摘""要：膽堿單加氧酶（CMO）是高等植物體內(nèi)甜菜堿合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在植物抵御逆境生理過(guò)程中具有重要作用。在香蕉A、B參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中分別鑒定到1個(gè)CMO基因，對(duì)MaCMO與MbCMO基因組序列進(jìn)行生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)MbCMO可能由1個(gè)香蕉O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白編碼基因與MbCMO基因串聯(lián)形成?？寺≌拷瑼A（ZJ；AA基因型）、巴西蕉（BX；AAA基因型）、廣東大蕉（GD；AAB基因型）和金粉（JF；ABB基因型）的CMO基因編碼序列并測(cè)序比對(duì)，在ZJ和BX中鑒定到基因CMO-A，GD和JF中鑒定到基因CMO-A、CMO-B1和CMO-B2，JF中鑒定到基因CMO-H。鑒定到的4種香蕉CMO基因中，有23個(gè)共同的高頻密碼子，密碼子CUU和CCG分別是偏性最強(qiáng)和最弱的密碼子。CMO-A蛋白與CMO-H蛋白的氨基酸數(shù)量最少，均為425個(gè)；CMO-B1蛋白的氨基酸數(shù)量最多，為470個(gè)，且二級(jí)結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜；CMO-B2蛋白分子量最大，為52.02"kDa；CMO-A分子量最小，為47.48"kDa；4種CMO均屬于酸性蛋白，均不具有跨膜結(jié)構(gòu)且均為親水性蛋白；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示4種CMO均定位在葉綠體中。在進(jìn)化方面，植物CMO在進(jìn)化時(shí)單、雙子葉植物有明顯的分支，香蕉CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-B2蛋白與其他單子葉植物CMO蛋白親緣關(guān)系更近。RT-qPCR結(jié)果顯示：4種香蕉根中CMO在滲透脅迫前期上調(diào)表達(dá)，A基因組純合型ZJ與BX的CMO表達(dá)量高于A、B基因組雜合型GD與JF的CMO表達(dá)量；4種香蕉葉中CMO在滲透脅迫前期下調(diào)表達(dá)，其中A基因組純合型ZJ與BX的CMO表達(dá)量在滲透脅迫后期出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，A、B基因組雜合型GD與JF的CMO表達(dá)量高峰出現(xiàn)在10"d，而后15"d時(shí)表達(dá)量再次下調(diào)，并顯著低于ZJ與BX的CMO表達(dá)量。本研究揭示了香蕉A、B基因組間CMO基因的差異和不同基因型香蕉中CMO基因在滲透脅迫下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究香蕉A、B基因組CMO基因生物學(xué)功能，特別是來(lái)源于不同基因組的CMO基因與香蕉抗?jié)B透脅迫能力間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為利用基因工程提高香蕉抗逆性提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：香蕉；A、B基因組；膽堿單加氧酶合成基因；表達(dá)特性；抗逆性中圖分類(lèi)號(hào)：S668.1""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning"and"Expression"Characteristics"of"Choline"Monooxygenase"Gene"in"Banana"A"and"B"Genomes"under"Osmotic"Stress

