摘要：SDS沉降值是小麥品質(zhì)育種的一項(xiàng)重要指標(biāo)。對(duì)145份小麥品種的SDS沉降值進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，在染色體3DL 末端鑒定到成簇的顯著信號(hào)，結(jié)合peak SNP 的位置與LD 衰減距離鎖定587.514～589.514 Mb為候選區(qū)段；利用重測(cè)序數(shù)據(jù)（http：//wheat.cau.edu.cn/WheatUnion/）發(fā)掘該區(qū)段內(nèi)候選基因的變異位點(diǎn)，再對(duì)SDS沉降值的候選基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。綜合關(guān)聯(lián)結(jié)果、基因注釋和基因表達(dá)分析，獲得沉降值相關(guān)候選基因TraesCS3D03G1092400，命名為TaAGAP-3D?；谠摶虻亩鄳B(tài)性SNP位點(diǎn)開發(fā)了可供育種利用的KASP標(biāo)記Sv-3D-KASP，發(fā)現(xiàn)TaAGAP-3D（C）為SDS沉降值相關(guān)的優(yōu)異等位變異。研究結(jié)果將為小麥SDS沉降值的遺傳改良提供有效分子標(biāo)記，同時(shí)也為進(jìn)一步克隆品質(zhì)基因提供參考。

關(guān)鍵詞：小麥；SDS沉降值；全基因組關(guān)聯(lián)分析；候選基因關(guān)聯(lián)分析；KASP標(biāo)記doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0895

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）12001812

小麥（Triticum aestivum L.）是世界上重要的糧食作物之一，在全球各地廣泛種植，以小麥為主要口糧的人口占世界總?cè)丝诘?5%～40%[1]。隨著生活水平的提高和消費(fèi)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，人們更趨向于營(yíng)養(yǎng)、豐富和健康的飲食消費(fèi)。因此，培育優(yōu)質(zhì)專用小麥已成為現(xiàn)階段小麥育種的重要目標(biāo)。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）沉降值是小麥品質(zhì)育種的一項(xiàng)重要指標(biāo)[2]，其與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和穩(wěn)定時(shí)間等呈顯著正相關(guān)[3]，同時(shí)SDS沉降值是由多基因控制的數(shù)量性狀，具有較高的遺傳力，能夠用于育種早代選擇[45]。

關(guān)聯(lián)分析（association analysis），又稱為關(guān)聯(lián)作圖（association mapping）或連鎖不平衡作圖（linkagedisequilibrium mapping），其基于基因位點(diǎn)間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）進(jìn)行群體內(nèi)基因型與表型的相關(guān)性分析，以此來確定與目標(biāo)性狀密切相關(guān)的基因位點(diǎn)或標(biāo)記位點(diǎn)[6]。根據(jù)基因型鑒定范圍的不同可將關(guān)聯(lián)分析分為全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）和候選基因關(guān)聯(lián)分析（candidate gene association study，CGAS）[7]。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及模型的更新，GWAS已成為解析作物復(fù)雜數(shù)量性狀的有力工具。席甜甜等[8]通過對(duì)337份小麥品種籽粒相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS，定位到49個(gè)穩(wěn)定的顯著單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)。董一帆等[9]利用90K SNP芯片對(duì)259份小麥品種的沉降值、蛋白質(zhì)含量等品質(zhì)性狀進(jìn)行GWAS，檢測(cè)到44個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。CGAS是進(jìn)行候選基因挖掘和功能驗(yàn)證的一種有效手段，可以借助前人的QTL作圖、表達(dá)譜等研究結(jié)果，優(yōu)先選擇與目標(biāo)性狀相關(guān)的候選基因，結(jié)合表型數(shù)據(jù)、群體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析[10]。Ehrenreich等[11]基于275份擬南芥材料對(duì)51個(gè)開花時(shí)間相關(guān)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步鑒定到2～10個(gè)與開花時(shí)間顯著相關(guān)的基因，其中CO 基因是最可能的候選基因。Wilson等[12]對(duì)玉米籽粒淀粉含量相關(guān)的6個(gè)候選基因進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)這些基因分別影響籽粒組分性狀、淀粉糊化特性和直鏈淀粉水平。上述結(jié)果表明，CGAS是候選基因挖掘及基因功能驗(yàn)證的重要方法。

