摘要：為了探究馬先蒿屬（Pedicularis）植物的關(guān)鍵形態(tài)特征，為其辨別與鑒定提供參考。本研究采用祖先性狀演化推測(cè)Pedicularis最保守的形態(tài)特征，并基于10種馬先蒿屬植物完整葉綠體基因組，探討馬先蒿屬植物形態(tài)的變異原因。結(jié)果表明基于花序類(lèi)型性狀演化分析和系統(tǒng)發(fā)育分析支持馬先蒿屬隸屬于列當(dāng)科（Orobanchaceae）的分類(lèi)地位。葉綠體基因組變異分析找到Pi值較高的7個(gè)變異基因和6個(gè)變異區(qū)域，且多分布在大單拷貝區(qū)（LSC）和小單拷貝區(qū)（SSC）區(qū)。反向重復(fù)區(qū)（IRs）的rps19和ycf1基因跨越了區(qū)域邊界造成IRs基因丟失。因此，總狀花序是馬先蒿屬最為保守的形態(tài)特征，可作為其分類(lèi)依據(jù)。而IRs的擴(kuò)張導(dǎo)致IRs基因丟失的同時(shí)提高LSC和SSC的多樣性，導(dǎo)致二者為高變異區(qū)，可能是馬先蒿屬植物形態(tài)變異的原因之一。這些結(jié)果將促進(jìn)馬先蒿屬植物系統(tǒng)分類(lèi)和種間進(jìn)化的研究。

關(guān)鍵詞：馬先蒿屬；葉綠體基因組；系統(tǒng)發(fā)育；祖先形態(tài)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q732""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）07-2039-15

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.005

引用格式：

王" 濤， 徐成體， 唐楚煜，等.基于祖先性狀演化和葉綠體基因組的馬先蒿形態(tài)特征分析［J］.草地學(xué)報(bào)，2024，32（7）：2039-2053

WANG Tao， XU Cheng-ti， TANG Chu-yu，et al.Morphological Analysis of Pedicularis Based on Ancestral Character Evolution and Chloroplast Genome［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2039-2053

收稿日期：2023-12-12；修回日期：2024-03-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（32360349）資助

作者簡(jiǎn)介：

王濤（1995-），男，漢族，安徽淮北人，博士研究生，主要從事草學(xué)研究，E-mail：13085500761@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：yulingli2000@163.com

Morphological Analysis of Pedicularis Based on Ancestral Character

Evolution and Chloroplast Genome

WANG Tao， XU Cheng-ti， TANG Chu-yu， CAO Zheng-fei， XIAO Meng-jun，

HE Min， LI Xiu-zhang， LI Yu-ling*

（Key Laboratory of the Alpine Grassland Ecology in the Three Rivers Region， Ministry of Education，

Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：To explore the key morphological characteristics of Pedicularis plants and to provide reference for their identification，the most conserved morphological characteristics of Pedicularis were speculated by the evolution of ancestral traits，and the reasons for the morphological variation of Pedicularis were discussed based on the complete chloroplast genomes of 10 species of Pedicularis in this study. The results showed that the evolution analysis and phylogenetic analysis based on inflorescence type traits supported the taxonomic status of Pedicularis belonging to Orobanchaceae. The chloroplast genome variation analysis found 7 variable genes and 6 variable regions with high Pi values，and most of them were distributed in the LSC and SSC. The rps19 and ycf1 genes in the IRs crossed the region boundary and caused the loss of IRs genes. Therefore，raceme is the most conserved morphological feature of Pedicularis，which can be used as the basis for its classification. The expansion of IRs leads to the loss of IRs genes and the diversity of LSC and SSC，which leads to the high variation area of LSC and SSC，which may be one of the reasons for the morphological variation of Pedicularis. These results will promote the study of systematic classification and interspecific evolution of Pedicularis.

Key words：Pedicularis;Chloroplast genome;Phylogeny；Ancestral morphology

馬先蒿屬植物由于其自然生殖隔離和自身快速輻射分化繁衍方式的雙重影響，該屬植物分化強(qiáng)烈、形態(tài)變異復(fù)雜，且棲息地和物種起源中心較多且差異較大［1］，導(dǎo)致該屬植物資源豐富，種類(lèi)繁多，雖然為其遺傳育種提供了極豐富的種質(zhì)資源，但也限制了其的分類(lèi)和系統(tǒng)學(xué)研究。全球約有568個(gè)已確認(rèn)的種，335個(gè)同義種和450個(gè)未被確定的種，亞洲具有最高的生物多樣性，約有350種，大部分分布在中國(guó)及其周邊國(guó)家，其中271種為特有種，83種分布于印度，歐洲國(guó)家僅約有70種［3］。