ZHU"Bowei1，"YU"Jiaxuan1，"LI"Xinguo1，2*，"LIU"Juhua2，3*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."National"key"Laboratory"for"Tropical"Crop"Breeding，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"3."Institute"of"Tropical"Crops"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："Choline"monooxygenase"（CMO）"is"a"key"enzyme"in"the"synthesis"of"betaine"in"higher"plants"and"plays"an"important"role"in"the"physiological"process"of"plant"resistance"to"stress."A"CMO"gene"was"identified"in"banana"A"and"B"reference"genomes"in"banana"gene"database，"and"the"biological"information"analysis"of"MaCMO"and"MbCMO"genome"sequences"showed"that"MbCMO"might"be"formed"by"a"gene"encoding"a"banana"O-fucosyltransferase"family"protein"and"MbCMO"gene"in"tandem."The"CMO"gene"coding"sequences"of"Zhanjiang"AA"（ZJ;"AA"genotype），"Baxijiao"（BX;"AAA"genotype），"Guangdong"Dajiao"（GD;"AAB"genotype）"and"Jinfen"（JF;"ABB"genotype）"were"cloned"and"compared，"it"was"found"that"ZJ"and"BX"only"contained"CMO-A，"GD"and"JF"both"contained"CMO-A，"CMO-B1"and"CMO-B2，"and"JF"also"contained"CMO-H."Codon"usage"characteristics"showed"that"there"were"23"common"high"frequency"codons"among"the"four"banana"CMO"gene，"and"the"codons"CUU"and"CCG"were"the"most"biased"and"the"weakest"codons，"respectively."The"physicochemical"properties"of"CMO-A"protein"and"CMO-H"protein"showed"that"the"minimum"number"of"amino"acids"was"425，"the"maximum"number"of"amino"acids"was"470，"and"the"secondary"structure"of"CMO-B1"protein"was"the"most"complex."The"molecular"weight"of"CMO-B2"protein"was"52.02"kDa，"and"the"molecular"weight"of"CMO-A"protein"was"47.48"kDa."All"the"four"CMO"proteins"were"acidic"proteins，"which"did"not"have"a"transmembrane"structure"and"were"hydrophilic"proteins."Subcellular"localization"prediction"showed"that"all"four"CMO"were"localized"in"chloroplasts."In"terms"of"evolution，"plant"CMO"had"obvious"branches"in"monodicotyledonous"plants"during"evolution，"and"the"CMO-A，"CMO-H，"CMO-B1"and"CMO-B2"proteins"of"banana"were"more"closely"related"to"other"monocotyledonous"plant"CMO"proteins."The"results"of"RT-qPCR"showed"that"CMO"expression"was"up-regulated"in"the"four"kinds"of"banana"roots"in"the"early"stage"of"osmotic"stress，"and"the"expression"levels"of"ZJ"and"BX"CMO"in"homozygous"A"genome"were"higher"than"those"of"GD"and"JF"CMO"in"heterozygous"A"and"B"genomes."CMO"expression"in"the"four"kinds"of"banana"leaves"was"down-regulated"at"the"early"stage"of"osmotic"stress."The"expression"levels"of"homozygous"ZJ"and"BX"CMO"in"A"genome"were"up-regulated"at"the"late"stage"of"osmotic"stress，"while"the"expression"levels"of"heterozygous"GD"and"JF"CMO"in"A"and"B"genomes"peaked"at"10"days"and"then"down-regulated"again"at"15"days"later."It"was"significantly"lower"than"that"of"ZJ"and"BX"CMO."This"study"revealed"the"differences"of"CMO"genes"between"the"A"and"B"genomes"of"bananas"and"the"expression"patterns"of"CMO"genes"in"different"genotypes"of"bananas"under"osmotic"stress，"which"would"lay"a"foundation"for"further"research"on"the"biological"functions"of"CMO"genes"in"the"A"and"B"genomes"of"bananas，"especially"the"relationship"between"CMO"genes"derived"from"different"genomes"and"the"ability"of"banana"to"resist"osmotic"stress."It"would"provide"a"reference"for"improving"the"stress"resistance"of"banana"by"genetic"engineering.

Keywords："banana;"A，"B"genome;"CMO"gene;"characteristic"of"expression;"stress"resistance

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.003

滲透脅迫作為影響作物生長(zhǎng)的主要環(huán)境因素之一，是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害，在自然條件下，多種非生物脅迫都會(huì)引起植物與環(huán)境間滲透勢(shì)失衡而造成滲透脅迫[1]。研究表明，當(dāng)植物受到滲透脅迫時(shí)首先表現(xiàn)出組織中相對(duì)含水量顯著下降，氣孔導(dǎo)度降低導(dǎo)致細(xì)胞水分缺失，影響植物蒸騰作用[2]，顯著提高葉綠素酶活性，葉綠素生物合成途徑受到破壞[3]，從而抑制植物光合作用[4]；滲透脅迫會(huì)導(dǎo)致植物活性氧失衡，并抑制生物膜活性[5]。植物始終處于在動(dòng)態(tài)的環(huán)境中不斷調(diào)整新陳代謝和發(fā)育的進(jìn)程之中，為了抵御環(huán)境壓力，植物進(jìn)化出了相互關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)途徑，使它們能夠及時(shí)地做出反應(yīng)和適應(yīng)環(huán)境[6]。滲透調(diào)節(jié)是指植物通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的含量來(lái)保持細(xì)胞滲透壓的過(guò)程，是植物響應(yīng)滲透脅迫的重要調(diào)節(jié)機(jī)制[7]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括由外界進(jìn)入細(xì)胞的無(wú)機(jī)離子（K+、Ca2+、Mg2+等）和植物細(xì)胞內(nèi)合成的有機(jī)溶質(zhì)（甜菜堿、脯氨酸和可溶性糖類(lèi)等）兩大類(lèi)[8]。甘氨酸甜菜堿（glycine"betaine，"GB）是一種廣泛存在于高等植物細(xì)胞中的季銨堿類(lèi)化合物[9]，在植物體內(nèi)合成路徑簡(jiǎn)單，不易發(fā)生代謝，容易被植物吸收，是目前研究最多最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一[10]。通過(guò)外源噴施GB[11-12]和基因工程[13-14]等手段，可以提高非生物脅迫條件下植物內(nèi)源GB的含量，植物內(nèi)源GB的積累更有利于植物穩(wěn)定生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能[15]、增強(qiáng)活性氧清除能力[16]、減緩滲透脅迫對(duì)光系統(tǒng)II（PSII）反應(yīng)中心酶活的降低[17]等?？傊参锟梢酝ㄟ^(guò)積累GB提高其非生物脅迫抗性[18-19]。