本研究以145份小麥品種為材料，結(jié)合重測(cè)序數(shù)據(jù)和多年多點(diǎn)SDS沉降值表型數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，挖掘相關(guān)候選區(qū)段，進(jìn)一步通過候選基因關(guān)聯(lián)分析篩選目標(biāo)基因，根據(jù)目標(biāo)基因的差異位點(diǎn)開發(fā)競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitiveallele-specific PCR，KASP）標(biāo)記，并設(shè)計(jì)衍生限制性內(nèi)切酶多態(tài)性標(biāo)記（derived cleaved amplifiedpolymorphic sequences，dCAPS）加以驗(yàn)證，為小麥品質(zhì)基因克隆及分子機(jī)制解析提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的145份重測(cè)序自然群體為材料，包含100份育成品種，25份地方品種和20份國(guó)外引進(jìn)品種[13]。試驗(yàn)材料分別種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所新鄉(xiāng)試驗(yàn)基地（113°54′ E，35°18′ N）和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所順義試驗(yàn)基地（116°65′ E，40°13′ N）。每份材料種植4行，行長(zhǎng)2 m，行距25 cm，人工點(diǎn)播，每行播種40粒。田間管理依據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際進(jìn)行管理，材料成熟后選取中間兩行全株收獲并脫粒曬干。

本研究試驗(yàn)材料的鑒定環(huán)境包括2018/2019年河南新鄉(xiāng)（E1）、2019/2020 年河南新鄉(xiāng)（E2）、2019/2020年北京順義（E3）、2020/2021年河南新鄉(xiāng)（E4）、2020/2021 年北京順義（E5）、2021/2022年河南新鄉(xiāng)（E6）、2021/2022 年北京順義（E7）以及上述7個(gè)環(huán)境的最佳線性無偏估計(jì)（best linearunbiased prediction，BLUP）。

1.2 微量SDS 沉降值測(cè)定

將待試樣品按GB5497—1985[14]定溫定時(shí)法測(cè)定面粉含水量。用80 目篩旋風(fēng)磨（型號(hào)Cyclotec 1093，F(xiàn)OSS公司，德國(guó)）將小麥磨成全粉，參照馬傳喜等[5]方法測(cè)定微量SDS沉降值。具體步驟如下：稱取全麥粉2 g，裝入35 mL的專用帶塞試管中，加入16.7 mL溴酚藍(lán)溶液，充分混勻后放置到沉淀值測(cè)定儀（型號(hào)Y15，YUCEBAS公司，土耳其）上搖5 min；取下試管再加入16.7 mLSDS-乳酸混合液（稱取20 g SDS，加入20 mL乳酸儲(chǔ)備液，用水溶解并定容至1 L），充分搖勻，放置到測(cè)定儀上搖5 min；取下試管豎立靜止放置5 min，記錄試管中沉淀體積。

每個(gè)樣品2次重復(fù)，取其平均值。以面粉含水量14%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）濕基計(jì)算沉降值（mL），公式如下。

1.3 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用IBM SPSS Statistics 27.0 軟件（https：//www.ibm.com/spss）和Microsoft Excel 2021對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)、方差分析和基本描述性統(tǒng)計(jì)。利用R語言“l(fā)me4”程序包[15]計(jì)算BLUP值，以基因型為固定效應(yīng)、環(huán)境為隨機(jī)效應(yīng)，計(jì)算遺傳力（公式2）。通過R語言繪制不同環(huán)境下SDS沉降值的頻率分布圖和相關(guān)性分析圖。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

基因型數(shù)據(jù)來自實(shí)驗(yàn)室前期獲得的重測(cè)序數(shù)據(jù)[13]，本研究利用VCFtools-1.15對(duì)其進(jìn)行質(zhì)控，共鑒定到37 466 916個(gè)高質(zhì)量的多態(tài)性SNP位點(diǎn)。質(zhì)控參數(shù)為--minGQ 8 --minDP 12 --max-missing 0.9 --maf0.05 --min-alleles 2 --max-alleles 2。群體結(jié)構(gòu)、LD衰減距離及主成分分析等參照已發(fā)表結(jié)果[13]，即群體結(jié)構(gòu)和主成分均為3，LD衰減距離為2 Mb。

全基因組關(guān)聯(lián)分析采用GEMMA（genomewideefficient mixed-model association）軟件的混合線性模型（mix linear model，MLM）[16]，利用Q+K矩陣矯正群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的影響。為了進(jìn)一步控制假陽(yáng)性，顯著性閾值設(shè)定為Plt;1.0×10-6。