基于葉綠體基因組證據(jù)闡明物種的系統(tǒng)發(fā)育地位，重建物種類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育是分類(lèi)學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究的永恒主題之一，葉綠體全基因組數(shù)據(jù)在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。大多數(shù)高等植物葉綠體基因組呈四聚體結(jié)構(gòu)，由一個(gè)大單拷貝區(qū)域（Large single copy region，LSC）、一個(gè)小單拷貝區(qū)域（Small single copy region，SSC）和一對(duì)反向重復(fù)區(qū)域（Inverted repeat，IRs）組成［5］。植物葉綠體內(nèi)擁有獨(dú)立的基因組合遺傳系統(tǒng)即單系遺傳，且具有序列短?。?20～160 kb）、基因結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定、含有保守序列區(qū)域（matK、rbcL、trnH-psbA和trnL-F）的優(yōu)點(diǎn)［6-7］，在植物系統(tǒng)學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。因此，一般認(rèn)為葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和含量相對(duì)穩(wěn)定和保守［8］，但研究發(fā)現(xiàn)馬先蒿屬葉綠體基因組發(fā)生了強(qiáng)烈的IR擴(kuò)增導(dǎo)致序列區(qū)域性的丟失和轉(zhuǎn)移［9］。在輪葉馬先蒿和碎米蕨葉馬先蒿的葉綠體基因組中，除了ndhB基因之外，幾乎所有的ndh基因都丟失了，rps16基因也發(fā)生了丟失現(xiàn)象但僅在輪葉馬先蒿中丟失［10-11］。在過(guò)去的5年中，在阿拉善馬先蒿中觀察到由于ndh基因缺失導(dǎo)致葉綠體基因組長(zhǎng)度減少的現(xiàn)象［12］。相似的報(bào)道均指出馬先蒿屬植物的葉綠體基因組異于傳統(tǒng)被子植物的葉綠體基因組表現(xiàn)出高度的變異性［13］。這意味著馬先蒿屬植物形態(tài)特征的變異可能與葉綠體基因組存在某種關(guān)聯(lián)。

馬先蒿屬植物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，形態(tài)特征受棲息地氣候特征的影響發(fā)生了劇烈改變，相對(duì)的其分類(lèi)地位也經(jīng)歷了多次改變。傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)依據(jù)該屬植物模式種馬先蒿在形態(tài)學(xué)上的特點(diǎn)（葉呈互生、對(duì)生或輪生，全緣或羽狀分裂頂生的穗狀花序或總狀花序；花萼管狀，花藥包藏在盔瓣中，兩兩相對(duì)，基部有時(shí)具刺尖［14］將其與毛麝香屬、黑草屬和火焰草屬等隸屬于玄參科［15］，并在該屬下劃分無(wú)枝群、輪枝群和馬先蒿群等13個(gè)群［16］。而，隨著該屬更多新種和亞種葉綠體基因組證據(jù)的相繼報(bào)道，借助于單核苷酸多肽、短串聯(lián)重復(fù)序列和遺傳多態(tài)性分析進(jìn)行個(gè)體識(shí)別鑒定，學(xué)者們認(rèn)為馬先蒿屬應(yīng)隸屬于列當(dāng)科［17］，也是目前學(xué)者們廣泛采用的分類(lèi)地位。但可以預(yù)見(jiàn)的是已有的形態(tài)學(xué)分類(lèi)法和分子生物學(xué)分類(lèi)法對(duì)于馬先蒿屬的分類(lèi)出現(xiàn)分歧，并且學(xué)者們并未對(duì)其形態(tài)做出關(guān)鍵描述，這導(dǎo)致馬先蒿屬植物的形態(tài)鑒定成為野外工作的難點(diǎn)。

因此，已有的形態(tài)學(xué)特征已經(jīng)不能準(zhǔn)確的鑒定馬先蒿屬植物的分類(lèi)，篩選該屬新的形態(tài)學(xué)特征篩選迫在眉睫，也是該屬植物的分類(lèi)和鑒定的急切需要。本研究采用祖先性狀演替分析了該屬保守的形態(tài)學(xué)特征，并與已報(bào)道的馬先蒿屬植物葉綠體全基因組進(jìn)行對(duì)比分析，探究該屬植物形態(tài)特征改變的原因。

1" 材料與方法

1.1" 葉綠體基因組獲取

基于青海大學(xué)青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院冬蟲(chóng)夏草研究室已經(jīng)組裝完成的中國(guó)馬先蒿和甘肅馬先蒿序列（已投稿），并從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載相關(guān)物種序列得到全部的葉綠體基因組數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析（表1）。