在高等植物中，GB生物合成是由酶促反應(yīng)來(lái)完成，首先以膽堿為底物，在膽堿單加氧酶（cho line"monooxygenase，"CMO）催化下氧化為甜菜堿醛，然后甜菜堿醛在甜菜堿醛脫氫酶（betaine"aldehyde"dehydrogenase，"BADH）催化下最終合成GB，GB合成后不會(huì)再被進(jìn)一步代謝[20]。BRO UQUISSE等[21]于1989年首次在菠菜（Spinacia"oleracea）葉綠體中分離出CMO。CMO是植物中GB合成的限速酶，僅在植物中存在的一種加氧酶[22]，CMO定位于葉綠體基質(zhì)中，其分子內(nèi)部具有Fe-S中心，屬于單編碼基因[23]。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物在脅迫條件下，CMO基因的上調(diào)表達(dá)可以顯著提高植物的抗逆性[24-26]，劉丹等[13]將遼寧堿蓬（Suaeda"liaotungensis）CMO基因轉(zhuǎn)化煙草（Nicotiana"tabacum），鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)源GB含量顯著提高，煙草耐鹽性增強(qiáng)；ZHANG等[14]將甜菜（Beta"vulgaris）CMO基因轉(zhuǎn)化煙草提高了煙草的耐鹽抗旱能力；將菠菜CMO基因轉(zhuǎn)化水稻（Oryza"sativa）后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出了對(duì)鹽脅迫和溫度脅迫更強(qiáng)的耐受性[27]。將細(xì)菌codA基因轉(zhuǎn)入番茄（Solanum"lycopersicum）中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄D1蛋白的穩(wěn)定性顯著提高，從而緩解PSII的光抑制[17]。

香蕉（Musa"spp.）屬芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬果樹(shù)，被世界糧農(nóng)組織定位為僅次于水稻、小麥（Triticum"aestivum）、玉米（Zea"mays）的第四大糧食作物[28]。全世界香蕉栽培品種大約300個(gè)，SIMMONDS等[29]認(rèn)為香蕉由尖葉蕉（Musa"acuminata；A基因組）和長(zhǎng)梗蕉（Musa"balbisiana；B基因組）2個(gè)原始野生蕉種內(nèi)或種間雜交后代進(jìn)化而成，還有少數(shù)的Musa"schizocarpa（S基因組）和Musa"textilis（T基因組）[30]。世界香蕉類(lèi)型有二倍體（AA、BB）、三倍體（AAA、AAB、ABB和BBB）和四倍體（AAAA、AAAB、AABB和ABBB）等品種。到目前為止，基因組公式的預(yù)測(cè)仍然是基于染色體數(shù)目和形態(tài)特征的評(píng)價(jià)。事實(shí)上，不僅不同基因型香蕉的形態(tài)差異明顯，而且還發(fā)現(xiàn)了基因結(jié)構(gòu)與功能水平差異。研究發(fā)現(xiàn)，在多種非生物脅迫條件下，不同基因型香蕉表現(xiàn)出抗性差異，低溫條件下，ABB與AAA基因型品種幼苗相比具有更強(qiáng)的耐寒性[31-32]，RAVI等[33]通過(guò)對(duì)干旱條件下不同基因型香蕉進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)，ABB基因型香蕉比其它基因型香蕉具有更強(qiáng)的抗旱性。WANG等[34]通過(guò)對(duì)多種不同基因型香蕉抗旱性分析認(rèn)為香蕉基因型組成中具B基因組越多的品種，其耐旱性越強(qiáng)的趨勢(shì)。HU等[35]通過(guò)表型和生理分析證明，ABB基因型的粉蕉比AAA基因型的巴西蕉更耐滲透脅迫、冷脅迫和鹽脅迫，并伴隨著多種基因在不同基因組類(lèi)型間差異表達(dá)。WU等[36]通過(guò)對(duì)香蕉A、B基因組中葉綠素降解途徑中SGR1基因表達(dá)模式的研究發(fā)現(xiàn)，A-SGR1與B-SGR1等位基因在高溫條件下的表達(dá)存在差異，并對(duì)香蕉果皮顏色的調(diào)控功能有差異。RAVI等[37]認(rèn)為Musa"balbisiana可能是在極端天氣條件下被馴化的，因此較Musa"acuminata具有更好的抗旱能力。隨著越來(lái)越多的證據(jù)表明不同基因組類(lèi)型的等位基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)模式以及香蕉品種間的非生物脅迫抗性存在部分差異，而基因結(jié)構(gòu)差異是否導(dǎo)致基因功能差異以及基因功能差異與香蕉滲透脅迫抗性是否存在關(guān)聯(lián)仍有待研究。