通過R語言將關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖和Q-Q圖進(jìn)行可視化。通過LDBlockShow v1.39 軟件[17]統(tǒng)計(jì)區(qū)段內(nèi)變異位點(diǎn)的連鎖不平衡程度并繪制熱圖?；趀xpVIP8（http：//www. wheat-expression.com/）分析基因表達(dá)模式。

1.5 候選基因關(guān)聯(lián)分析

在顯著關(guān)聯(lián)候選區(qū)段發(fā)掘的基礎(chǔ)上，利用實(shí)驗(yàn)室前期的重測(cè)序數(shù)據(jù)[13]（http：//wheat.cau.edu.cn/WheatUnion/）查詢區(qū)段內(nèi)所有候選基因的序列變異（包含上下游及3’/5’-UTR區(qū)的變異），提取全部變異位點(diǎn)作為基因型數(shù)據(jù)。候選基因關(guān)聯(lián)分析使用GAPIT v3.0包（genomic association and predictionintegrated tool version 3.0）[18]的貝葉斯信息與連鎖不平衡迭代嵌套式模型（bayesian-information andlinkage-disequilibrium iteratively nested keyway，BLINK）[19]。依據(jù)Bonferroni 方法，以Plt;1.0×10-4 為閾值判定SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)。

1.6 KASP 標(biāo)記開發(fā)與驗(yàn)證

根據(jù)候選基因顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性KASP引物（WheatOmics v1.0網(wǎng)站，http：//wheatomics.sdau.edu.cn/），包含2條帶有熒光接頭的分型上游引物F1-FAM 和F2-HEX 以及1 條通用下游引物Common-primer-R，引物序列見表1。KASP引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，反應(yīng)在384孔熒光定量PCR板上進(jìn)行。混合反應(yīng)體系5 μL∶2.2 μL DNA（20～40 ng·μL-1），2.5 μL KASP Mastermix 和0.3 μL Primer mix（F1-FAM、F2-HEX、Common-primer-R分別3.0、3.0、7.5 μL，利用ddH2O加到25 μL）。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s，62 ℃退火40 s，10個(gè)循環(huán)；95 ℃變性20 s，58 ℃退火40 s，37個(gè)循環(huán)；28 ℃讀板 1 min。采用QuantStudioTM 7 Flex 熒光定量?jī)x（appliedbiosystems by life technologies）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，QuantStudioTM Real-time PCR Software v1.3（applied biosystems by life technologies）軟件實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的可視化及結(jié)果判讀。通過OriginPro 2024軟件（https：//www.originlab.com/）對(duì)KASP 變異與SDS 沉降值的箱線圖進(jìn)行可視化。

1.7 dCAPS 擴(kuò)增與酶切

為了驗(yàn)證KASP標(biāo)記的有效性，進(jìn)一步利用dCAPS Finder 2.0網(wǎng)站（http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）設(shè)計(jì)特異性dCAPS引物，包含一輪特異性正向引物dCAPS-F1 和反向引物dCAPS-R1（表1），該引物擴(kuò)增包含變異位點(diǎn)的585 bp PCR產(chǎn)物。第2次PCR時(shí)，在SNP位點(diǎn)上游引入GA變異，包含特異性正向和反向引物dCAPS-F2 和dCAPS-R2（表1），并形成內(nèi)切酶Sal Ⅰ的識(shí)別位點(diǎn)“GTCGAC”。利用內(nèi)切酶Sal Ⅰ對(duì)二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物在4%的瓊脂糖凝膠中電泳。

具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先進(jìn)行一輪PCR，反應(yīng)體系為DNA（50 ng·μL-1） 2 μL，2×Mix 10 μL，dCAPS-F1 （10 μmol·L-1） 1 μL， dCAPS-R1（10 μmol·L-1） 1 μL，加ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保溫。然后，將一輪PCR 產(chǎn)物稀釋200倍作為二輪PCR的模板，引物為dCAPS-F2和dCAPS-R2，使用2×Mix進(jìn)行二輪PCR，體系及擴(kuò)增程序同上。利用內(nèi)切酶Sal Ⅰ對(duì)二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切孵育，孵育條件為37 ℃，4 h。反應(yīng)體系為：PCR 產(chǎn)物5 μL，10×Buffer 1 μL，限制性內(nèi)切酶0.2 μL，ddH2O補(bǔ)至10 μL。最后，酶切產(chǎn)物在4%的瓊脂糖凝膠電泳（120 V穩(wěn)壓電泳20 min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS 沉降值表型變異分析