1.2" 祖先性狀演化和系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)中國(guó)植物志Flora of China （FOC）（http：//www.iplant.cn/info/Oryza%20 glaberrima？t=foc）的物種描述，對(duì)表1中68種植物形態(tài)性狀進(jìn)行分類(lèi)。選取具有特殊分類(lèi)意義的4種形態(tài)學(xué)性狀，包括花序類(lèi)型、花序著生位置和花葉類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。利用性狀演化工具M(jìn)esquite v3.61中貝葉斯法快速構(gòu)建祖先性狀演化樹(shù)，從而推斷馬先蒿屬祖先性狀及演化式樣［18］。從NCBI上收集馬先蒿屬、玄參科和列當(dāng)科物種，以稻屬為外群，共68個(gè)物種進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。將以上68個(gè)物種葉綠體基因組數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mega軟件進(jìn)行序列對(duì)比［19］，完成后計(jì)算最佳擬合核苷酸模型并采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，參數(shù)設(shè)置為Models = GTR+GAMMA，Bootstrap=1 000獲得系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支的靴帶支持率（Bootstrap values，BS）和種間支持率。

1.3" 葉綠體基因組變異性分析

使用MAFFT軟件［20］對(duì)相應(yīng)的基因組序列進(jìn)行對(duì)齊。利用DnaSP v6.0［6］軟件進(jìn)行窗口長(zhǎng)500 bp、步長(zhǎng) 120 bp的滑動(dòng)窗口分析，計(jì)算10個(gè)馬先蒿屬植物葉綠體基因組的核苷酸多態(tài)性（Pi）。使用mVISTA程序［21］，在ShuffleLAGAN模式下對(duì)10個(gè)馬先蒿屬植物的葉綠體基因組進(jìn)行序列相似性分析并可視化。中國(guó)馬先蒿被選為參考基因組。使用Mauve軟件［22］對(duì)馬先蒿屬植物序列和基因進(jìn)行共線性分析，并進(jìn)行可視化。使用MISA軟件，分別檢測(cè)所有物種葉綠體基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列參數(shù)設(shè)置均為單核苷酸單元、二核核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)分別設(shè)置為10，5，4，3，3和3，并分析SSRs的類(lèi)型、數(shù)量和分布模式。

1.4" 葉綠體全基因組比較和IR/SSC邊界收縮和擴(kuò)張分析

葉綠體基因組變化重要來(lái)源之一就是IR/SC邊界變化［24］，利用mVISTA軟件在LAGAN模型下對(duì)馬先蒿屬植物葉綠體全基因組進(jìn)行比較分析［25］。利用IRscope在線軟件（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/） 繪制10個(gè)植物種間葉綠體基因組的IR/SC邊界對(duì)比圖，分析馬先蒿屬植物IR/SC，IRs區(qū)收縮與擴(kuò)張?zhí)卣鳎?6］。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 形態(tài)學(xué)祖先性狀演化分析

2.1.1" 花序類(lèi)型" 花序類(lèi)型的形態(tài)學(xué)祖先性狀演化分析指示（圖1），馬先蒿屬植物祖先狀態(tài)的花序類(lèi)型最可能為總狀花序（55.58%）?？偁罨ㄐ?yàn)榱挟?dāng)科植物的主要花序類(lèi)型，聚傘花序則為玄參科植物的主要花序類(lèi)型。在選擇的68種植物中，研究發(fā)現(xiàn)從它們共同的祖先開(kāi)始，花序分化為聚傘花序的玄參科分支1和總狀花序的列當(dāng)科分支2。在分支2內(nèi)花序類(lèi)型至少經(jīng)過(guò)節(jié)點(diǎn)1、節(jié)點(diǎn)2和節(jié)點(diǎn)3，3次分化過(guò)程。節(jié)點(diǎn)1和節(jié)點(diǎn)2穩(wěn)定遺傳了祖先的總狀花序并未產(chǎn)生分化。然而節(jié)點(diǎn)3的馬先蒿屬植物在遺傳祖先總狀花序的同時(shí)也分化出穗狀、亞頭狀、簇生狀、穗狀或亞頭狀和穗狀或總狀5種花序類(lèi)型，其中仍以總狀花序（58.83%）最多為該屬穩(wěn)定遺傳的性狀。這表明馬先蒿屬植物的花序類(lèi)型在種間差異顯著分化強(qiáng)烈但總體上仍為總狀花序。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，列當(dāng)科分支的祖先花序類(lèi)型為總狀花序與馬先蒿屬植物的花序類(lèi)型更為相似。因此，總狀花序類(lèi)型的形態(tài)學(xué)祖先性狀演化分析結(jié)果符合馬先蒿屬植物隸屬于列當(dāng)科的現(xiàn)代分子生物學(xué)觀點(diǎn)，可以作為馬先蒿屬植物形態(tài)分類(lèi)的形態(tài)特征之一。