目前關(guān)于香蕉A、B基因組抗逆相關(guān)等位基因的鑒定研究較少，因此，本研究針對(duì)香蕉關(guān)鍵滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)GB合成過(guò)程中的限速酶CMO，通過(guò)克隆與測(cè)序鑒定來(lái)源香蕉A、B基因組的CMO基因，運(yùn)用生物信息學(xué)分析手段預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)與功能差異，通過(guò)RT-qPCR分析不同基因型香蕉CMO基因在滲透脅迫下的表達(dá)模式，以確定其在不同基因型香蕉抗?jié)B透脅迫過(guò)程中的作用，為后續(xù)進(jìn)一步揭示香蕉A、B基因組CMO等位基因與不同基因型香蕉抗逆性相關(guān)差異的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

以4種不同基因型香蕉[湛江AA（ZJ；AA基因型）、巴西蕉（BX；AAA基因型）、廣東大蕉（GD；AAB基因型）和金粉（JF；ABB基因型）]的生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致，五葉一心的組培苗為材料，組培苗均來(lái)源于吸芽增殖，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱作兩院種苗組培中心提供。在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所組培室處理材料，組培室培養(yǎng)條件為：光照12"h（8：00—20：00），光照強(qiáng)度2000"lx，26"℃，以200"mmol/L甘露醇溶液處理模擬滲透脅迫。于0、5、10、15"d取全葉和全根系，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取樣3株苗，取樣后迅速放入液氮速凍后轉(zhuǎn)移至–80"℃超低溫冰箱保存。

1.2""方法

1.2.1""香蕉CMO基因鑒定及序列分析""從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//banana-genome-hub.south green.fr/）中檢索AA型野生蕉（Musa"acuminata，DH-Pahang）的MaCMO基因（序列號(hào)：Macma4_"07_g22330）和BB型野生蕉（Musa"balbisiana，Pisang"Klutuk"Wulung）的MbCMO基因（序列號(hào)：Mba07_g19660）作為參考序列，并下載MaCMO基因與MbCMO基因的CDS序列、基因全長(zhǎng)序列和蛋白序列。利用CD-Search"Tool（https：//www."ncbi.nlm.nih.gov/）在線網(wǎng)站對(duì)MaCMO與MbCMO蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，并將基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果導(dǎo)入TBTOOLS軟件進(jìn)行分析。利用Softberry（http：//www.softberry.com）在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)MbCMO基因進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)，采用IGV-GSAman（v0.6.79）軟件可視化分析。

1.2.2""不同基因型香蕉CMO基因克隆及序列分析""根據(jù)2個(gè)參考序列設(shè)計(jì)引物（表1）克隆不同基因型香蕉CMO基因的CDS序列。PCR酶使用2×Phanta"Max"Master"Mix"P525（Vazyme），PCR反應(yīng)條件：95"℃預(yù)變性3"min；95"℃變性30"s，59"℃退火30"s，72"℃延伸"50"s，35個(gè)循環(huán)；72"℃延伸5"min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，與pCE2"TA/"Blunt-Zero載體（Vazyme）連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，送至北京擎科生物科技有限公司送測(cè)。將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入MAGE（v11.0.13）軟件進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入Jalview（v2.11.27）軟件進(jìn)行可視化分析，在MAGE軟件中構(gòu)建同源樹(shù)，選用p距離模型用于計(jì)算遺傳距離。利用生信云在線分析網(wǎng)站（sangon.com）分析不同基因型香蕉CMO基因的CDS序列密碼子使用特性，導(dǎo)入TBTOOLS軟件繪制熱圖。

1.2.3""CMO蛋白序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析"nbsp;使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件預(yù)測(cè)分析CMO蛋白編碼氨基酸個(gè)數(shù)、蛋白分子量及等電點(diǎn)等信息。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)由Prabi（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/）、Swiss-"model（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件完成。使用PSORT（https：//www.genscript."com/"psort.html）在線軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。蛋白親疏水性分析由ProtScale（https：//web.expasy.org/pro tscale/）在線軟件完成。使用TMHMM（http：//www."cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件作蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析。將蛋白序列導(dǎo)入MEGA軟件中進(jìn)行多重比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用Jalview軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2.4""RT-qPCR檢測(cè)""通過(guò)多糖多酚RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取香蕉葉片和全根系RNA，所有樣品均用1"μg的RNA通過(guò)Prime"Script"RT"reagent"Kit（TaKaRa公司，Perfect"Real"Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在–20"℃下保存?zhèn)溆谩Ｒ韵憬禔ctin基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行特異性表達(dá)分析。反應(yīng)體系20"μL，反應(yīng)程序：95"℃"7"min，95"℃"15"s，60"℃"30"s，95"℃"15"s，60"℃"30"s，95"℃"15"s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3""數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算；采用2–??CT方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量，運(yùn)用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)結(jié)果；采用ANOVA過(guò)程作方差分析；采用Duncan’s新復(fù)極差法作多重比較分析；使用Origin軟件繪制表達(dá)模式圖。

