菌數(shù)為0.80×105～2.80×105 CFU·mL-1，其中RS-14菌株的存活率最高，為83.33%。在pH=1.0的生理鹽水中培養(yǎng)3 h后，8株酵母菌的活菌數(shù)為0～9.00×104 CFU·mL-1，其中CS-21菌株的存活率最高為，21.43%。綜上，在pH值為1.5～3.5時，菌株的存活率隨初始pH值的降低呈下降趨勢，但各菌株均有存活，說明各菌株有一定的酸耐受能力。

2.6 酵母菌耐膽鹽能力分析

人體內(nèi)膽汁的生理濃度為0.3%～0.5%，食物通過小腸的時間約為4 h，膽汁的平均濃度為0.3%。因此，本實驗通過模擬胃腸道環(huán)境，比較牛膽鹽濃度對酵母菌存活率的影響，評價實驗菌株作為益生菌的可行性。由表5可知，在0.30%牛膽鹽濃度下作用4 h后，8株酵母菌的活菌數(shù)為1.86×105～3.45×105 CFU·mL-1，其中45的存活率最高為581.25%；在0.50%牛膽鹽濃度下作用4 h后，8株酵母菌的活菌數(shù)為1.83×105～4.05×105 CFU·mL-1，其中RS-15的存活率最高，為1 394.74%；在0.70%牛膽鹽濃度下作用4 h后，8株酵母菌的活菌數(shù)為1.21×105～4.01×105 CFU·mL-1，其中RS-14的存活率最高，為1 321.05%；而在未添加牛膽鹽作用4 h后，8株酵母菌的活菌數(shù)為2.16×105～6.25×105 CFU·mL-1，其中RS-14的存活率最高，為1 904.35%。綜上，各菌株對牛膽鹽的耐受程度較高。

3 結(jié)論與討論

貴州凱里酸湯大多采用農(nóng)家自然發(fā)酵，通過微生物間的相互作用對原料中的營養(yǎng)成分進(jìn)行分解，形成不同的物質(zhì)如有機(jī)酸、氨基酸等。湯慶莉等[25]的研究表明苗族酸湯中的有機(jī)酸主要是乳酸、乙酸、酒石酸、檸檬酸和蘋果酸等，其中以乳酸含量最高；萬寧威等[26]的研究表明在白酸湯發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢，以乳酸和乙酸為主。而有機(jī)酸具有緩解腸道消化壓力、抑制致病菌的生長以及調(diào)控胃腸道菌群等功能[27-28]。此外，有機(jī)酸的含量和種類也會影響酸湯的品質(zhì)。綜上，本研究從酸湯樣品中篩選出的8株優(yōu)勢產(chǎn)酸酵母，均具有較高的產(chǎn)酸能力和良好的耐牛膽鹽和耐酸特性，有助于酸湯的穩(wěn)定制備以及產(chǎn)品品質(zhì)的有效提升。

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基金項目：黔科合成果[2022]重點002號；黔科中引地[2022]4020；黔科合服企[2023]012。

作者簡介：潘宇（1997—），男，土家族，貴州沿河人，碩士，研究實習(xí)員。研究方向：食品微生物、發(fā)酵工程。

通信作者：楊熟英（1988—），女，苗族，貴州黃平人，碩士，高級工程師。研究方向：藥學(xué)及食品科學(xué)。E-mail： alei8879@163.com。