2.1.2" 花序位置" 從花序位置看（圖2），馬先蒿屬植物祖先狀態(tài)的花序位置最可能為腋生（62.40%）。其祖先的進(jìn)化過(guò)程指示，花序位置主要分化為分支1的玄參科和分支2的列當(dāng)科，且玄參科和玄參科均以腋生為主。在列當(dāng)科分支中，至少有節(jié)點(diǎn)1和節(jié)點(diǎn)2，2次明顯的分化過(guò)程。在節(jié)點(diǎn)1分化出花序位置頂生或腋生，在節(jié)點(diǎn)2分化出花序位置頂生。這表明馬先蒿屬植物花序位置為腋生與列當(dāng)科或玄參科植物均較為相似。因此本研究認(rèn)為隨著馬先蒿屬植物不斷的變異與進(jìn)化，花序位置的形態(tài)學(xué)特征已不能將馬先蒿屬植物有效的分類(lèi)。

2.1.3" 花葉類(lèi)型" 分析花葉類(lèi)型（圖3），顯而易見(jiàn)的是馬先蒿屬植物祖先狀態(tài)的花葉類(lèi)型最可能為互生（65.28%）。其祖先的進(jìn)化過(guò)程指示，花葉類(lèi)型主要分化為分支1的玄參科和分支2的列當(dāng)科，且均以互生為主。在列當(dāng)科分支中，至少有節(jié)點(diǎn)1、節(jié)點(diǎn)2和節(jié)點(diǎn)3，3次明顯的分化過(guò)程。在節(jié)點(diǎn)1分化出對(duì)生的花葉類(lèi)型，且這種花葉類(lèi)型被馬先蒿屬植物遺傳得到。在節(jié)點(diǎn)3的進(jìn)化過(guò)程中，輪葉馬先蒿又分化出輪生的花葉類(lèi)型，這也是馬先蒿屬植物分化強(qiáng)烈的形態(tài)學(xué)特征之一。因此，馬先蒿屬植物最可能互生花葉類(lèi)型，與列當(dāng)科或玄參科植物無(wú)顯著差異。基于此，研究認(rèn)為花葉類(lèi)型已不能將馬先蒿屬植物從玄參科和列當(dāng)科中完成鑒定，不適用于馬先蒿屬的形態(tài)學(xué)特征分類(lèi)。

2.1.4" 苞片形態(tài)" 苞片形態(tài)演化歷史的追溯顯示（圖4），該特征的祖先狀態(tài)并不明顯，支持率最高的為卵形至披針形（34.30%），其次為卵形至長(zhǎng)圓形（28.92%）和披針形（20.53%），剩余 2種均小于10%。在選擇的17種馬先蒿屬植物中，29.4%的植物苞片呈線形，35.30%的植物苞片呈卵形至披針形，35.30%的植物苞片呈卵形至長(zhǎng)圓形。而處于分支1的玄參科植物卵形至披針形苞片，分支2的列當(dāng)科更多的傾向于披針形苞片。此時(shí)，馬先蒿屬植物與玄參科的相似度較列當(dāng)科更高。因此，苞片形態(tài)的祖先演化分析，其結(jié)果更支持馬先蒿屬隸屬于玄參科的分類(lèi)結(jié)果?？傮w分析，苞片類(lèi)型在種間分化變異顯著，其祖先特征難以追溯，不是馬先蒿屬有效的形態(tài)學(xué)分類(lèi)依據(jù)。

2.2" 系統(tǒng)基因組學(xué)分析

基于最大似然法的系統(tǒng)發(fā)育分析作者發(fā)現(xiàn)（圖5），17個(gè)馬先蒿屬物種分為 8支。從上往下，第一支、第五支和第六支僅由一種物種組成，分別為：蘚生馬先蒿和甘肅馬先蒿；第二支由東俄洛馬先蒿、粗野馬先蒿和山西馬先蒿組成；第三支由歐亞馬先蒿、中國(guó)馬先蒿、黑馬先蒿和頭花馬先蒿組成；第四支由全裂馬先蒿和返顧馬先蒿組成；第六支由阿拉善馬先蒿和長(zhǎng)花馬先蒿組成；第八支由輪葉馬先蒿組成。第七支的碎米蕨葉馬先蒿最為特殊，它已脫離馬先蒿屬，可能是更為古老的物種。因此，本研究認(rèn)為甘肅馬先蒿和中國(guó)馬先蒿隸屬于馬先蒿屬并分別與P. hallaisanensis、黑馬先蒿親緣關(guān)系最近呈姊妹關(guān)系。其次，系統(tǒng)基因組學(xué)分析支持總狀花序類(lèi)型為馬先蒿屬植物祖先性狀的結(jié)論。

