摘""要：植物磷脂酶A（phospholipase"A，PLA）是細胞膜磷脂代謝中的關(guān)鍵酶，可以催化磷脂分子上多個功能基團發(fā)生裂解生成信號分子，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及環(huán)境和生物脅迫，具有重要研究價值。本研究主要考察底物濃度、反應(yīng)溫度、緩沖溶液pH、緩沖溶液體積、反應(yīng)時間等多種因素對香蕉PLA催化卵磷脂水解活性的影響，從而優(yōu)化磷脂酶A活性測定方法，進一步根據(jù)最佳測定條件研究炭疽病脅迫下香蕉PLA活性的變化趨勢。結(jié)果表明，酸堿滴定法測定香蕉PLA活性的優(yōu)化條件：反應(yīng)體系pH"9，底物濃度為4"g/L，反應(yīng)溫度為55"℃，底物為15"mL，酶粗提液為3"mL，提取緩沖液體積與果皮重量的比值（mL/g）為3，反應(yīng)時間為7"h。在最優(yōu)條件下對炭疽病脅迫下的香蕉果皮組織進行PLA活性測定，發(fā)現(xiàn)果皮的病害程度與PLA活力呈正相關(guān)，即隨著病害程度加深，PLA活性增大，且遠大于對照組。表明PLA活性大小可能與果實的抗性有關(guān)，隨著果實病害程度加深，PLA活性增大，膜磷脂降解，細胞膜的完整性被破壞，從而導(dǎo)致果實腐爛。本研究明確了一種方便可行的香蕉PLA活性測定方法，為深入研究香蕉PLA的催化作用機制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：香蕉；磷脂酶A；酸堿滴定法；酶活性；炭疽病中圖分類號：S432.1；Q556""""""文獻標志碼：A

Optimization"on"Activity"Assay"of"Banana"Phospholipase"A"by"Acid-base"Titration"and"Change"of"PLA"Activity"under"Anthracnose"Stress

CHEN"Yuxian1，"LI"Li2，3，"LI"Jing1，"SUN"Jian3，4*，"YI"Ping2*，"HUANG"Fang2，"HUANG"Min2，"GAN"Ting2

1."College"of"Chemistry"and"Bioengineering，"Guilin"University"of"Technology，"Guilin，"Guangxi"541006，"China;"2."Agro-Food"Science"and"Technology"Research"Institute，"Guangxi"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Nanning，nbsp;Guangxi"530007，"China;"3."Guangxi"Key"Laboratory"of"Fruits"and"Vegetables"Storage-Processing"Technology，"Nanning，"Guangxi"530007，"China;"4."Guangxi"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Nanning，"Guangxi"530007，"China

Abstract："Plant"phospholipase"A"（PLA）"is"a"key"enzyme"in"cell"membrane"phospholipid"metabolism."It"can"catalyze"the"cleavage"of"multiple"functional"groups"on"phospholipids"to"generate"signaling"molecules，"which"are"involved"in"regulating"plant"growth"and"development"as"well"as"environmental"and"biological"stresses."PLA"possesses"important"research"value."In"this"study，"the"effects"of"various"factors"such"as"substrate"concentration，"reaction"temperature，"pH"of"buffer"solution，"buffer"solution"volume，"and"reaction"time"on"catalytic"activities"of"banana"PLA"for"phospholipid"hydrolysis"were"investigated，"so"as"to"optimize"PLA"activity"assay"method."According"to"the"optimal"assay"conditions，"the"change"of"banana"PLA"activity"under"anthracnose"stress"was"further"studied."The"results"showed"that"the"optimal"conditions"for"the"determination"of"banana"PLA"activity"by"acid-base"titration"method"were"as"follows："pH"9，"reaction"temperature"55"℃，"substrate"concentration"4"g/L，"15"mL"substrate，"3"mL"crude"enzyme"extract，"the"ratio"of"extraction"buffer"volume"to"peel"weight"（mL/g）"3，"and"reaction"time"7"h."According"to"the"optimal"conditions，"the"PLA"activity"of"banana"peel"tissue"under"anthracnose"stress"was"determined."It"was"found"that"the"degree"of"disease"in"peel"tissue"was"positively"correlated"with"PLA"activity，"indicating"that"PLA"activity"increased"with"the"deepening"of"disease."This"suggested"that"the"level"of"PLA"activity"was"probably"related"to"fruit"resistance."As"disease"degree"deepened，"PLA"activity"increased，"membrane"phospholipids"degraded，"and"cell"membrane"integrity"disrupted，"leading"to"fruit"decay."In"this"article，"a"convenient"and"feasible"method"for"the"determination"of"banana"PLA"activity"was"established，"which"laid"a"foundation"for"further"study"of"the"catalytic"mechanism"of"banana"phospholipase"A.