145份供試材料多年多點(diǎn)的SDS沉降值基本描述性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表2所示。可以看出，不同環(huán)境下SDS 沉降值的變異系數(shù)在14.15%～19.30%，其廣義遺傳力為94.10%，這表明SDS 沉降值主要受遺傳因素影響，供試材料間存在較豐富的遺傳變異。SDS沉降值的偏度和峰度絕對(duì)值均小于1，且頻率分布直方圖均呈現(xiàn)出正態(tài)分布（圖1），表明SDS沉降值是由多基因控制的數(shù)量性狀，適用于后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。相關(guān)性分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，環(huán)境間的SDS沉降值呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在0.47～0.94（Plt;0.001）。

2.2 SDS 沉降值全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于質(zhì)控后的重測(cè)序基因型數(shù)據(jù)，利用GEMMA軟件的MLM模型對(duì)多環(huán)境下的SDS沉降值進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。根據(jù)LD衰減距離，將peak SNP位置前后1 Mb設(shè)定為候選區(qū)段。在3DL末端發(fā)現(xiàn)成簇的顯著信號(hào)（Plt;1.0×10-6），參照peakSNP的物理位置，鎖定587.514～589.514 Mb為候選區(qū)段（圖2A）。該區(qū)段內(nèi)變異位點(diǎn)的連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)（圖2B），多個(gè)LD區(qū)域與顯著位點(diǎn)強(qiáng)連鎖，進(jìn)一步表明該區(qū)段與SDS沉降值存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。基于WheatOmics v1.0 網(wǎng)站（http：//wheatomics.sdau.edu.cn/）查詢發(fā)現(xiàn)，該區(qū)段包含28個(gè)高置信基因，其中通過expVIP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.wheat-expression.com/）預(yù)測(cè)顯示9個(gè)基因在籽粒中表達(dá)（圖2C）。

2.3 3DL 末端區(qū)段候選基因關(guān)聯(lián)分析

利用重測(cè)序數(shù)據(jù)（http：//wheat. cau. edu. cn/WheatUnion/）查詢28個(gè)高置信基因的變異位點(diǎn)，其中21個(gè)基因存在變異位點(diǎn)，獲得1 473個(gè)SNPs。結(jié)合多年多點(diǎn)的SDS沉降值表型數(shù)據(jù)，利用GAPITv3.0包的BLINK模型進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果（圖3A、B）表明，6 個(gè)SNP 位點(diǎn)顯著關(guān)聯(lián)（Plt;1.0×10-4），其中1個(gè)位點(diǎn)在4個(gè)環(huán)境下均顯著關(guān)聯(lián)（圖3A、表3）。進(jìn)一步對(duì)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行注釋，4個(gè)位點(diǎn)為啟動(dòng)子上游，5’-UTR和編碼區(qū)變異，而其他2個(gè)位點(diǎn)為內(nèi)含子變異（圖3A，表3）。有趣的是，這6個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)分別位于6個(gè)基因上，這些基因的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)僅有3個(gè)基因在籽粒中表達(dá)。結(jié)合表達(dá)量分析和變異位點(diǎn)注釋，初步鎖定TraesCS3D03G10-92400 和TraesCS3D03G1089600 為候選基因?；蜃⑨尡砻鱐raesCS3D03G1092400 編碼GTP相關(guān)的激活蛋白（Arf GTPase activating protein），而TraesCS3D0-3G1089600 編碼絨毛蛋白（Villin）。綜合上述結(jié)果，推測(cè)TraesCS3D03G1092400 為SDS沉降值的候選基因，并將其命名為TaAGAP-3D。

2.4 TaAGAP-3D 基因KASP 標(biāo)記開發(fā)與驗(yàn)證

根據(jù)TaAGAP-3D 編碼區(qū)上SNP 的兩種變異類型（C/T）（圖A），開發(fā)了有效區(qū)分它們的KASP標(biāo)記Sv-3D-KASP（圖B）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證KASP標(biāo)記的準(zhǔn)確性，同時(shí)設(shè)計(jì)了dCAPS 標(biāo)記Sv-3DdCAPS-1（圖4C），該標(biāo)記的分型結(jié)果與KASP 標(biāo)記基本吻合（表4）。進(jìn)一步結(jié)合多年多點(diǎn)的SDS沉降值數(shù)據(jù)驗(yàn)證KASP標(biāo)記的遺傳效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)環(huán)境下TaAGAP-3D（C）型材料的SDS 沉降值顯著高于TaAGAP-3D（T）型材料（圖4D），表明TaAGAP-3D（C） 是SDS 沉降值相關(guān)的優(yōu)異等位變異。