2.3" 馬先蒿屬植物葉綠體基因組變異分析

2.3.1" 馬先蒿屬植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征" 中國(guó)馬先蒿葉綠體全基因序列擁有120個(gè)基因，包括75個(gè)蛋白編碼基因（Protein-coding genes，PCGs）、37個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（Transfer RNA，tRNA）基因和8個(gè)核糖體RNA（Ribosomal RNA，rRNA）基因（表2）。LSC區(qū)包含60個(gè)PCGs，22個(gè)tRNA，SSC區(qū)包含5個(gè)PCGs和1個(gè)tRNA，IRs區(qū)包含10個(gè)PCGs，14個(gè)tRNA和所有的rRNA基因。甘肅馬先蒿葉綠體全基因組編碼116個(gè)基因，包括72 個(gè)蛋白編碼基因、36個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因（表2）。LSC區(qū)包含58個(gè)PCGs，21個(gè)tRNA，SSC區(qū)包含4個(gè)PCGs和1個(gè)tRNA，IRs區(qū)包含10個(gè)PCGs，14個(gè)tRNA和所有的rRNA基因。目前已發(fā)表的馬先蒿屬植物葉綠體基因組編碼的基因數(shù)量范圍為102～109個(gè)，PCGs約為69～74個(gè)，tRNA基因約為30個(gè)，rRNA基因均為8個(gè)。不難發(fā)現(xiàn)，甘肅馬先蒿和中國(guó)馬先蒿葉綠體基因組在結(jié)構(gòu)組織、基因含量和基因排序上與其它馬先蒿屬植物基本相似，并未發(fā)現(xiàn)明顯的基因重排或倒置現(xiàn)象。

甘肅馬先蒿和中國(guó)馬先蒿葉綠體全基因組中GC含量分別為38.46%，38.51%。LSC區(qū)域中GC含量分別為36.43%和36.49%，SSC區(qū)域中GC含量分別為32.25%和32.60%，IRs區(qū)域中GC含量分別為43.53%和43.33%（表2）。然而，甘肅馬先蒿和中國(guó)馬先蒿葉綠體全基因和SSC區(qū)的GC偏倚普遍低于同屬其它物種，SSC區(qū)bp長(zhǎng)度也更短。這表明在自然進(jìn)化過(guò)程中二者葉綠體全基因組在堿基替換上具有GC偏倚性即AT堿基傾向于被GC堿基替換，且這種GC偏倚可能與SSC區(qū)域的GC偏倚有關(guān)。對(duì)17種馬先蒿屬的對(duì)比分析，研究發(fā)現(xiàn)甘肅馬先蒿和中國(guó)馬先蒿丟失ccsA，ycf2兩個(gè)PCGs基因（圖6A），同時(shí)編碼更多的tRNA基因（trnE-UUC，trnM-CAU和trnS-CGA）（圖6B），而ndhD，ndhJ，ndhH，trnM-CAU和trnI-CAU等基因在物種間表現(xiàn)出不同程度的缺失，這暗示基因丟失在馬先蒿屬植物葉綠體基因組進(jìn)化過(guò)程中似乎是一種普遍現(xiàn)象。

2.3.2" 重復(fù)結(jié)構(gòu)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析（Simple repeat sequence，SSR）" 在馬先蒿屬植物葉綠體基因組中，單核苷酸以A（Adenosine）和T（Thymine）含量最豐富；同時(shí)也導(dǎo)致其具有最豐富的AT和TA雙核苷酸重復(fù)（圖7A）。在甘肅馬先蒿和中國(guó)馬先蒿的葉綠體基因組中，分別找到40和36個(gè)SSRs，略低于馬先蒿屬其它植物（37～55個(gè)SSRs），且大部分馬先蒿屬植物都不具備CTAGAA、TAAGTA和TACTTA六核苷酸重復(fù)（圖7A），只有黑馬先蒿葉綠體基因組具有這一重復(fù)類(lèi)型。這表明在馬先蒿屬植物的進(jìn)化過(guò)程中，丟失長(zhǎng)核苷酸重復(fù)序列是一種普遍現(xiàn)象。

此外，研究發(fā)現(xiàn)馬先蒿屬植物的SSRs在葉綠體基因組不同區(qū)域的分布喜好差異較大，多分布在SSC和LSC區(qū)（圖7B）。比較馬先蒿屬17種植物SSRs類(lèi)型和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)均具有以下4種（單、雙、三和四核苷酸）重復(fù)類(lèi)型，但多核苷酸重復(fù)單元類(lèi)型和含量在不同物種間差異較大（圖7A和7C）。如：碎米蕨葉馬先蒿具有最豐富的四核苷酸含量（11個(gè)）和多樣性（9種：TTCT，TTTA，TTTC，TAAA，TAAT，ATAG，AAAC，AGAA和GAAA），但它的三核苷酸重復(fù)數(shù)量較少。這表明在馬先蒿屬植物進(jìn)化過(guò)程中，個(gè)體SSRs豐富度和種類(lèi)的改變較大，且LSC和SSC區(qū)為高突變區(qū)。

2.3.3" IR收縮和膨脹" 通過(guò)對(duì)馬先蒿屬10種植物葉綠體基因組的比較分析，其中P. ishidoyana的IR區(qū)最長(zhǎng)為35 263 bp，黑馬先蒿最短為24 302 bp，長(zhǎng)度最大差異達(dá)到10 961 bp，較黑馬先蒿增加了45.1%（表2），很顯然馬先蒿屬植物葉綠體基因組IR存在顯著擴(kuò)張現(xiàn)象。其次，rps19基因穿過(guò)LSC/IRb邊界，ycf1基因由于其在IR區(qū)的反向重復(fù)重復(fù)跨越了IRb/SSC和SSC/IRa邊界，trnH則跨越了IRa/LSC邊界。