Keywords："banana;"phospholipase"A;"acid-base"titration;"enzyme"activity;"anthracnose

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.014

香蕉為芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）單子葉植物，果實營養(yǎng)豐富，含有礦物質(zhì)元素、抗性淀粉、膳食纖維、酚類化合物、類胡蘿卜素、植物甾醇、胺類、抗氧化劑等營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分[1-2]，加工潛力巨大[3]。隨著香蕉需求的日益增長，截至2019年，全球香蕉收獲面積達到515.86萬hm2，產(chǎn)量達到1.17億t，同時我國香蕉產(chǎn)量位居世界第2，凈進口量位居世界第3[4-5]。

香蕉炭疽病作為香蕉果實貯藏和運輸過程中的主要病害之一，發(fā)病時主要表現(xiàn)為果實表面出現(xiàn)黑褐色圓斑，隨著病斑擴大，果實硬度下降，果皮細胞膜破損，膜透性增大[6-7]，膜脂過氧化加劇，營養(yǎng)成分流失，2～3"d內(nèi)果肉變黑腐爛[8-9]。目前，香蕉病害的主要防治方法仍為化學(xué)防治，但由于病菌抗性增強以及藥物殘留等問題，化學(xué)防治效果下降。因此，利用生物、化學(xué)等方式誘導(dǎo)香蕉的自身免疫系統(tǒng)獲得抗病性已成為研究熱點之一[10]。

磷脂是構(gòu)成細胞膜的基本分子，也是細胞與外界聯(lián)系和反應(yīng)的第一道屏障。細胞膜作為靈敏的環(huán)境感應(yīng)器官，當發(fā)生生物脅迫或非生物脅迫時，細胞膜中的分子受體可通過磷脂酶（phospholipase，"PL）產(chǎn)生細胞信號傳導(dǎo)，從而使細胞對外界變化給予不同的反應(yīng)[11]。磷脂酶可將磷脂水解為脂肪酸、溶血卵磷脂、二酰甘油、磷酰膽堿等親脂性物質(zhì)。根據(jù)水解磷脂的部位不同又將其分為磷脂酶A（PLA）、磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）[12]，其中PLA是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，是一類能夠在磷脂甘油部分的Sn-2位點選擇性斷裂酯鍵的酶，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡、促進細胞分化及生長等能力。研究表明，當植物面對環(huán)境脅迫時，PLA活性發(fā)生改變，通過水解細胞膜上的磷脂，使其產(chǎn)物作用于質(zhì)膜H+轉(zhuǎn)運，同時改變細胞膜的離子通透性，使胞內(nèi)Ca2+濃度增加，從而適應(yīng)不斷變化的環(huán)境和發(fā)育條件[13]。在炭疽病脅迫下，PLA活性的改變能夠在一定程度上影響果實的后熟進程。

酶活性測定是酶研究、應(yīng)用和生產(chǎn)的基礎(chǔ)，與動物PLA的研究相比，雖然已有大量研究表明植物PLA參與調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答等相關(guān)過程，但是目前有關(guān)植物PLA的酶活測定、作用機制等方面的研究仍非常匱乏。前期文獻報道了PLA催化卵磷脂水解的幾種測定方法，其中酸堿滴定法是研究PLA活性的一種易于操作的方法，該方法原理：由于磷脂在磷脂酶的作用下水解產(chǎn)生大量的游離脂肪酸，使用NaOH進行中和滴定，可通過所消耗的NaOH體積間接推算出即時反應(yīng)速率等參數(shù)[14]。在實際應(yīng)用酸堿滴定法對香蕉PLA活性進行測定的過程中發(fā)現(xiàn)，溫度、pH、底物濃度等多種因素對不同的研究對象影響較大。香蕉PLA活性酸堿滴定測定方法還需進一步優(yōu)化，明確該方法的具體條件，從而更加準確地測定香蕉PLA的活性。因此，本研究通過探討影響酸堿滴定法測定香蕉PLA活性的因素，獲得香蕉PLA的最優(yōu)測定條件，并利用優(yōu)化的測定方法分析炭疽病脅迫下不同貯藏時間香蕉PLA活性變化與果實后熟及腐敗進程的關(guān)系，這在科學(xué)研究和實際生產(chǎn)中具有重要的理論和實踐意義。

1""材料與方法

1.1""材料

供試香蕉品種選用廣西主栽的桂蕉1號，于2022年10月18日摘自廣西美呈農(nóng)業(yè)科技有限公司，采收時果實成熟度為7～8成熟，當天運回廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點實驗室，挑選成熟度一致、大小均一、無明顯機械傷、無病害的果實進行試驗。

主要試劑：大豆卵磷脂，上海麥克林生化科技有限公司，GR級；脫氧膽酸鈉、氯化鈣，上海源葉生物科技有限公司，分析純；氯化鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純；三羥甲基氨基甲烷，北京索萊寶科技有限公司，分析純；鹽酸，成都科隆化學(xué)試劑有限公司，分析純。

主要儀器：水浴恒溫鍋，HH-S4型，金壇市萬華實驗儀器廠；酸度計，PHS-3C型，上海儀分科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機，3-18KS型，Sigma公司。