3 討論

3.1 小麥3D 染色體上沉降值關(guān)聯(lián)區(qū)段的多效性分析

小麥?zhǔn)钱愒戳扼w作物，與A、B亞基因組相比，其D亞基因組的遺傳多樣性嚴(yán)重匱乏，是小麥品種改良的重要瓶頸[2021]。本研究在3D染色體的末端定位到1個(gè)SDS沉降值候選區(qū)段，其物理位置為587.523～589.514 Mb。陳華斌[22] 利用90KSNP芯片鑒定272份小麥材料，結(jié)合蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在3DL末端檢測(cè)到多個(gè)顯著位點(diǎn)（IWB18421、IWB42714、IWB6798、IWB2250 和IWB58810），其物理位置相近，分別為596.089、596.718、596.916、596.916 和609.626 Mb；基于全基因組LD衰減距離18.3 Mb，該研究將這些位點(diǎn)劃分到了同一QTL區(qū)段，而該區(qū)段涵蓋了本研究鑒定到的位點(diǎn)。彭小愛等[23]對(duì)118份小麥材料的55K SNP芯片基因型數(shù)據(jù)和容重進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在3個(gè)環(huán)境下均定位到了3D染色體上的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)AX-108887454，其物理位置為590.04 Mb；基于作者報(bào)道的8 Mb全基因組LD衰減距離，該候選區(qū)段同樣包含了本研究定位到的區(qū)段。這些結(jié)果表明本研究鑒定的3DL末端區(qū)段可能控制多個(gè)品質(zhì)性狀，其遺傳基礎(chǔ)有待進(jìn)一步深入解析。

3.2 聯(lián)合多種關(guān)聯(lián)分析縮小候選區(qū)段及預(yù)測(cè)候選基因

全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）是對(duì)全基因組范圍內(nèi)的基因型與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的方法，根據(jù)成簇的顯著信號(hào)及LD衰減距離定位候選區(qū)段[24]。而候選基因關(guān)聯(lián)分析（CGAS）則通過目標(biāo)區(qū)段內(nèi)候選基因的變異位點(diǎn)與表型展開關(guān)聯(lián)分析，利用統(tǒng)計(jì)分析挖掘與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因或功能位點(diǎn)[25]，從而進(jìn)一步篩選候選基因。前人的研究大多數(shù)僅考慮使用GWAS或CGAS單一方法鑒定候選區(qū)段或基因，如Wen 等[26]利用重測(cè)序技術(shù)對(duì)121份棉花種質(zhì)資源進(jìn)行GWAS，檢測(cè)到與株高和果枝數(shù)量相關(guān)的11 個(gè)QTLs；Setter 等[27] 對(duì)玉米540個(gè)基因的1 229個(gè)SNP進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)一些基因的SNP與糖和脫落酸相關(guān)。前人也聯(lián)合GWAS與其他組學(xué)分析進(jìn)行共定位以縮小候選區(qū)段和預(yù)測(cè)候選基因，如Tang 等[28]結(jié)合GWAS和轉(zhuǎn)錄組分析來解析505份甘藍(lán)型油菜含油量的遺傳基礎(chǔ)，通過GWAS鑒定到27個(gè)與含油量顯著相關(guān)的QTLs后，進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組分析鎖定了候選基因；Anacleto等[29]聯(lián)合GWAS和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析（transcriptome-wide association study，TWAS）對(duì)305 份秈稻的血糖生成指數(shù)（glycemicindex，GI）進(jìn)行分析，GWAS在 6號(hào)染色體上鑒定到1 個(gè)與GI 性狀相關(guān)且包含26 個(gè)基因的區(qū)段，TWAS分析進(jìn)一步將該區(qū)段內(nèi)的候選基因縮小至13個(gè)。本研究通過聯(lián)合GWAS和CGAS有效縮小了與SDS沉降值相關(guān)的候選區(qū)段并預(yù)測(cè)了候選基因（圖2A和3A）。因此，全基因組關(guān)聯(lián)分析聯(lián)合其他多種分析方法如候選基因關(guān)聯(lián)分析，可以更有效地發(fā)掘作物重要農(nóng)藝性狀基因。