2""結(jié)果與分析

2.1""香蕉A、B參考基因組CMO基因結(jié)構(gòu)分析及轉(zhuǎn)錄本從頭預(yù)測(cè)

在香蕉A基因組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得MaCMO基因，基因序列號(hào)Macma4_07_g22330，基因組位于7號(hào)染色體（Achr07："33218743～33223216）；在香蕉B基因組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得MbCMO基因，基因序列號(hào)Mba07_g19660，基因組位置7號(hào)染色體（Bchr07："30683779～30699810）。MaCMO和MbCMO基因的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示（圖1A），MaCMO基因長(zhǎng)度為4474"bp，具有10個(gè)外顯子，9個(gè)內(nèi)含子；MbCMO基因長(zhǎng)度為16"032"bp，具有18個(gè)外顯子，17個(gè)內(nèi)含子。MaCMO和MbCMO蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明（圖1B），MaCMO蛋白具有典型的Rieske型[2Fe-2S]結(jié)構(gòu)域和加氧酶家族特征；MbCMO蛋白在具有Rieske型[2Fe-"2S]結(jié)構(gòu)域和加氧酶家族特征的同時(shí)還具有1個(gè)巖藻糖家族結(jié)構(gòu)域特征。通過(guò)Softberry在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)MbCMO基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)MbCMO基因同時(shí)包含1個(gè)香蕉O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白編碼基因與香蕉CMO基因（圖1C）。

2.2""不同基因型香蕉中CMO基因的克隆與鑒定

以香蕉A基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中MaCMO與Softberry在線分析網(wǎng)站分析得到的MbCMO基因?yàn)閰⒖夹蛄校O(shè)計(jì)2對(duì)分別克隆香蕉A、B基因組CMO基因特異性引物（表1），以BX、ZJ、JF、GD的cDNA為模板，克隆BX、ZJ、JF、GD中CMO基因編碼序列。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖2），使用MaCMO基因特異性引物在BX、ZJ、GD中各克隆出1種CMO基因系列（分別命名為BXCMO-A、ZJCMO-A、GDCMO-A），在JF中克隆出2種CMO基因序列（分別命名為JFCMO-A、JFCMO-H），5種CMO基因序列與MaCMO序列間相似性為99.31%，共有37個(gè)SNPs；使用MbCMO基因特異性引物在GD、JF中各克隆出2種CMO基因轉(zhuǎn)錄本序列（分別命名為GDCMO-B1、GDCMO-B2與JFCMO-B1、JFCMO-B2），4種CMO基因序列與MbCMO序列間相似性為98.55%，在GDCMO-B1與JFCMO-B1中鑒定到34個(gè)SNPs和3個(gè)Indels，分別為24"bp與20"bp的插入突變與4"bp的缺失突變；在GDCMO-B2與JFCMO-B2中鑒定到4個(gè)SNP和2個(gè)Indels，分別為24"bp與20"bp的插入突變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄于1350"bp提前終止。將在4種不同基因型的香蕉品種中鑒定到的9種CMO基因序列導(dǎo)入MAGE軟件中構(gòu)建同源樹(shù)發(fā)現(xiàn)（圖3），9種CMO基因序列與2個(gè)CMO參考基因大致分成兩簇。其中BXCMO-A、ZJC MO-A、GDCMO-A、JFCMO-A、GDCMO-B1與香蕉A基因組的MaCMO基因歸為一簇；JFCMO-H、JFCMO-B1、JFCMO-B2、GDCMO-B2與香蕉B基因組的MbCMO基因歸為一簇。因此將與MaCMO基因親緣關(guān)系最近的ZJCMO-A定義為CMO-A；將與MbCMO基因親源關(guān)系較近的JFCMO-B1與GDCMO-B2分別定義為CMO-B1與CMO-B2；由于FJCMO-H可能由A和B基因組重組而形成的，將其定義為CMO-H。

2.3""香蕉CMO基因密碼子偏好性分析

相對(duì)同義密碼子使用頻率（relative"synonymous"codon"usage，"RSCU）值的大小可以反映密碼子的使用頻率。一般RSCU值大于1的密碼子被

認(rèn)為是高頻密碼子，RSCU值小于1的則為低頻密碼子。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)（圖4），在4種香蕉CMO基因中，有23個(gè)共同的高頻密碼子，密碼子CUU是4種香蕉CMO基因中偏性最強(qiáng)的密碼子，RSCU值均超過(guò)2，密碼子CCG則是偏性最弱的密碼子，在CMO-B1中的RSCU值為0.18，其余3種中。CMO-A中均為0。其中，密碼子GGU、CUA、UCG在CMO-A中屬于高頻密碼子，RSCU值分別為1.12、1.02、1.05；密碼子GGU、CUA、UCG、UCC、AAA在CMO-H中屬于高頻密碼子，RSCU值分別為1.12、1.02、1.20、1.02、1.00；密碼子GGU、UCG、CGC、AAA、CGA、AGC在CMO-B1中屬于高頻密碼子，RSCU值分別為1.20、1.05、1.03、1.00、1.03、1.05；密碼子CUA、UCC、AAA、GGG、CUC、AGC在CMO-B2中屬于高頻密碼子，RSCU值分別為1.02、1.09、1.00、1.07、1.02、1.22。