1.2""方法

1.2.1""炭疽菌孢子懸浮液的制備""香蕉炭疽菌（Colletotrichum"musae）由廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點實驗室提供（菌株編號17B）[15]。將炭疽菌接種于PDA固體培養(yǎng)基28"℃培養(yǎng)7～14"d，用接種環(huán)輕輕摩擦培養(yǎng)基表面使得孢子更容易脫落，使用移液槍將制得的菌種懸浮液轉(zhuǎn)移至50"mL錐形瓶，用無菌去離子水稀釋并調(diào)節(jié)濃度至1×"104"CFU/mL，備用。

1.2.2""樣品處理""參考李春玲等[16]報道的處理方法對采后香蕉果實進行模擬炭疽菌感染處理試驗。選用2～20"μL的移液槍在香蕉果實的腰部均勻地扎3個直徑為4"mm、深度為2.5"mm的傷口，于香蕉果實的傷口處注入20"μL炭疽菌孢子懸浮液（1×104"CFU/mL）作為實驗組，于香蕉果實的傷口處注入20"μL無菌水作為對照組。每個處理組50個果實，注射完畢后將所有供試香蕉置于開口托盤上貯藏15"d以上，貯藏溫度25"℃，相對濕度60%，根據(jù)香蕉貯藏時間間隔進行取樣及液氮保存。

1.2.3""PLA活性測定""酶的粗提液制備：準確稱取一定量的香蕉果皮組織于研缽中，加入與其體積相應(yīng)倍數(shù)的5"mmol/L、pH"7.6的Tris-HCL緩沖液，冰浴研磨5"min，使用三層尼龍紗布過濾，濾液于4"℃、4000"r/min條件下離心15"min，取其上清液備用。

反應(yīng)底物溶液制備方法：參考雷享亮、張晉陸等[14，"17]報道的處理方法并加以改進。制備含有2～5"g/L卵磷脂、2"mmol/L脫氧膽酸鈉、5"mmol/L"Tris-HCl（pH"7.6）、0.2"mmol/L"CaCl2、0.2"mol/L"NaCl的底物緩沖液，使用0.4"mol/L"NaOH調(diào)節(jié)緩沖液至相應(yīng)的pH。

反應(yīng)體系：將酶的粗提液和反應(yīng)底物溶液置于相應(yīng)溫度下保溫5"min，取3"mL粗提液和15"mL底物溶液迅速混勻，將混合液置于相應(yīng)溫度下反應(yīng)4～10"h。

自由脂肪酸（FFA）生成量測定：取2"mL不同時間段的反應(yīng)體系中的待測液，用蒸餾水稀釋25倍，從稀釋液中量取5"mL于50"mL錐形瓶中，在冰浴中用2"mmol/L"NaOH滴定至初始pH，記錄所消耗的NaOH體積數(shù)V（mL），推算出每克香蕉PLA水解卵磷脂釋放出的FFA生成量（μmol/g）。以單位時間內(nèi)每克香蕉果皮中PLA水解磷脂產(chǎn)生的游離脂肪酸量，即μmol/（g·h）表示PLA活性。具體計算公式如下：

1.2.4""炭疽病脅迫對香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響""稱取一定量的實驗組或?qū)φ战M香蕉果皮組織于研缽中，其中實驗組為炭疽病脅迫下的香蕉果皮組織，對照組為無菌水處理下的香蕉果皮組織。根據(jù)果皮質(zhì)量加入3倍的5"mmol/L（pH"7.6）Tris-HCL緩沖液，冰浴上研磨5"min，使用三層尼龍紗布過濾，濾液于4"℃、4000"r/min條件下離心15"min，取其上清液備用。選用篩選出的最佳底物濃度、溫度、反應(yīng)體系pH以及反應(yīng)時間等反應(yīng)條件進行后續(xù)香蕉PLA水解卵磷脂的活性測定試驗。

1.3""數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)3次，結(jié)果為均值±標準誤差，采用SPSS"22軟件（IBM，芝加哥，美國）對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Duncan檢驗分析法進行因素水平間的顯著性方差分析（Plt;0.05），用Origin"2021軟件（OriginLab，北安普敦，馬薩諸塞州，美國）制圖。

2""結(jié)果與分析

2.1""影響PLA水解卵磷脂活性的因素分析

2.1.1""底物濃度對PLA水解卵磷脂活性的影響""參考雷享亮、張晉陸等[14，"17]的方法設(shè)定初始參數(shù)：反應(yīng)體系pH"7.6，溫度40"℃，緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為5。由于卵磷脂在水中的溶解度有限，因此測定卵磷脂濃度為2、3、4、5"g/L時的底物溶液濃度對香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時間的變化動態(tài)。由圖1可知，在其他條件恒定的條件下，底物濃度對于酶促反應(yīng)的速度有很大影響，隨著底物濃度增加，酶促反應(yīng)速度加快，到達一定程度后，反應(yīng)速度趨于穩(wěn)定。香蕉磷脂酶水解卵磷脂產(chǎn)生的FFA含量隨著反應(yīng)時間的增加逐漸增大，其中底物卵磷脂濃度為4"g/L及5"g/L時，F(xiàn)FA生成量顯著大于2"g/L和3"g/L（Plt;0.05），且4"g/L及5"g/L間FFA生成量相差不大，因此后續(xù)試驗選擇的最佳濃度為4"g/L。