本研究預(yù)測(cè)的候選基因TraesCS3D03G1092400 被注釋為ARF-GTP酶激活蛋白，關(guān)聯(lián)分析表明該基因與SDS沉降值相關(guān)。鑒于水稻中已克隆了1個(gè)具有相同注釋的基因OsAGAP[30]，因此將其命名為TaAGAP-3D。研究表明，OsAGAP 能夠調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素內(nèi)流、囊泡運(yùn)輸和根發(fā)育[31]；并且在小麥中發(fā)現(xiàn)GPC-B1 編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子（NAM-B1），RNA干擾后延遲衰老并使小麥籽粒的蛋白質(zhì)、鋅和鐵含量降低30%以上[32]。綜上所述，推測(cè)TaAGAP-3D可能響應(yīng)生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)信號(hào)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行再分配，其基因功能和分子機(jī)制有待通過多種分子生物學(xué)方法進(jìn)一步研究。

3.3 小麥品質(zhì)相關(guān)KASP 標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用

隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇已經(jīng)成為現(xiàn)代分子育種的有效工具[33]?；赟NP的KASP基因分型技術(shù)具有靈活性強(qiáng)、高通量、成本低及操作簡(jiǎn)單高效等特點(diǎn)，在分子標(biāo)記輔助選擇育種中得到廣泛的應(yīng)用。在小麥中，KASP技術(shù)多用于抗病和耐非生物脅迫相關(guān)基因的研究[34]，而在品質(zhì)方面的分子標(biāo)記還較少。魏廣源等[35]通過硒含量相關(guān)的SNP位點(diǎn)開發(fā)KASP標(biāo)記AX-1和AX-2，該標(biāo)記能夠有效區(qū)分高硒和低硒籽粒樣品并用于高硒小麥選育。Liu等[36]基于Gli-γ1-1D 的2種主要單倍型（Gli-γ1-Ⅰ和Gli-γ1-Ⅱ）開發(fā)了KASP標(biāo)記，206份小麥材料基因型鑒定發(fā)現(xiàn)攜帶Gli-γ1-Ⅰ材料的SDS沉降值顯著高于攜帶Gli-γ1-Ⅱ材料，這為Gli-γ1-Ⅰ在小麥品質(zhì)分子育種中的利用提供了可靠標(biāo)記。畢俊鴿等[37]針對(duì)QTL定位到的與籽粒蛋白質(zhì)含量相關(guān)的候選基因開發(fā)了2個(gè)KASP標(biāo)記并在166份國(guó)內(nèi)外小麥材料中進(jìn)行驗(yàn)證，用于篩選高籽粒蛋白質(zhì)含量的優(yōu)異資源。本研究基于TaAGAP-3D 多態(tài)性SNP 位點(diǎn)開發(fā)了KASP 標(biāo)記Sv-3D-KASP，并發(fā)現(xiàn)TaAGAP-3D（C）為SDS沉降值相關(guān)的優(yōu)異變異，將為小麥品質(zhì)分子標(biāo)記輔助育種提供新基因和新標(biāo)記。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ LIU Y X， LIN Y， GAO S， et al .. A genome-wide association study of 23 agronomic traits in Chinese wheat landraces [J].Plant J.， 2017，91（5）：861-873.

［2］ 范金平，呂國(guó)鋒，張伯橋，等.SDS沉降值在小麥良種繁育中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2003（6）：1043-1044.

FAN J P， LYU G F， ZHANG B Q， et al .. Application of SDS sedimentation value in wheat breeding [J]. J. Anhui Agric. Sci.，2003（6）：1043-1044.

［3］ 王峰.小麥品質(zhì)性狀的遺傳變異和誘變研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

WANG F. Studies on genetic variation and mutation of quality traits in wheat [D]. Hefei： Anhui Agricultural University， 2013.

［4］ 夏云祥，陳輝，司紅起，等. 小麥微核心種質(zhì)中育成品種和地方品種的SDS沉降值分析[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2011（10）：12-14.

XIA Y X， CHEN H， SI H Q， et al .. Analysis of SDSsedimentation volume in bred and local varieties of Chinese wheat micro-core collections [J]. Cereal Feed. Ind.， 2011（10）：12-14.

［5］ 馬傳喜，徐風(fēng)，汪心樂.影響SDS沉降值的試驗(yàn)因素分析[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995， 22 （1）：1-6.