2.4""香蕉CMO蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam工具對(duì)蛋白序列進(jìn)行的蛋白質(zhì)相關(guān)理化性質(zhì)分析表明（表2），CMO-A蛋白與CMO-H蛋白均由425個(gè)氨基酸編碼形成，CMO-B1編碼氨基酸數(shù)量最多，為470個(gè)，

CMO-B2由450個(gè)氨基酸編碼形成；CMO-B2蛋白分子量最大，為52.02"kDa，并且等電點(diǎn)最低，為5.44，CMO-A蛋白分子量最小，為47.48"kDa，CMO-B1蛋白等電點(diǎn)最高為6.88，說(shuō)明4種CMO蛋白均屬于酸性蛋白。Prabi分析發(fā)現(xiàn)CMO-B1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，CMO-A蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。TMH MMY預(yù)測(cè)分析4種CMO蛋白都不具有跨膜結(jié)構(gòu)且親疏水性指數(shù)均小于0，為親水性蛋白質(zhì)；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示將4種CMO蛋白均定位在葉綠體中。

2.5""香蕉CMO蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析及多重序列比對(duì)

為進(jìn)一步研究4種香蕉CMO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并選取擬南芥（Arabidopsis"thaliana）、番茄、玉米、水稻、菠菜、莧菜（Amaranthus"tricolor）、大豆（Glycine"max）、大麥（Hordeum"vulgare）、豇豆（Vigna"unguiculata）、甜瓜（Cucumis"melo）、橙子（Citrus"sinensis）、番石榴（Psidium"guajava）、油棕（Elaeis"guineensis）、海棗（Phoenix"dactylifera）、葡萄（Vitis"riparia）、黃瓜（Cucumis"sativus）等16個(gè)物種CMO蛋白與CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-B2蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。由圖5可知，CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-B2與EgCMO、PdCMO、ZmCMO、HvCMO、OsCMO"5種單子葉植物共同處于1個(gè)分支，表明它們親緣關(guān)系最近。CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-B2與SoCMO和AtCMO（擬南芥膽堿單加氧酶蛋白）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。結(jié)果表明，植物CMO在進(jìn)化時(shí)單、雙子葉植物有明顯的分支，說(shuō)明物種內(nèi)的分化時(shí)間比物種間的分化時(shí)間更晚。蛋白多重序列比對(duì)結(jié)果顯示（圖6）。香蕉CMO蛋白序列中都具有典型的Rieske型[2Fe-2S]結(jié)構(gòu)域和鐵結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步說(shuō)明香蕉CMO蛋白具有鐵離子結(jié)合和氧化還原酶活性，并且植物CMO蛋白在進(jìn)化時(shí)C端較N端更為保守。

2.6""滲透脅迫條件下4種基因型香蕉CMO表達(dá)模式分析

為探究4種基因型香蕉CMO在滲透脅迫條件下表達(dá)特性，通過(guò)RT-qPCR對(duì)200"mmol/L甘露醇處理后的4種不同基因型香蕉根與葉中CMO表達(dá)模式進(jìn)行分析。以0"d"JF處理組CMO表達(dá)量作為對(duì)照（設(shè)相對(duì)表達(dá)量為1），計(jì)算出其他處理組的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖7所示，滲透脅迫條件下，在滲透脅迫大部分階段A基因組純合型（ZJ與BX）香蕉根葉中的CMO表達(dá)量顯著高于A、B基因組雜合型（GD與JF）香蕉根葉中的CMO表達(dá)量。在根中，A基因組純合型（ZJ與BX）CMO表達(dá)量在0、5、10"d顯著高于A、B基因組的雜合型（GD與JF）CMO基因表達(dá)量（Plt;0.05），只有在15"d時(shí)ZJCMO表達(dá)量與GDCMO表達(dá)量無(wú)顯著差異。ZJ、BX、GD的CMO基因在5"d時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)高峰，分別為CK的7.39、5.69、3.58倍，JF的CMO基因表達(dá)量在10"d出現(xiàn)高峰，僅為CK的1.55倍。在葉中，A、B基

因組的雜合型（GD與JF）CMO在10"d時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)高峰，其中GD的CMO表達(dá)量顯著高于ZJ與BX，A基因組的純合型（ZJ與BX）的CMO表達(dá)量在15"d時(shí)表達(dá)量再次上升且顯著高于GD與JF（Plt;0.05）。

3""討論

目前，CMO基因已經(jīng)在多種高等植物中被鑒定，并發(fā)現(xiàn)其在植物GB合成以及響應(yīng)植物脅迫反應(yīng)時(shí)起到重要作用[38-39]。CMO基因?yàn)閱慰截惢?/p>