2.1.2""溫度對PLA水解卵磷脂活性的影響""設(shè)定底物卵磷脂濃度為4"g/L，反應(yīng)體系pH"7.6，緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為5，測定反應(yīng)溫度為40、45、50、55、60"℃時對香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時間的變化動態(tài)。由圖2可知，當反應(yīng)溫度為60"℃時，F(xiàn)FA生成量明顯降低。在溫度低于60"℃時，隨著反應(yīng)溫度的增高，F(xiàn)FA生成量增加，各溫度下FFA生成量差異顯著（Plt;0.05）。其中55"℃下FFA的生成量平穩(wěn)增長，且最多。溫度對于酶促反應(yīng)的影響有雙重作用，一方面，在一定范圍內(nèi)隨著溫度升高，可以加快酶促反應(yīng)，磷脂酶A活性增大；另一方面，當溫度過高時，導(dǎo)致酶變性，酶活性下降，因此香蕉PLA活力的適宜溫度為55"℃。

2.1.3""反應(yīng)體系pH對PLA水解卵磷脂活性的影響""設(shè)定底物卵磷脂濃度為4"g/L，溫度為55"℃，緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為5，測定反應(yīng)體系pH為6、7、8、9時對香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時間的變化動態(tài)。由圖3可知，反應(yīng)體系的pH對酶催化活力的影響極為顯著，這可能是因為pH改變了酶活性部位有關(guān)基團的解離狀態(tài)[18]，使其適于或不適于與底物結(jié)合，從而影響酶促反應(yīng)結(jié)果。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)體系pH增大，F(xiàn)FA生成量增多，不同pH條件下FFA的生成量差異顯著（Plt;"0.05）。反應(yīng)體系pH為6和7時，F(xiàn)FA生成量少，且隨著時間的變化不大。反應(yīng)體系pH為8時，F(xiàn)FA生成量較前二者多，且隨著時間的變化緩慢增加。反應(yīng)體系pH為9時，F(xiàn)FA生成量最大。

2.1.4""緩沖液體積對PLA水解卵磷脂活性的影響""設(shè)定底物卵磷脂濃度為4"g/L，溫度為55"℃，反應(yīng)體系pH"9，測定緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為2、3、4、5時對香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時間的變化動態(tài)（圖4）。研究表明，不同緩沖液體積下香蕉磷脂酶水解卵磷脂存在明顯差異。在反應(yīng)進行初期，2倍的反應(yīng)體系中FFA的生成量較大，但隨著反應(yīng)進行到3倍時，反應(yīng)體系中FFA的生成量逐漸增大。在反應(yīng)后期，緩沖液為3倍時反應(yīng)體系中FFA生成量最大，且與其他倍數(shù)相比差異顯著（Plt;0.05），因此在香蕉PLA水解卵磷脂活性測定試驗中緩沖液體積（mL）與樣品質(zhì)量（g）的最佳比值為3。

Fig."4""Effect"of"extraction"buffer"volume"on"lecithin"hydrolysis"of"banana"phospholipase"A

2.1.5""反應(yīng)時間的確定""設(shè)定底物卵磷脂濃度為4"g/L，溫度為55"℃，反應(yīng)體系pH"9，測定緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為3時對香蕉PLA水解卵磷脂活性的影響，記錄FFA生成量隨著時間的變化動態(tài)。由圖5可知，反應(yīng)前7"h，隨著反應(yīng)進行，反應(yīng)體系中FFA的含量逐漸增大，8"h時反應(yīng)速率減緩，此時FFA含量為（155.667±0.167）μmol/g。與其他時間段對比可知，7"h時反應(yīng)速度最快，可見反應(yīng)時間以7"h為宜。

2.2""炭疽病脅迫對香蕉PLA活性的影響

由圖6可知，隨著貯藏時間增加，香蕉果實果皮褐變程度加深，果實逐漸腐敗。在炭疽病脅迫下，實驗組的香蕉果實病斑直徑逐漸增大，果實腐敗速度加快，而對照組的果實病斑直徑變化不大，果實腐敗速率較緩。在香蕉PLA最適活性測定條件下，即底物卵磷脂濃度為4"g/L，溫度為55"℃，反應(yīng)體系pH"9，測定緩沖液體積/樣品質(zhì)量（mL/g）為3，反應(yīng)時間為7"h，測定炭疽病脅迫對香蕉PLA活性的影響。結(jié)果如圖7所示，隨著貯藏時間增加，實驗組及對照組的PLA活性均明顯上升，且接種炭疽菌的香蕉果實PLA活性遠遠大于未接種的PLA活性。由此可知，PLA活性變化與香蕉后熟過程有關(guān)，隨著貯藏時間增加，PLA活性增大。同時，炭疽病脅迫會對香蕉果實中PLA活性有所影響，PLA活性顯著增加。