MA C X， XU F. WANG X L. Analysis of experimental factors affecting SDS sedimentation value [J]. J. Anhui Agric. Univ.，1995，22（1） ：1-6.

［6］ FLINT-GARCIA S A， THORNSBERRY J M， BUCKLER E S. Structure of linkage disequilibrium in plants [J]. Annu. Rev.Plant Biol.， 2003，54：357-374.

［7］ ZHU C S， GORE M， BUCKLER E S， et al .. Status and prospects of association mapping in plants [J]. Plant Genome，2008， 1（1）： 5-20.

［8］ 席甜甜，吳倩，楊建光，等. 337份小麥品種籽粒相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)，2024，44（5）：547-558.

XI T T， WU Q， YANG J G， et al .. Genome-wide association studies of 337 wheat varieties for grain-related traits [J]. J.Triticeae Crops， 2024，44（5）：547-558.

［9］ 董一帆，任毅，程宇坤，等. 冬小麥籽粒主要品質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，56（11）：2047-2063.

DONG Y F， REN Y， CHENG Y K， et al .. Genome-wide association study of grain main quality related traits in winter wheat [J]. Sci. Agric. Sin.， 2023，56（11）：2047-2063.

［10］ 王榮煥，王天宇，黎裕.關(guān)聯(lián)分析在作物種質(zhì)資源分子評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2007，8（3）：366-372.

WANG R H， WANG T Y， LI Y. Application of association analysis in molecular evaluation of crop germplasm resources[J]. J. Plant Genet. Resour.， 2007，8（3）：366-372.

［11］ EHRENREICH I M， HANZAWA Y， CHOU L， et al ..Candidate gene association mapping of Arabidopsis flowering time [J]. Genetics， 2009，183（1）：325-335.

［12］ WILSON L M， WHITT S R， IBANEZ A M， et al . Dissection of maize kernel composition and starch production by candidate gene association [J]. Plant Cell， 2004， 16（10）： 2719-2733.

［13］ HAO C Y， JIAO C Z， HOU J， et al .. Resequencing of 145 landmark cultivars reveals asymmetric sub-genome selection and strong founder genotype effects on wheat breeding in China [J]. Mol. Plant， 2020，13（12）：1733-1751.

［14］ 高修吾，楊浩然，吳艷霞，等.糧食、油料檢驗(yàn) 水分測(cè)定法：GB5497—1985[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1985.

［15］ BATES D， MACHLER M， BOLKER B， et al .. Fitting linear mixed-effects models using lme4 [J]. J. Stat. Software， 2015，67（1）：1-48.

［16］ ZHOU X， STEPHENS M. Genome-wide efficient mixed-model analysis for association studies [J]. Nat. Genet.， 2012， 44（7）：821-824.

［17］ DONG S S， HE W M， JI J J， et al .. LDBlockShow：a fast and convenient tool for visualizing linkage disequilibrium and haplotype blocks based on variant call format files [J/OL].Brief. Bioinform.， 2021， 22（4）： bbaa227 [2024-11-05]. https：//doi.org/ 10.1093/bib/bbaa227.

［18］ WANG J B， ZHANG Z W. GAPIT version 3：boosting power and accuracy for genomic association and prediction [J].Genom. Proteom. Bioinform.， 2021，19（4）：629-640.

［19］ HUANG M， LIU X L， ZHOU Y， et al .. BLINK：a package for the next level of genome-wide association studies with both individuals and markers in the millions [J]. Gigascience， 2019，8（2）：giy154 [2024-11-06]. https：//doi.org/10.1093/gigascience/giy154.

［20］ VOSS-FELS K， FRISCH M， QIAN L W，et al .. Subgenomic diversity patterns caused by directional selection in bread wheat gene pools [J/OL]. Plant Genome， 2015， 8（2）： 03.0013[2024-11-06]. https：//doi.org/10.3835/plantgenome2015.03.0013.

［21］ PONT C， LEROY T， SEIDEL M， et al .. Tracing the ancestry of modern bread wheats [J]. Nat. Genet.， 2019，51（5）：905-911.

［22］ 陳華斌.小麥粒形、品質(zhì)和農(nóng)藝相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析[D].杭州：浙江大學(xué)， 2021.

CHEN H B. Genome-wide association study of grain shape， quality and agronomic related traits in wheat [D]. Hangzhou：Zhejiang University， 2021.

