摘要：為研究黃花蒿石油醚萃取物對粘蟲3齡幼蟲殺蟲活性成分及初步作用機(jī)制，采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，氣相?質(zhì)譜法分析化學(xué)成分，浸蟲法測定不同餾分及主要成分的觸殺活性，并進(jìn)一步對活性成分進(jìn)行粘蟲幼蟲體內(nèi)靶標(biāo)酶和代謝酶活性測定。結(jié)果表明，黃花蒿石油醚萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，共得到27個(gè)餾分，其中餾分8表現(xiàn)出較好的觸殺活性。經(jīng)氣相色譜?質(zhì)譜法檢測，十三烷、4-喹啉甲醛、石竹烯氧化物、亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯為主要化合物，含量分別為7.9%、72.8%、3.6%、2.4%、3.1%。這5種化合物處理粘蟲7 d的半數(shù)致死濃度（LC50）分別為7.9、2.5、3.6、5.4和1.5 mg·mL-1，即亞麻酸乙酯對粘蟲的觸殺活性最好。掃描電鏡結(jié)果顯示，1.5 mg·mL-1亞麻酸乙酯處理粘蟲7 d，粘蟲表皮蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)排列疏松，蠟質(zhì)層顆粒明顯消失，蠟花間隙增大；在處理過程中，粘蟲的乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶表現(xiàn)出先激活后抑制作用；Na+-K+-ATPase表現(xiàn)出持續(xù)抑制作用；過氧化氫酶表現(xiàn)出先抑制后激活作用。綜上，亞麻酸乙酯為黃花蒿對粘蟲殺蟲活性的主要化合物，研究結(jié)果為黃花蒿資源的開發(fā)利用以及將亞麻酸乙酯作為生物防治粘蟲的潛力化合物提供參考。

關(guān)鍵詞：黃花蒿；粘蟲；亞麻酸乙酯；作用機(jī)制doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0589

中圖分類號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）12012909

粘蟲（Mythimna separate Walker）是鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）昆蟲，具有暴食性、突發(fā)性和毀滅性等特點(diǎn)[1]。其主要為害玉米、水稻、小麥、高粱等糧食作物[2]。粘蟲通過取食植物葉片，造成幼嫩葉片嚴(yán)重缺失和蟲糞污染，導(dǎo)致糧食作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降[3]。目前，主要使用辛硫磷和高效氯氟氰菊酯[4]等化學(xué)農(nóng)藥防治粘蟲，但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致粘蟲產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境污染和人畜安全等問題。為減少殺蟲劑的使用量，延緩害蟲抗藥性的產(chǎn)生，目前利用粘蟲黑卵蜂、粘蟲赤眼蜂和管側(cè)溝繭蜂等捕食性天敵，核型多角體病毒以及苦參堿、印楝素等生物農(nóng)藥對粘蟲進(jìn)行防治，均取得了較好的效果。在植物與環(huán)境長期協(xié)同進(jìn)化過程中，為了生存和適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境，植物組織產(chǎn)生了許多結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣以及機(jī)理獨(dú)特的次生代謝物質(zhì)[5]。這些物質(zhì)可對昆蟲產(chǎn)生觸殺、胃毒、拒食、引誘、趨避和產(chǎn)卵抑制等作用[6]，且因其具有良好的有效性、安全性和生態(tài)可接受性受到廣泛關(guān)注。

黃花蒿（Artemisia annua L.）又名青蒿，為菊科蒿屬一年生草本植物，常生于路旁、荒地、山坡和林緣等地，生態(tài)適應(yīng)性廣，遍布全國各地[7]。關(guān)于其殺蟲活性的報(bào)道主要集中在提取物和揮發(fā)油方面，化合物的殺蟲活性報(bào)道較少。黃花蒿乙醇提取物對菜青蟲（Pieris rapae）具有觸殺活性[8]，對南部灰翅夜蛾（Spodoptera eridania） 和瓢蟲（Epilachna paenulata）具有拒食活性[9]；甲醇提取物對赤擬谷盜（Tribolium castaneum）具有觸殺活性[10]；丙酮提取物對菜蚜（Lipaphis erysimi））具有觸殺和胃毒活性[11]，對朱砂葉螨（Tetranychuscinnabarinus）具有觸殺蟲活性[12]；石油醚提取物對黑翅土白蟻（Odontotermes formosanus）、赤擬谷盜、谷蠹（Rhizopertha dominica）、棉蚜（Aphis gossypii）、棉紅蜘蛛（Tetranychus urticae）、豇豆莢螟（Etiellazinckenella）具有拒食活性[13]，對赤擬谷盜具有觸殺活性[10]；黃花蒿揮發(fā)油對黑頰麗蠅（Calliphoravomitoria）[14]、赤擬谷盜[15]具有觸殺和熏蒸活性；從黃花蒿中分離得到的1，8桉葉腦對赤擬谷盜具有觸殺、熏蒸和拒食活性[16]?；谇捌趯S花蒿等8種蒿屬植物的篩選發(fā)現(xiàn)，黃花蒿石油醚萃取物對粘蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的觸殺活性[17]。因此，本研究以觸殺活性為導(dǎo)向，對黃花蒿石油醚萃取物中的活性成分進(jìn)行柱色譜分離，采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析活性餾分中的主要化合物，并進(jìn)行活性化合物的作用機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物與試蟲 黃花蒿于2020年8月采自西藏拉薩市城關(guān)區(qū)，經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)杜凡教授鑒定為菊科蒿屬植物黃花蒿。粘蟲蟲卵由河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司提供，飼養(yǎng)條件：溫度（27±1）℃，相對濕度75%±5%。在16 h 光照、8 h黑暗的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待卵粒孵化后用新鮮玉米葉飼養(yǎng)至3齡，作為試蟲。