3""討論

PLA是一類廣泛存在于動植物細胞中的重要的水解酶，能夠參與調(diào)控細胞膜代謝和信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程。目前，已有一些研究通過不同方法測定生物中PLA活性。FENG等[19]發(fā)現(xiàn)熒光基團標記的磷脂酶類物質(zhì)可以被PLA2催化并產(chǎn)生熒光信號，因此利用實時熒光測定方法，可以實時檢測PLA2的活性變化，并可以在細胞水平上測定其活性。李宏麗等[20]使用模型膽汁和合成的熒光標記底物測定豬胰臟PLA2的活性，為臨床治療膽結(jié)石提供了重要信息。MIRSKY等[21]基于磷脂酰乙醇胺與磷脂酰膽堿之間的酯鍵水解反應(yīng)，通過測定膜邊界電勢的變化來間接測定PLA的活性。JIMENEZ等[22]通過直接監(jiān)測酶催化反應(yīng)中產(chǎn)生的吸收或發(fā)射光信號，采用連續(xù)分光光度法實現(xiàn)了對PLA2活性的實時監(jiān)控，能夠有效地研究PLA2在豬胰臟內(nèi)的動態(tài)變化及其與相關(guān)生理過程之間的聯(lián)系。樂貞等[23]選用瓊脂糖平板法研究PLA活性大小，根據(jù)透明圈和孔的直徑測出蛇毒sPLA2的酶活標準曲線。綜上可知，目前關(guān)于測定PLA活性的方法仍然存在一些限制，并且大部分研究都集中在動物領(lǐng)域，對于植物領(lǐng)域中的PLA活性測定方法尚顯不足。由于植物和動物細胞之間存在一些差異，首先，植物體內(nèi)PLA活性水平相對較低，需要更加敏感和準確的檢測技術(shù)來進行測定。其次，由于植物組織復(fù)雜多樣，存在著許多干擾因素，如其他酶的存在和反應(yīng)條件的調(diào)控等，使得PLA活性的準確測定變得更加復(fù)雜，因此不能將動物領(lǐng)域中的測定方法直接用于植物。然而，在植物細胞中，PLA活性與其生物學(xué)功能和代謝過程密切相關(guān)。因此，準確測定植物中PLA活性并了解植物中PLA活性的變化原因，揭示其在信號傳導(dǎo)、逆境應(yīng)答、生長發(fā)育等方面的作用機制，對深入研究植物生物學(xué)過程具有重要意義。

盡管PLA活性測定方法有多種選擇，但目前大多數(shù)研究仍然采用傳統(tǒng)的酸堿滴定法[14，"18，"24-26]。酸堿滴定法作為一種經(jīng)典的測定方法，相對于其他復(fù)雜的技術(shù)方法而言，具有適用范圍廣，可靠性強以及相對簡單等優(yōu)點。然而，傳統(tǒng)的酸堿滴定法也存在一些不足之處，例如存在樣品處理過程中可能會受到其他物質(zhì)的干擾以及準確度低等特點。因此，對現(xiàn)有的酸堿滴定法的反應(yīng)條件進行優(yōu)化仍然非常重要，這將有助于提高測定結(jié)果的準確性和實驗效率，并推動相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用發(fā)展。為了更好地優(yōu)化酸堿滴定法的反應(yīng)條件，并使其在檢測植物PLA活性方面更具有適用性，本研究旨在通過優(yōu)化香蕉PLA活性酸堿滴定法的測定條件，從以下5個方面探討香蕉PLA活性測定的最佳條件：反應(yīng)體系的酸堿平衡（pH）、反應(yīng)溫度、反應(yīng)濃度、提取緩沖液體積與果皮質(zhì)量的比值以及反應(yīng)時間。這些優(yōu)化結(jié)果在一定條件上能為進一步研究植物PLA活性以及相關(guān)生物過程提供重要的參考和基礎(chǔ)。

本研究通過酸堿滴定法試驗測得桂蕉1號香蕉PLA活性測定的最佳條件為反應(yīng)體系pH"9，反應(yīng)溫度55"℃，底物濃度4"g/L，底物溶液15"mL，酶的粗提液3"mL，提取緩沖液體積與果皮重量的比值（mL/g）為3，反應(yīng)時間7"h。在此條件下，F(xiàn)FA生成量最高可達（154.78±0.111）μmol/g，磷脂酶活性大小為（22.111±0.016）μmol/（g·h）。同樣反應(yīng)時間下，雷享亮等[14]選用酸堿滴定法測得水稻中PLA活性大小為11.428～14.286"μmol/（g·h）。鄧治等[27]選用分光光度法測得巴西橡膠樹膠乳中PLA活性大小為39.857～43.000"μmol/（mL·h）。經(jīng)過優(yōu)化的酸堿滴定測定條件能夠更加精確、便捷地測定香蕉中PLA的活性，具有良好的可重復(fù)性和可操作性，為進一步研究植物PLA活性以及相關(guān)生物過程提供重要的參考和基礎(chǔ)。