在馬先蒿屬植物中，rps19基因序列大部分位于LSC區(qū)內(nèi)，7～15 bp延伸至IRb區(qū)內(nèi)，但碎米蕨葉馬先蒿僅34 bp（12.18%）的rps19基因仍留在LSC區(qū)內(nèi)，245 bp（87.82%）的基因延伸至IRb區(qū)內(nèi)，這表明碎米蕨葉馬先蒿IR區(qū)的擴(kuò)張更加劇烈，近乎將整個(gè)rps19基因吞并。這一結(jié)論在IRa/LSC邊界得到了驗(yàn)證，僅碎米蕨葉馬先蒿的IRa區(qū)包含rps19基因，且大部分基因分布在IRa中，僅有3 bp仍留在LSC區(qū)中（圖8）。trnH基因受IR區(qū)擴(kuò)張的影響，也有不同長(zhǎng)度（0～20 bp）的基因序列跨越了IRa/LSC邊界。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是ycf1基因在跨越SSC/IRb邊界時(shí)，僅有3～106 bp仍留在SSC區(qū)內(nèi)，大部分基因在IRb區(qū)內(nèi)；相反的是在跨越SSC/IRa邊界時(shí)大部分基因處于SSC區(qū)內(nèi)，458～1 149 bp的ycfl基因序列延伸到IRa區(qū)。這說(shuō)明受IR區(qū)擴(kuò)張的影響ycf1基因?qū)SC/IRb和SSC/IRa邊界的跨越程度不同，導(dǎo)致其分裂成兩段基因分屬于不同的區(qū)域。因此，馬先蒿屬植物葉綠體基因組中IR區(qū)的擴(kuò)張對(duì)rps19和ycf1基因在不同植物上表現(xiàn)不同，促使馬先蒿屬植物葉綠體基因組表現(xiàn)出多樣性和高變異性。

2.3.4" 葉綠體基因組核苷酸多樣性和序列相似性分析" 為了衡量馬先蒿屬種群的多態(tài)性，分析物種和相關(guān)物種的遺傳變異，以確定進(jìn)化關(guān)系。本文對(duì)包含甘肅馬先蒿和中國(guó)馬先蒿等10個(gè)馬先蒿屬植物的葉綠體基因組序列多樣性進(jìn)行分析和比對(duì)，并以核苷酸變異性值（Pi）進(jìn)行表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：10個(gè)馬先蒿屬植物的Pi從0增加到0.156 7（圖9），這表明馬先蒿屬植物核苷酸替換程度較大。而作者檢測(cè)到的4個(gè)高變異區(qū)域（Pigt;0.1）分別為：ndhJ-trnV，ycf4-cemA，ndhE-nhdG和rpl32-trnL和1個(gè)高變異基因（ndhH）均分布在LSC和SSC區(qū)，IR區(qū)Pi值最低，LSC較高，SSC區(qū)最高。為了比較核苷酸序列的變異情況，本研究以中國(guó)馬先蒿為參考，分析了葉綠體基因組序列的變異程度。其中，rpl22，rps19，rpl12，ycf1，trnH，psbA和ndhH等基因編碼區(qū)和trnS-GGA，trnV-UAC，ndhJ-trnV，ycf4-cemA，ndhE-nhdG，rpl32-trnL等基因間區(qū)的非編碼區(qū)都發(fā)生了不同程度的變異（圖10）。綜合核苷酸多樣性和序列相似性發(fā)現(xiàn)，與IR區(qū)相比，LSC和SSC是高突變區(qū)，并且SSC區(qū)為變異程度更高。