1.1.2 供試試劑 石油醚、乙酸乙酯、甲醇和乙醇均購自云南利妍科技有限公司，吐溫80購自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，4- 喹啉甲醛（≥97%）、十三烷（≥98%）、石竹烯氧化物（≥90%）、亞油酸乙酯（≥98%）和亞麻酸乙酯（≥95%）均購自上海麥克林生化科技股份有限公司，除蟲菊酯（≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 供試儀器與設(shè)備 KQ5000-DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琪實(shí)驗(yàn)儀器公司；RGX-250B 人工氣候培養(yǎng)箱，上海坤天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；薄層層析硅膠板（GF254）和200～300目柱層析硅膠，青島海洋化工廠；1 mL玻璃比色皿，宜興奧銳拓光學(xué)儀器有限公司；Agilent 7890A-5975C氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent科技有限公司；OCE-Y30組織研磨器，天根生化科技有限公司；Thermo-17R 高速冷凍離心機(jī)，南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CP224C 分析電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柱層析分離及乳液的配制 采用薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）法確定洗脫體系。濕法裝柱，稱取一定量硅膠于燒杯中，加入適量石油醚攪拌至無氣泡后加入玻璃柱，待液面達(dá)到一定高度時(shí)，打開玻璃柱活塞，放出多余石油醚。干法上樣，將樣品用不同極性的溶劑溶解，加入硅膠，加入量與樣品的比例為1∶1，攪拌干燥成粉末狀，加入色譜柱，依次用石油醚、石油醚∶氯仿（50∶1、10∶1、5∶1、1∶1）、氯仿、氯仿∶乙酸乙酯（20∶1、1∶1）、乙酸乙酯、甲醇洗脫體系進(jìn)行洗脫。洗脫液經(jīng)TLC檢測，合并相同餾分，將各餾分減壓濃縮稱重。將餾分及十三烷、4-喹啉甲醛、石竹烯氧化物、亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯均用0.5% 吐溫80乳液配成不同水平的乳液備用，0.5%吐溫80乳液作陰性對照，除蟲菊酯作陽性對照。

1.2.2 觸殺活性測定 采用浸蟲法[18]將蟲態(tài)一致的3齡粘蟲放入配制好的不同乳液中浸漬5 s，吸取多余藥液。用毛筆將粘蟲分別挑入帶蓋圓柱形塑料盒中，每盒1只。加入2片新鮮玉米葉片飼養(yǎng)，每組10只試蟲，重復(fù)5次。置于人工氣候培養(yǎng)箱，溫度（27±1）℃，相對濕度75%±5%，16 h光照、8 h黑暗培養(yǎng)，于處理第1、3、5、7 天時(shí)檢查粘蟲的存活情況。用毛筆輕觸蟲體無反應(yīng)即為死亡。用公式（1）和（2）計(jì)算死亡率及校正死亡率。

1.2.3 GC-MS分析 將餾分8用正己烷溶解，進(jìn)行GCMS測定。色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.3 mm×0.3 μm）。升溫程序：100 ℃保持2 min，以4 ℃·min-1 升至250 ℃，保持10 min。載氣為氦氣，流速1.2 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱前壓100 kPa，進(jìn)樣量0.2 μL，分流比100∶1。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI離子源；電子能量70 eV，氣質(zhì)接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；電子倍增器電壓為1 894 V。采用wiley7n.l標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性。通過面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對含量。