取試驗所得最優(yōu)條件對炭疽病脅迫下的香蕉果實PLA活性進行檢測，結(jié)果顯示，在炭疽菌侵染香蕉果實后，與對照組相比，其PLA活性明顯增加。此外，隨著病害程度加深，果實的PLA活性也不斷增大。這可能是由于在病害侵襲下，果實細胞膜會受到損傷或改變。為了修復(fù)細胞膜損傷，并釋放有益于抵御病原體侵入的信號分子和代謝產(chǎn)物，香蕉果實通過增加PLA酶的活性，使磷脂酰膽堿等磷脂類物質(zhì)發(fā)生水解并釋放出游離脂肪酸、溶解產(chǎn)物和次級信號分子來參與植物的防御反應(yīng)。此外，PLA活性增大還可能是由于香蕉果實對病原微生物或逆境脅迫產(chǎn)生的信號分子的感知和響應(yīng)。這些信號分子可能通過調(diào)節(jié)PLA酶的表達和活性來調(diào)控植物的防御反應(yīng)。因此，我們認為果實的PLA活性變化與其受到的病害程度密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)將為進一步研究PLA活性與病害脅迫之間的關(guān)系提供重要的理論依據(jù)。

參考文獻

[1]"解明明，"柯佑鵬."我國香蕉深加工問題探討[J]."熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2013，"33（3）："75-78.JIE"M"M，"KE"Y"P."Problems"in"deep"processing"of"banana"in"China[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Agriculture，"2013，"33（3）："75-78."（in"Chinese）

[2]"楊鳳，"劉燦燦，"鄧貴明，"何維弟，"李春雨，"易干軍，"盛鷗."香蕉營養(yǎng)品質(zhì)與功能特性研究進展[J]."廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2022，"49（10）："146-154.YANG"F，"LIU"C"C，"DENGnbsp;G"M，"HE"W"D，"LI"C"Y，"YI"G"J，"SHENG"O."Research"progress"of"banana"nutritional"quality"and"functional"properties[J]."Guangdong"Agricultural"Sciences，"2022，"49（10）："146-154."（in"Chinese）

[3]"洪佳敏，"何炎森，"鄭菲艷，"鄭云云，"張帥."香蕉產(chǎn)品加工技術(shù)研究進展[J]."中國農(nóng)學(xué)通報，"2016，"32（34）："180-186.HONG"J"M，"HE"Y"S，"ZHENG"F"Y，"ZHENG"Y"Y，"ZHANG"S."Research"progress"of"banana"products"processing"technology[J]."Chinese"Agricultural"Science"Bulletin，"2016，"32（34）："180-186."（in"Chinese）

[4]"胡從九."淺析世界香蕉市場變化及趨勢[J]."中國熱帶農(nóng)業(yè)，"2020（6）："39-41.HU"C"J."Analysis"on"the"change"and"trend"of"banana"market"in"the"world[J]."China"Tropical"Agriculture，"2020（6）："39-41."（in"Chinese）

[5]"黃媛媛，"徐小俊."全球香蕉產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J]."熱帶農(nóng)業(yè)工程，"2021，"45（5）："34-38.HUANG"Y"Y，"XU"X"J."Current"situation"and"development"trend"of"banana"industry"in"global[J]."Tropical"Agricultural"Engineering，"2021，"45（5）："34-38."（in"Chinese）

[6]"焦新之，"邱鴻濱，"李琳，"江建平."香蕉后熟過程磷脂酶活性、膜透性變化與乙稀釋放相關(guān)性研究[J]."園藝學(xué)報，"1985（3）："145-150.JIAO"X"Z，"QIU"H"B，"LI"L，"JIANG"J"P."Study"on"the"relationship"between"the"activity"of"phospholipase"membrane"permeability"and"the"ethylene"release"during"ripening"of"banana"fruits[J]."Acta"Horticulturae"Sinica，"1985（3）："145-150."（in"Chinese）

[7]"吳小建，"陳茜，"梁朋光，"趙承剛，"欒會燕，"謝祖強，"馮小青，"向昱，"楊兆杏，"何雪梅."炭疽病脅迫下采后香蕉的膜脂代謝[J]."南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，"2021，"52（5）："1325-1333.WU"X"J，"CHEN"Q，"LIANG"P"G，"ZHAO"C"G，"LUAN"H"Y，"XIE"Z"Q，"FENG"X"Q，"XIANG"Y，"YANG"Z"X，"HE"X"M."Membrane"lipid"metabolism"of"postharvest"banana"under"anthracnose"stress[J]."Journal"of"Southern"Agriculture，"2021，"52（5）："1325-1333."（in"Chinese）