3" 討論

馬先蒿屬植物形態(tài)多樣，生境復(fù)雜，且種類(lèi)眾多，為列當(dāng)科最難分類(lèi)的屬之一［27］。自馬先蒿屬被創(chuàng)立，對(duì)于該屬的分類(lèi)范疇便一直存在爭(zhēng)議，大量分類(lèi)研究認(rèn)為馬先蒿屬較重要的形態(tài)學(xué)特征之一就是花序類(lèi)型，花序著生位置、花粉結(jié)構(gòu)和葉序結(jié)構(gòu)也被作為重要的形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)。在這種分類(lèi)背景下，馬先蒿屬屬于玄參科范疇的證據(jù)更充分。隨著馬先蒿屬更多植物的發(fā)現(xiàn)，學(xué)者［29］在馬先蒿屬植物的形態(tài)上找到更多差異性，這雖然促使馬先蒿屬植物多樣性的增加，但也使學(xué)者逐漸對(duì)Maximowicz對(duì)馬先蒿屬的分類(lèi)地位產(chǎn)生懷疑。中國(guó)學(xué)者在其中做出重大貢獻(xiàn)，首先是Li等［30］將花和葉作為營(yíng)養(yǎng)性狀將馬先蒿屬劃分到葉根科。他給出的理由如下：花序頂生或穗狀；花葉輪生或?qū)ι蝗~分螺旋狀，花腋生。Li等［31］對(duì)這種分類(lèi)的理論依據(jù)是主要為受傳粉媒介誘導(dǎo)的自然選擇壓力獨(dú)立作用于植物上，在花性狀上產(chǎn)生更大的同質(zhì)性。這也成為當(dāng)時(shí)馬先蒿屬主流的分類(lèi)方法。但這不能很好的解釋馬先蒿屬內(nèi)植物間花和葉的巨大變異性。由此，鄒同進(jìn)化的觀點(diǎn)提出［32］，花性狀如管長(zhǎng)是不可靠的分類(lèi)標(biāo)記，更影響注重花形態(tài)的是異質(zhì)性，這極大的擴(kuò)展了馬先蒿屬的分類(lèi)區(qū)域。基于此，本文在進(jìn)行馬先蒿屬植物花序類(lèi)型的形態(tài)學(xué)祖先性狀演化發(fā)現(xiàn)，馬先蒿屬植物至少有6種花序類(lèi)型，其中占據(jù)主導(dǎo)是穗狀花序和總裝花序，與列當(dāng)科眾多物種相似度顯著高于玄參科。YU［33］等人提出依據(jù)馬先蒿屬的總裝花序類(lèi)型應(yīng)將其作為列當(dāng)科的亞科之一。最后，本文的研究結(jié)果也認(rèn)為總狀花序類(lèi)型應(yīng)該作為馬先蒿屬的分類(lèi)特征。

葉綠體基因組為環(huán)形結(jié)構(gòu)，一般由LSC，IRb，SSC和IRa區(qū)構(gòu)成［34］，因此形成LSC/IRb，IRb/SSC，SSC/IRa和IRa/LSC 4個(gè)邊界。在IR區(qū)進(jìn)行擴(kuò)張和收縮時(shí)，處于邊界位置的基因有可能進(jìn)入臨近的LSC和SSC區(qū)中，而IR區(qū)的這種變化在被子植物是一種普遍現(xiàn)象［35］。其次，葉綠體基因組核苷酸多樣性形成最根本的原因在于核苷酸序列的變異，這可能是由不同植物葉綠體基因組的長(zhǎng)度和編碼基因數(shù)量差異導(dǎo)致的［36］。甘肅馬先蒿和中國(guó)馬先蒿編碼的基因數(shù)量和順序與其它馬先蒿屬植物并無(wú)顯著差異，而在進(jìn)化過(guò)程中丟失的基因種類(lèi)和數(shù)量有所差異。綜合比較發(fā)現(xiàn)葉綠體基因組中的LSC區(qū)域變異程度更大，進(jìn)化行為更加活躍，這可能是因?yàn)樗懈俚谋Ｊ鼗蚝捅Ｊ貐^(qū)域［37］。研究指出在葉綠體基因組中matK，rbcL，trnH-psbA和trnL-F被認(rèn)為是保守序列，包含兩個(gè)保守基因和兩個(gè)內(nèi)含子區(qū)域，能有效的反應(yīng)物種的進(jìn)化和變異程度［38］。而在本研究中作者發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)保守基因均分布在SSC和IR區(qū)，保守序列全分布在IR區(qū)中，這是導(dǎo)致IR區(qū)最為保守，LSC區(qū)成為葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異熱點(diǎn)區(qū)的原因之一。

對(duì)丟失的基因已有研究認(rèn)為可能是假基因化，當(dāng)它被認(rèn)為是假基因時(shí)則表示它失去了完全自我復(fù)制的能力，不再能編碼完整的蛋白質(zhì)導(dǎo)致生物功能的缺失［39-40］。也有研究報(bào)道成為假基因時(shí)只是原本的功能基因受核苷酸缺失、突變和倒位影響失去活性，導(dǎo)致功能基因的缺失［41-42］。但它仍具有編碼蛋白質(zhì)的能力并在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中通過(guò)與功能基因競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合miRNA從而調(diào)控功能基因的表達(dá)［43］，另外，它也可以產(chǎn)生內(nèi)源性小干擾RNA抑制功能基因的表達(dá)［44］。這些分子水平的改變可能與馬先蒿屬植物的形態(tài)變化存在某種關(guān)聯(lián)。在本研究中，研究發(fā)現(xiàn)馬先蒿屬植物碎米蕨葉馬先蒿核苷酸序列較短但編碼更多的PCGs，這可能與rps19基因的假基因化有關(guān)，這也解釋了碎米蕨葉馬先蒿葉綠體基因組的高度變異性（Pi=0.156 71）。弄清楚這一問(wèn)題有助于幫助了解馬先蒿屬植物葉綠體基因組的進(jìn)化過(guò)程。