［23］ 彭小愛，盧茂昂，張玲，等.基于55K SNP芯片的小麥籽粒主要品質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析[J].作物學(xué)報(bào)， 2024， 50（8）：1948-1960.

PENG X A， LU M A， ZHANG L， et al .. Genome-wide association study of major grain quality traits in wheat based on 55K SNP arrays [J]. Acta Agron. Sin.， 2024， 50（8）：1948-1960.

［24］ 任生林，吳才文，經(jīng)艷芬，等.全基因組關(guān)聯(lián)分析在作物中的研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2024，22（11）：3594-3602.

REN S L， WU C W， JING Y F， et al .. Research progress of genome-wide association analysis in crops [J]. Mol. Plant Breeding， 2024， 22（11）： 3594-3602.

［25］ 吳寧寧.玉米種質(zhì)粒型及粒重性狀的鑒定和全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）[D].杭州： 浙江農(nóng)林大學(xué)， 2023.

WU N N. Identification of grain type and grain weight traits in maize germplasms and genome-wide association analysis （GWAS） [D]. Hangzhou： Zhejiang Aamp;F University， 2023.

［26］ WEN T W， DAI B S， WANG T， et al .. Genetic variations in plant architecture traits in cotton （Gossypium hirsutum）revealed by a genome-wide association study [J]. Crop J.， 2019，7（2）：209-216.

［27］ SETTER T L， YAN J B， WARBURTON M， et al .. Genetic association mapping identifies single nucleotide polymorphisms in genes that affect abscisic acid levels in maize floral tissues during drought [J]. J. Exp. Bot.， 2011，62（2）：701-716.

［28］ TANG S， ZHAO H， LU S P， et al .. Genome- and transcriptomewide association studies provide insights into the genetic basis of natural variation of seed oil content in Brassica napus [J]. Mol. Plant， 2021，14（3）：470-487.

［29］ ANACLETO R， BADONI S， PARWEEN S，et al .. Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice [J]. Plant Biotechnol. J.， 2019，17（7）：1261-1275.

［30］ ZHUANG X L， XU Y， CHONG K， et al .. OsAGAP，an ARFGAP from rice，regulates root development mediated by auxin in Arabidopsis [J]. Plant Cell Environ.， 2005，28（2）：147-156.

［31］ ZHUANG X L， JIANG J F， LI J H， et al.. Over-expression of OsAGAP， an ARF-GAP， interferes with auxin influx， vesicle trafficking and root development [J]. Plant J.， 2006，48（4）：581-591.

［32］ UAUY C， DISTELFELD A， FAHIMA T， et al .. A NAC gene regulating senescence improves grain protein， zinc， and iron content in wheat [J]. Science， 2006，314（5803）：1298-1301.

［33］ COLLARD B C， MACKILL D J. Marker-assisted selection：an approach for precision plant breeding in the twenty-first century [J]. Philos. Trans. R. Soc. Lond. Ser. Biol. Sci.， 2008， 363（1491）：557-572.

［34］ 楊青青，唐家琪，張昌泉，等. KASP標(biāo)記技術(shù)在主要農(nóng)作物中的應(yīng)用及展望[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2022，38（4）：58-71.

YANG Q Q， TANG J Q， ZHANG C Q， et al .. Application and prospect of KASP marker technology in main crops [J].Biotechnol. Bull.， 2022，38（4）：58-71.

［35］ 魏廣輝，李執(zhí)，陳強(qiáng)，等. 人工合成小麥SHW-L1 高硒含量KASP 分子標(biāo)記開發(fā)及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，53（20）：4103-4112.

WEI G H，LI Z，CHEN Q，et al .. Development and utilization of KASP marker for Se concentration in synthetic wheat SHW-L1[J]. Sci. Agric. Sin.， 2020，53（20）：4103-4112.

［36］ LIU D， YANG H， ZHANG Z， et al .. An elite γ-gliadin allele improves end-use quality in wheat [J]. New Phytol.， 2023，239（1）：87-101.

［37］ 畢俊鴿，曾占奎，李瓊，等. 兩個(gè)RIL群體中小麥籽粒品質(zhì)相關(guān)性狀QTL 定位及KASP 標(biāo)記開發(fā)[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2024，50（7）： 1669-1683.

BI J G， ZENG Z K， LI Q， et al .. QTL mapping and KASP marker development of grain quality-relating traits in two wheat RIL populations [J]. Acta Agron. Sin.， 2024， 50（7）：1669-1683.