1.2.4 掃描電鏡樣品制備及觀察 分別取對照組和亞麻酸乙酯組處理7 d的粘蟲，去其首尾，取中間約5 mm2左右的粘蟲表皮，用2.5%戊二醛固定液固定樣本，4 ℃放置過夜；然后用0.1 mol·L-1pH7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min；用30%、50%、70%、80%、90% 和95% 的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，每次15 min；再用100%的乙醇處理2次，每次20 min；用乙醇與醋酸異戊酯的混合液（體積比為1∶1）處理樣品30 min；再用醋酸異戊酯處理樣品，放置過夜；CO2臨界點(diǎn)干燥，干燥溫度為38 ℃，壓力為85個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。將干燥好的樣品粘臺(tái)，噴金，置于掃描電鏡下觀察并拍照。

1.2.5 粘蟲幼蟲體內(nèi)靶標(biāo)酶和代謝酶活性測定 采用亞麻酸乙酯半數(shù)致死濃度（LC50）處理粘蟲3齡幼蟲，處理方法同1.2.2。每個(gè)處理20只幼蟲，重復(fù)5次，以0.5%吐溫80乳液為對照組。分別于處理第1、3、5、7 天時(shí)取粘蟲3齡幼蟲，液氮研磨后稱取0.1 g，加入1.0 mL提取液；冰浴勻漿1 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取上清液，置于冰上作為待測酶液。參照各自試劑盒說明書測定乙酰膽堿酯酶（acetylcholin esterase，AChE，nmol·min-1·g-1 FW）、羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE， ΔOD450·min-1·g-1 FW） 、Na+-K+-ATPase（μmol·h-1·g-1 FW）和過氧化氫酶（catalase，CAT，μmol·min-1·g-1 FW）4 種酶活性。根據(jù)公式（3）～（8）計(jì)算酶活力。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿各餾分對粘蟲的觸殺活性

由表1可知，洗脫液經(jīng)TLC檢測并合并相同餾分后，共得到27個(gè)餾分。用5 mg·mL-1 餾分處理1 d，其中餾分8和餾分9的校正死亡率分別為100.0%和66.0%；處理7 d時(shí)，餾分5、餾分6、餾分7、餾分8和餾分9的校正死亡率均超過50.0%，而其余22個(gè)餾分的校正死亡率均低于50.0%。由此表明，餾分8的殺蟲效果最好，與其他餾分存在顯著差異。因此，選擇餾分8進(jìn)行GCMS分析。

2.2 餾分8 的化學(xué)成分分析

由表2可知，從黃花蒿石油醚萃取物餾分8中共檢測出8 種化合物，其中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.0%的有十三烷（7.9%）、4-喹啉甲醛（72.8%）、石竹烯氧化物（3.6%）、亞油酸乙酯（2.4%）和亞麻酸乙酯（3.1%）。主要化合物含量占總量的89.7%。

2.3 餾分8 中5 種主要化合物的殺蟲活性

由表3可知，十三烷、4-喹啉甲醛、石竹烯氧化物、亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯對粘蟲3齡幼蟲均具有殺蟲活性，其中亞麻酸乙酯的殺蟲活性顯著優(yōu)于相同處理時(shí)間下其他4種化合物，且隨著處理時(shí)間的延長，殺蟲活性增強(qiáng)。雙因素方差分析結(jié)果表明，亞麻酸乙酯對粘蟲的處理劑量（F=393.2，Plt;0.001）和處理時(shí)間（F=81.8，Plt;0.001）均顯著影響粘蟲3齡幼蟲的校正死亡率。因此，選擇亞麻酸乙酯進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.4 亞麻酸乙酯處理下粘蟲的掃描電鏡觀察結(jié)果

1.5 mg·mL-1亞麻酸乙酯處理粘蟲幼蟲7 d，對粘蟲幼蟲表皮蠟質(zhì)層的影響如圖1所示。對照組幼蟲的蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)排列緊密，呈魚鱗狀，蠟花間空隙狹?。欢鴣喡樗嵋阴ヌ幚斫M幼蟲的蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)排列較為疏松，蠟花間空隙增大，且蠟質(zhì)層顆粒明顯消失，蠟質(zhì)層發(fā)生明顯改變。

2.5 亞麻酸乙酯對粘蟲幼蟲體內(nèi)靶標(biāo)酶和代謝酶活性的影響

亞麻酸乙酯處理對粘蟲幼蟲體內(nèi)靶標(biāo)酶和代謝酶活性的影響如圖2所示。處理組的AChE活性在處理第1 天時(shí)顯著高于對照，為對照的3.2倍，表現(xiàn)為激活作用；在第3、5、7天時(shí)均顯著低于對照，分別降低40.4%、53.9%、61.7%，表現(xiàn)為抑制作用。處理組的CarE活性在第1、3天時(shí)均高于對照，表現(xiàn)為激活作用，其中第1天顯著高于對照，為對照的2.4倍；在第5、7天時(shí)均顯著低于對照，分別降低18.1%、39.2%。處理組的Na+-K+-ATPase活性在第1天時(shí)與對照差異不顯著；在第3、5、7天時(shí)均顯著低于對照，分別降低14.2%、71.7%、82.6%。處理組的CAT活性在第1天時(shí)顯著低于對照，較對照降低46.0%；在第3、5、7天時(shí)均顯著高于對照，其中第7天時(shí)為對照的5.0倍。