17種馬先蒿屬植物核苷酸變異值變化較大（0＜Pi＜0.156 71），意味著在進(jìn)化過(guò)程中馬先蒿屬植物核苷酸替換較為強(qiáng)烈［45］。本研究發(fā)現(xiàn)馬先蒿屬植物葉綠體基因組IR區(qū)Pi值遠(yuǎn)低于LSC和SSC區(qū)，SSRs也更多的分布在LSC和SSC區(qū)，多種證據(jù)表明IR區(qū)為保守區(qū)域，因?yàn)樗暮塑账嵝蛄芯哂蟹聪蛑貜?fù)的特性。而LSC和SSC為變異活躍區(qū)，豐富了馬先蒿屬植物葉綠體基因組的多樣性。在本文中，從甘肅馬先蒿和中國(guó)馬先蒿中識(shí)別到多個(gè)高變異基因（rpl22，rps19，rpl12，ycf1，trnH，psbA和ndhH）和多個(gè)高變異區(qū)域（trnS-GGA，trnV-UAC，ndhJ-trnV，ycf4-cemA，ndhE-nhdG ，rpl32-trnL）。從邊界基因來(lái)看，ycf1基因受IR區(qū)擴(kuò)張的影響，只有一小部分序列（3～106 bp）跨越SSC/IRb邊界，而大部分核苷酸序列跨越SSC/IRa邊界進(jìn)入SSC區(qū)，458～1 149 bp的核苷酸序列保留在IRa區(qū)。本文發(fā)現(xiàn)碎米蕨葉馬先蒿的rps19基因的分布位置由LSC轉(zhuǎn)移到IRb區(qū)，其花序類(lèi)型也由總狀花序變異為亞頭狀［46］。同時(shí)，受IR區(qū)擴(kuò)張的影響trnH基因靠近并部分進(jìn)入LSC區(qū)。這種結(jié)果說(shuō)明，馬先蒿屬植物葉綠體基因數(shù)量、位置和種類(lèi)發(fā)生不同程度的變異，間接引起植物形態(tài)的改變。近幾年關(guān)于植物葉綠體基因組和線粒體基因組的研究中指出，植物在進(jìn)化過(guò)程中葉綠體基因組和線粒體基因組發(fā)生了不同程度的堿基交換，trnH基因被認(rèn)為可能參與了這一過(guò)程［47］。因此，trnH基因遠(yuǎn)離IRa區(qū)靠近LSC區(qū)可能是為了更加方便與線粒體基因組發(fā)生基因交流［48］。馬先蒿屬植物具有極高的變異性，對(duì)其葉綠體和線粒體間基因交流的研究將促進(jìn)研究人員解開(kāi)馬先蒿屬植物的進(jìn)化之謎。馬先蒿屬種間葉綠體基因組差異非常明顯，基于Pi的變異程度排序?yàn)镾SC＞LSC＞IR，編碼區(qū)也遠(yuǎn)比非編碼區(qū)更為保守。因此，SSC區(qū)中的ycf1，trnV-UAC，ndhJ-trnV和ycf4-cemA共4個(gè)非編碼區(qū)對(duì)于開(kāi)發(fā)DNA條形碼具有普遍的參考價(jià)值或者在馬先蒿屬植物未來(lái)的鑒定工作中發(fā)揮作用。其中ycf4-cemA的高突變性已經(jīng)被證明并廣泛的應(yīng)用于地理譜系研究［49］，在杜鵑花屬和風(fēng)毛菊屬系統(tǒng)進(jìn)化分析中取得成功［［50-51］。

4" 結(jié)論

馬先蒿屬植物形態(tài)特征種間差異較大，總狀花序的花序類(lèi)型是馬先蒿屬植物更加保守的形態(tài)學(xué)特征，能有效的鑒別馬先蒿屬植物。IR區(qū)在馬先蒿屬不同物種間的差異性擴(kuò)張導(dǎo)致rps19和ycf1基因跨越了區(qū)域邊界造成IR區(qū)基因數(shù)量的丟失，同時(shí)促使LSC和SSC區(qū)出現(xiàn)4個(gè)高變異區(qū)（ndhJ-trnV、ycf4-cemA、ndhE-nhdG和rpl32-trnL）和1個(gè)高變異基因（ndhH），提高了馬先蒿屬植物葉綠體基因組的多樣性，間接導(dǎo)致二者成為馬先蒿屬植物葉綠體基因組的高變異區(qū)。馬先蒿屬植物高變異性的葉綠體基因組可能是誘使馬先蒿屬植物形態(tài)發(fā)生劇烈改變的原因之一，但仍需要進(jìn)一步的研究。

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（責(zé)任編輯" 劉婷婷）