因[23]，結(jié)合香蕉A、B基因數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，分別發(fā)現(xiàn)1個(gè)MaCMO與MbCMO基因，MaCMO和MbCMO基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示：MaCMO基因長(zhǎng)度為4432"bp，具有10個(gè)外顯子；MbCMO基因長(zhǎng)度為16"032"bp，具有18個(gè)外顯子；MbCMO基因長(zhǎng)度是MaCMO基因長(zhǎng)度的近4倍，多了8個(gè)外顯子。MaCMO和MbCMO蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示：MaCMO蛋白和MbCMO蛋白具有典型的Rieske型[2Fe-2S]結(jié)構(gòu)域和加氧酶家族特征，而MbCMO蛋白還具有1個(gè)巖藻糖家族結(jié)構(gòu)域特征，這與前人報(bào)道的大麥[40]與水稻[41]等植物CMO蛋白具有的結(jié)構(gòu)域并不完全一致。MbCMO基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MbCMO基因可能由1個(gè)香蕉O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白編碼基因與MbCMO基因串聯(lián)形成，推測(cè)可能是由于基因組測(cè)序結(jié)果在拼接的過(guò)程中由于2個(gè)基因在基因組中位置較為接近而拼接成1個(gè)基因，這種1個(gè)基因由多個(gè)基因串聯(lián)形成的現(xiàn)象普遍存在于已有的植物基因組測(cè)序結(jié)果中[42-43]。

大量研究表明，相同基因在同一物種不同基因型的品種間可能存在多種轉(zhuǎn)錄本。WU等[36]在AAB＼ABB基因型香蕉中同時(shí)鑒定到分別來(lái)源于A、B基因組的SGR1等位基因；YU等[44]在4個(gè)不同的小麥品種中鑒定來(lái)源不同的TaBADH-A與TaBADH-B基因。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，ZJ、BX、GD和JF的基因型分別被預(yù)測(cè)為AA、AAA、AAB和ABB[30，"45]。本研究選擇香蕉關(guān)鍵滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)GB合成過(guò)程中限速酶合成基因CMO作為重點(diǎn)研究基因，探討不同基因型香蕉CMO基因之間的差異，通過(guò)克隆后的測(cè)序和序列的多重比對(duì)，在4種基因型香蕉中發(fā)現(xiàn)了9條CMO基因序列，其中MaCMO基因特異性引物在BX、ZJ、GD中各克隆出1種CMO基因，在JF中克隆出2種CMO基因；MbCMO基因特異性引物在GD、JF中各克隆出2種CMO基因并且在GDCMO-B2與JFCMO-B2中出現(xiàn)Indels使得轉(zhuǎn)錄提前終止，蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變異。通過(guò)構(gòu)建同源樹(shù)分析不同來(lái)源的CMO基因的親緣關(guān)系，結(jié)果表明9條CMO基因與2個(gè)CMO參考基因大致分成兩簇，包括與香蕉A基因組MaCMO基因親緣關(guān)系較近的歸為一簇以及與香蕉B基因組MbCMO基因親緣關(guān)系較近的為另一簇。其中，JFCMO-H具有MaCMO基因和MbCMO基因共同特征，推測(cè)其可能由A和B基因組在進(jìn)化過(guò)程中重組而形成的，這種現(xiàn)象符合JERIDI等[46]的觀點(diǎn)。

本研究在CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-"B2中分別有26、28、29、29個(gè)最優(yōu)密碼子，其中分別包括18、19、19、18個(gè)以A或U結(jié)尾的密碼子，表明4種香蕉CMO基因?qū)σ訟或U結(jié)尾的密碼子偏好性最強(qiáng)，這與前人對(duì)香蕉基因組密碼子使用偏好性分析的結(jié)果并不一致[47]。蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示CMO-A、CMO-H、CMO-B1與CMO-B2均屬于酸性蛋白，均不具有跨膜結(jié)構(gòu)且都為親水性蛋白。與前人對(duì)西瓜（Citrullus"lanatus）CMO[48]與沙棘（Hipp ophae"rhamnoides）CMO[49]蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果一致。HANSON等[9]認(rèn)為GB的合成是在植物葉綠體基質(zhì)中完成的，且有研究表明具有Rieske型[2Fe-2S]結(jié)構(gòu)域的CMO蛋白定位在葉綠體基質(zhì)中[50]，與本研究亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的一致。