3 討論

本研究表明，亞麻酸乙酯對粘蟲在第1、3、5、7 天時(shí)的LC50 分別為4.6、3.1、2.0 和1.5 mg·mL-1。研究表明，紅蓼（Polygonum orientale）種子和莖稈的乙酸乙酯萃取物24 h時(shí)對粘蟲5齡幼蟲的觸殺活性高于其乙醇和甲醇提取物，LC50分別為8.7和29.1 mg·mL-1[18]。Zhu 等[19]合成了69 種4-丙炔氧基苯磺酰胺衍生物，其中含氨基酸酯基的化合物對粘蟲具有較好的殺蟲活性，D18、D19和D16處理粘蟲48 h時(shí)的LC50分別為4.28、2.96和2.38 mg·mL-1。從透骨草中分離得到4種化合物，其中T1、T2和T4化合物處理24 h時(shí)對粘蟲3齡幼蟲無殺蟲活性，而T3 化合物對粘蟲具有觸殺活性，LC50 為1.1 mg·mL-1[20]。由此表明，亞麻酸乙酯對粘蟲的殺蟲活性不及透骨草中分離得到的T3化合物，與含氨基酸酯基的D18、D19和D16化合物的殺蟲活性接近，優(yōu)于紅蓼提取物。

AChE 是神經(jīng)傳導(dǎo)的關(guān)鍵性酶，可催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿快速水解，終止膽堿能神經(jīng)信號(hào)的傳遞[21]。亞麻酸乙酯處理粘蟲1 d，蟲體內(nèi)的AChE 活性顯著高于對照，說明處理前期粘蟲通過機(jī)體正調(diào)節(jié)提高AChE活性，以達(dá)到降解或阻斷亞麻酸乙酯，進(jìn)而降低或削弱其毒害作用；處理3、5和7 d時(shí)，AChE被抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿不斷累積，與突觸后膜受體結(jié)合，造成鈉離子通道開放時(shí)間延長，膜內(nèi)的鈉離子數(shù)量增加，使昆蟲表現(xiàn)出過度興奮、運(yùn)動(dòng)失調(diào)，痙攣死亡[22]。CarE是昆蟲體內(nèi)重要的解毒代謝酶，主要參與有毒物質(zhì)的代謝解毒過程，可通過水解酯類化合物的酯鍵降解酯類化合物，也可與親酯類化合物結(jié)合鈍化其毒性，CarE酶活性的高低是害蟲產(chǎn)生抗藥性及中毒死亡的重要原因[23]。亞麻酸乙酯處理1和3 d時(shí)，粘蟲幼蟲體內(nèi)的CarE活性顯著高于對照，說明CarE參與亞麻酸乙酯代謝，導(dǎo)致其活性增強(qiáng)，以維持幼蟲生命活動(dòng)的正常進(jìn)行；處理5、7 d時(shí)，CarE活性低于對照，表明處理粘蟲幼蟲的解毒代謝能力下降，最終中毒死亡[24]。Na+-K+-ATPase能影響細(xì)胞膜上離子通道的開放或關(guān)閉，具有維持膜內(nèi)外離子平衡的重要作用，其活性過低或過高均會(huì)引起膜內(nèi)外電位和滲透壓平衡的破壞，導(dǎo)致電位信號(hào)傳導(dǎo)和代謝紊亂[25]。亞麻酸乙酯處理粘蟲體內(nèi)的Na+-K+-ATPase活性顯著低于對照，從而引起細(xì)胞膜特別是神經(jīng)細(xì)胞膜對離子的通透性降低，細(xì)胞膜內(nèi)Na+外流受到抑制，含量升高，造成粘蟲神經(jīng)膜處于持續(xù)興奮狀態(tài)，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，最終導(dǎo)致粘蟲死亡[26]。CAT的主要作用是催化H2O2分解成O2和H2O，減輕活性氧自由基對昆蟲機(jī)體的損傷[27]。亞麻酸乙酯處理1 d時(shí)，粘蟲3齡幼蟲的CAT活性顯著低于對照，可能是由于游離超氧自由基的累積導(dǎo)致CAT活性受到抑制；處理3、5、7 d時(shí)，CAT活性顯著高于對照，可能是亞麻酸乙酯擾亂了粘蟲體內(nèi)活性氧平衡，致使機(jī)體內(nèi)活性氧水平升高，從而激活CAT活性，以清除活性氧自由基，減輕對蟲體的傷害。亞麻酸乙酯對粘蟲的殺蟲分子機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。

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