[8]"周亞奎，"陳旭玉，"鄭服叢."香蕉炭疽病生物防治研究進展[J]."中國農(nóng)學(xué)通報，"2008（4）："328-331.ZHOU"Y"K，"CHEN"X"Y，"ZHENG"F"C."Advance"in"the"study"on"biological"control"of"banana"anthracnose[J]."Chinese"Agricultural"Science"Bulletin，"2008（4）："328-331"（in"Chinese）

[9]"陳惠萍，"陳曉敏，"蔡世英."香蕉果實后熟過程中活性氧代謝的變化[J]."園藝學(xué)報，"2000（5）："369-370.CHEN"H"P，"CHEN"X"M，"CAI"S"Y."The"change"of"active"oxygen"metabolish"during"the"ripening"of"banana"fruit[J]."Acta"Horticulturae"Sinical，"2000（5）："369-370."（in"Chinese）

[10]"譚衛(wèi)萍，"龐學(xué)群，"張昭其，"黃雪梅."BABA誘導(dǎo)香蕉果實抗病性與貯藏期活性氧積累的關(guān)系[J]."中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2014，"47（16）："3290-3299.TAN"W"P，"PANG"X"Q，"ZHANG"Z"Q，"HUANG"X"M."Accumulation"of"reactive"oxygen"species"related"to"diseasenbsp;resistance"induced"by"baba"in"postharvest"banana"（musa"aaa."cv."brazil）"fruit[J]."Scierctia"Agriculture"Simica，"2014，"47"（16）："3290-3299."（in"Chinese）

[11]"GONZALEZ-MENDOZA"V"M，"SANCHEZ-"SANDOVAL"M"E，"CASTRO-CONCHA"L"A，"HERNANDEZ-"SOTOMAYOR"S"M"T."Phospholipases"C"and"D"and"their"role"in"biotic"and"abiotic"stresses[J]."Plants"（Basel），"2021，"10（5）："921."（in"Chinese）

[12]"史敬芳，"張琪，"宋松泉，"劉軍."磷脂酶及其調(diào)控種子活力研究進展[J]."南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，"2022，"53（9）："2612-2623.SHI"J"F，"ZHANG"Q，"SONG"S"Q，"LIU"J."Phospholipases"and"their"seed"vigor"regulation：a"review[J]."Journal"of"Southern"Agriculture，"2022，"53（9）："2612-2623."（in"Chinese）

[13]"張鷺，"張浩."磷脂酶A2及其功能概述[J]."齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，"2004（2）："178-180.ZHANG"L，"ZHANG"H."Overview"of"phospholipase"A2"and"its"functions[J]."Journal"of"Qiqihar"Medical"University，"2004（2）："178-180."（in"Chinese）

[14]"雷享亮，"曾曉春."水稻磷脂酶A活性測定方法的研究[J]."江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，"2011，"33（5）："851-854.LEI"X"L，"ZENG"X"C."Studies"on"the"measurement"of"phospholipase"a"activity"in"rice[J]."Acta"Agriculturae"Universitatis"Jiangxiensis"（Natural"Sciences"Edition），"2011，"33（5）："851-854."（in"Chinese）

[15]"李麗，"何雪梅，"李昌寶，"孫健，"零東寧，"盛金鳳，"饒川艷，"肖占仕，"李杰民，"鄭鳳錦，"劉國明，"唐雅園."炭疽病菌侵染對香蕉采后品質(zhì)變化及抗病相關(guān)酶活性的影響[J]."現(xiàn)代食品科技，"2017，"33（9）："83-90.LI"L，"HE"X"M."LI"C"B，"SUN"J，"LING"D"N，"SHENG"J"F，"RAO"C"Y，"XIAO"Z"S，"LI"J"M，"ZHENG"F"J，"LIU"G"M，"TANG"Y"Y."Effects"of"colletotrichum"musae"infection"on"the"postharvest"quality"and"related"enzymatic"activities"of"banana"fruit[J]."Modern"Food"Science"and"Technology，"2017，"33（9）："83-90."（in"Chinese）

[16]"李春玲，"王慶國，"胥麗娜，"陳慶敏."一株芒果炭疽病拮抗菌抑菌活性的研究及其鑒定[J]."食品工業(yè)科技，"2012，"33（11）："147-150.LI"C"L，"WANG"Q"G，"XU"L"N，"CHEN"Q"M."Study"on"antibacterial"activity"and"identification"of"an"antagonistic"bacterium"for"controlling"anthracnose"diseases"of"mango[J]."Science"and"Technology"of"Food"Industry，"2012，"33（11）："147-150."（in"Chinese）