本研究中，CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-"B2與EgCMO、PdCMO、ZmCMO、HvCMO、OsCMO"5種單子葉植物共同處于1個(gè)分支，表明它們親緣關(guān)系最近，剩余的所有雙子葉植物處于1個(gè)大支，表明CMO在系統(tǒng)進(jìn)化時(shí)，單、雙子葉植物之間有明顯的分支。這與已經(jīng)報(bào)道過(guò)的CMO在同一物種中親緣關(guān)系較近的結(jié)果一致[40-41]，并且前人通過(guò)比較香蕉基因組和單、雙子葉植物基因組進(jìn)化過(guò)程發(fā)現(xiàn)，香蕉基因組與單子葉植物基因組更具有同源性[51]。CMO是一種僅存在于植物中的加氧酶，并且許多植物并不具有CMO，如擬南芥[52]、煙草[53]和水稻[41]等。有研究者認(rèn)為部分植物缺乏功能性CMO或無(wú)CMO導(dǎo)致其不能自然積累GB[53]。因此，CMO物種內(nèi)的分化時(shí)間較晚于不同物種之間的分化時(shí)間可能與一些植物不具備積累甜菜堿的能力有關(guān)。

越來(lái)越多的研究表明，不同基因型物種間可能存在不同響應(yīng)非生物脅迫的模式[54]，在4個(gè)不同的小麥品種在干旱和鹽脅迫條件下，BADH-"A1b型的表達(dá)水平以及甜菜堿積累量顯著高于BADH-"A1a型[44]，CsCMO在抗寒性強(qiáng)的茶樹(shù)品種中的表達(dá)量顯著高于抗寒性弱的茶樹(shù)品種[38]，本研究4種基因型香蕉CMO基因表達(dá)量在滲透脅迫條件下都表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)趨勢(shì)，表明香蕉CMO可以響應(yīng)滲透脅迫，這與前人關(guān)于CMO可以響應(yīng)多種非生物脅迫的結(jié)論一致[24-26]。通過(guò)比較4種基因型香蕉滲透脅迫條件下CMO表達(dá)量可以發(fā)現(xiàn)，A基因型純合品種（ZJ、BX）的CMO表達(dá)量顯著高于A基因型與B基因型雜合品種（GD、JF）CMO表達(dá)量，推測(cè)可能是來(lái)源于香蕉A基因組的CMO基因較來(lái)源于B基因組的CMO基因具有更強(qiáng)的滲透脅迫響應(yīng)能力從而導(dǎo)致其在不同基因型香蕉間差異表達(dá)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，不同基因型香蕉間可能存在不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及響應(yīng)模式，HU等[35]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析滲透脅迫、冷脅迫和鹽脅迫下ABB基因型的粉蕉與AAA基因型的巴西蕉基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)粉蕉與巴西蕉間存在基因差異表達(dá)現(xiàn)象，并認(rèn)為粉蕉較巴西蕉具有更獨(dú)立的ABA信號(hào)網(wǎng)絡(luò)；YANG等[55]研究發(fā)現(xiàn)ABB基因型的Dajiao中細(xì)胞MPK2磷酸化信號(hào)通路較AAA基因型的Cavendish更為保守，導(dǎo)致Dajiao耐寒性強(qiáng)于Cavendish。不同基因型

香蕉也可能存在不同的轉(zhuǎn)錄激活模式，來(lái)源不同基因組的CMO基因的轉(zhuǎn)錄對(duì)可能受到不同轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)，從而引起等位基因特異性表達(dá)，最終導(dǎo)致不同基因型香蕉CMO表達(dá)量出現(xiàn)差異。前人通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析干旱脅迫條件下，耐旱香蕉品種Saba（ABB基因型）與敏感品種Grand"Naine（AAA基因型）基因表達(dá)情況，結(jié)果表明有46種轉(zhuǎn)錄因子家族部分基因出現(xiàn)差異表達(dá)，占到差異表達(dá)基因總數(shù)的15.9%[56]。等位基因特異性表達(dá)是指在含有多于一組同源基因組的物種中存在的一種等位基因之間轉(zhuǎn)錄失衡的表達(dá)模式[57]，在植物中，這種基因表達(dá)模式可以由不同轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控而引起[58-59]。因此，不同基因型香蕉CMO表達(dá)量的差異可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平差異導(dǎo)致的等位基因特異性表達(dá)密切相關(guān)。而本研究中ZJ、BX、GD和JF中來(lái)源不同的CMO基因是否存在等位基因特異性表達(dá)現(xiàn)象仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證，并且不同的CMO基因表達(dá)差異是否導(dǎo)致不同基因型香蕉非滲透脅迫抗性出現(xiàn)差異及其影響香蕉滲透脅迫抗性的機(jī)制也有待解析。

本研究在4種不同基因型香蕉中鑒定分別來(lái)源于香蕉A、B基因組CMO基因，并對(duì)其序列特征和蛋白結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了解析，探究了不同基因型香蕉CMO基因在滲透脅迫下的表達(dá)模式，以確定其在不同基因型香蕉抗?jié)B透脅迫過(guò)程中的作用，為后續(xù)進(jìn)一步揭示香蕉A、B基因組CMO等位基因與不同基因型香蕉抗逆性相關(guān)差異的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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