[17]"張晉陸，"朱國洪."大麥根綜合利用（1）—磷脂酶提取條件及部分性質(zhì)研究[J]."西部糧油科技，"1999（1）："44-47.ZHANG"J"L，"ZHU"G"H."Comprehensive"utilization"of"germinating"barley"root-an"approach"to"extracting"condition——and"some"qualities"study"of"phospholipase[J]."Grain"Processing，"1999（1）："44-47."（in"Chinese）

[18]"李脈，"楊繼國，"楊博."磷脂酶A1酶活測定方法的研究[J]."現(xiàn)代食品科技，"2007（8）："80-82.LI"M，"YANG"J"G，"YANG"B."Studies"on"the"measurement"of"the"enzymatic"activity"of"phospholipase"A1[J]."Modern"Food"Science"and"Technology，"2007（8）："80-82."（in"Chinese）

• FENG"L，"MANABE"K，"SHOPE"J"C，"WIDMER"S，"DEWALD"D"B，"PRESTWICH"G"D."A"real-time"fluorogenicnbsp;phospholipase"A（2）"assay"for"biochemical"and"cellular"activity"measurements[J]."Biological"Chemistry，"2002，"9（7）：

795-803.

[20]"李宏麗，"王張權(quán)，"楊倩，"孫連妹，"朱銀燕，"安學(xué)勤."模型膽汁中磷脂酶A2活性測定的新方法[J]."南京師大學(xué)報（自然科學(xué)版），"2009，"32（3）："138-140.LI"H"L，"WANG"Z"Q，"YANG"Q，"SUN"L"M，"ZHU"Y"Y，"AN"X"Q."Phospholipase"A2"in"model"bile_"a"new"method"for"activity"determination[J]."Journal"of"Nanjing"Normal"University"（Natural"Science"Edition），"2009，"32（3）："138-140."（in"Chinese）

[21]"MIRSKY"V"M，"CHERNY"V"V，"SOKOLOV"V"S，"MARKIN"V"S."Electrostatic"assay"of"phospholipase"A"activity："an"application"of"the"second"harmonic"method"of"monitoring"membrane"boundary"potentials[J]."Journal"of"Biochemical"and"Biophysical"Methods，"1990，"21（4）："277-284.

[22]"JIMENEZ"M，"CABANES"J，"GANDIA-HERRERO"F，"ESCRIBANO"J，"GARCIA-CARMONA"F，"PEREZ-GILABERT"M."A"continuous"spectrophotometric"assay"for"phospholipase"A（2）"activity[J]."Analytical"Biochemistry，"2003，"319（1）："131-137.

[23]"樂貞，"陳旭明，"姚水洪，"馮敬騫，"朱曉萍，"陳敏."蘇木水提物抗蛇毒磷脂酶A2活性研究[J]."現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究，"2018（12）："23-26.LE"Z，"CHEN"X"M，"YAO"S"H，"FENG"J"Q，"ZHU"X"P，"CHEN"M."Study"on"the"water"extract"of"sappa"lignum"against"the"activity"of"phospholipase"A2"from"snake"venom[J]."Modern"Agricultural"Research，"2018（12）："23-26."（in"Chinese）

[24]"張潔."白藜蘆醇對慢性哮喘模型小鼠氣道炎癥和氣道重塑的影響及其機制探討[D]."南京："南京醫(yī)科大學(xué)，"2012.ZHANG"J."Resveratrol"attenuates"airway"remodelling"by"inhibiting"TGF-β1/smad"signalling"passway"on"chronic"experimental"asthma[D]."Nanjing："Nanjing"Medical"University，"2012."（in"Chinese）

[25]"佟曉旭，"趙京山，"劉靜芳."蛇毒磷脂酶A2的兩種測定方法比較[J]."河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，"1999，"20（6）："372.TONG"X"X，"ZHAO"J"S，"LIU"J"F."Comparison"of"two"measurement"methods"for"snake"venom"phospholipase"A2[J]."Journal"of"Hebei"Medical"University，"1999，"20（6）："372."（in"Chinese）

[26]"趙夢夢，"薛正蓮，"黃祖耀，"蘇燕南，"馬琦亞."三種磷脂酶A1活力測定方法的比較[J]."食品與發(fā)酵科技，"2012，"48（3）："74-77.ZHAO"M"M，"XUE"Z"L，"HUANG"Z"Y，"SU"Y"N，"MA"Q"Y."Comparison"of"three"determination"methods"for"phospholipase"A1"activity[J]."Food"and"Fermentation"Science"amp;"Technology，"2012，"48（3）："74-77."（in"Chinese）

[27]"鄧治，"劉實忠，"?，F(xiàn)周."巴西橡膠樹膠乳磷脂酶A2的分離純化及部分酶學(xué)性質(zhì)鑒定[J]."廣西植物，"2010，"30（6）："876-880.

DENG"Z，"LIU"S"Z，"XIAO"X"Z."Purification"and"enzymatic"characterization"of"phospholipase"A2"from"latex"of"Hevea

brasiliensis[J]."Guihaia，"2010，"30"（6）："876-880."（in"Chinese）