摘要：本研究以22份披堿草（Elymus dahuricus Turcz.）種質(zhì)為試驗(yàn)材料，設(shè)置全氮（1 mmol·L-1，TN）和1/100氮（0.01 mmol·L-1，LN）兩個氮濃度處理28 d，對處理后披堿草的形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)進(jìn)行測定，并對各測定值進(jìn)行隸屬函數(shù)分析比較，探究22份披堿草種質(zhì)在長期低氮脅迫下的耐低氮特性。結(jié)果表明：在低氮脅迫下，22份披堿草的植株表型均受到不同程度影響，表現(xiàn)為株高降低，根長縮短；生理指標(biāo)方面：低氮顯著降低了披堿草幼苗的硝態(tài)氮含量、凈光合速率、蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度、氣孔導(dǎo)度、硝酸還原酶和谷氨酸合成酶活性以及可溶性糖含量；低氮顯著提高了谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶活性，同時顯著增加了超氧陰離子、過氧化氫以及可溶性蛋白的含量。經(jīng)過相關(guān)性分析、主成分分析和隸屬函數(shù)分析，提取7個主成分作為披堿草耐低氮性評價的綜合指標(biāo)，經(jīng)過計算得出耐低氮性較強(qiáng)的種質(zhì)是E17，E19，低氮敏感型種質(zhì)是E12，E16。研究結(jié)果為披堿草耐低氮品種選育工作提供理論支持。

關(guān)鍵詞：披堿草；低氮脅迫；形態(tài)特征；生理特性；耐低氮性；綜合評價

中圖分類號：Q945.78""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）07-2128-15

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.014

引用格式：

張心怡， 何菲菲， 張" 亮，等.不同披堿草種質(zhì)對低氮脅迫的形態(tài)和生理響應(yīng)分析及耐低氮性評價［J］.草地學(xué)報，2024，32（7）：2128-2142

ZHANG Xin-yi， HE Fei-fei， ZHANG Liang，et al.Analysis of the Morphology and Physiological Response of Different Elymus Dahuricus Germplasm under Low Nitrogen Stress［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2128-2142

收稿日期：2024-03-15；修回日期：2024-04-23

基金項(xiàng)目：四川省自然基金青年基金（2023 NSFSC1134）；西南民族大學(xué)雙一流建設(shè)項(xiàng)目（CX2023011）資助

作者簡介：

#張心怡（2000-），女，漢族，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，碩士研究生，主要從事牧草育種研究，E-mail：1607962193@qq.com；#何菲菲（1995-），女，漢族，四川遂寧人，碩士研究生，主要從事牧草育種研究，E-mail：2865319187@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：leiyingxia@hotmail.com

Analysis of the Morphology and Physiological Response of Different

Elymus Dahuricus Germplasm under Low Nitrogen Stress

ZHANG Xin-yi1#， HE Fei-fei1#， ZHANG Liang1， LUO Ying1， ZHOU Qing-ping1， 2， LEI Ying-xia1， 2*

（1. College of Grassland Resources， Southwest Minzu University， Chengdu， Sichuan Province 610041， China;

2. Sichuan Zoige Alpine Wetland Ecosystem National Observation and Research Station， Southwest Minzu University，

Chengdu， Sichuan Province 610041， China）

Abstract：In this study，22 Elymus dahuricus Turcz. germplasms were used as experimental materials，and two nitrogen concentrations of total N （1 mmol·L-1，TN） and 1/100 N （0.01 mmol·L-1，LN） were set to treat for 28 d. Morphological and physiological indexes of the lanceolate were measured after the treatments，and the values of the measurements were subjected to the analysis of the affiliation function. The morphological and physiological indexes of lanceolate were measured after treatment，and the values were compared with each other in an affiliation function analysis to investigate the low nitrogen tolerance characteristics of 22 lanceolate germplasm under long-term low nitrogen stress. The results showed that the plant phenotypes of 22 Elymus dahuricus Turcz. were affected to different degrees under low nitrogen stress，as evidenced by reduced plant height and shortened root length. For physiological indicators：low nitrogen significantly reduced nitrate nitrogen content，net photosynthetic rate，transpiration rate，intercellular carbon dioxide concentration，stomatal conductance，nitrate reductase and glutamate synthetase activities，and soluble sugar content in Elymus dahuricus Turcz. seedlings. Low nitrogen significantly increased glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase activities，along with significant increases in superoxide anion，hydrogen peroxide，and soluble protein content. After correlation analysis，principal component analysis and affiliation function analysis，seven principal components were extracted as comprehensive indexes for the evaluation of low-nitrogen tolerance of Elymus dahuricus Turcz，and the germplasm with stronger low-nitrogen tolerance were calculated to be E17 and E19，and low-nitrogen-sensitive germplasm were E12 and E16. The results of the study provide theoretical support for the selection and breeding of low-nitrogen-tolerant varieties of Elymus dahuricus Turcz.

Key words：Elymus dahuricus;Low nitrogen stress;Morphological characteristics;Physiological characteristics;Low nitrogen resistance;Comprehensive evaluation

氮（N）是植物生長和發(fā)育的關(guān)鍵元素之一，參與植物體內(nèi)多種重要有機(jī)化合物的構(gòu)成（如激素、酶、葉綠素、核酸和生物堿等），是維持和促進(jìn)植物生長發(fā)育的必要組成物質(zhì)［1］。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，常通過施加氮肥來獲取較高的作物產(chǎn)量。然而，據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計，所施氮肥中有60%～70%的氮素未被植物所吸收利用［2］。并且，過量施用氮肥會污染水環(huán)境，并導(dǎo)致土壤板結(jié)、破壞其理化性質(zhì)，進(jìn)而降低植物的生產(chǎn)效率［3］。因此，適量減施氮肥不僅可以改善土壤質(zhì)地，提高土壤保水性，還可以減少土壤中余留的氮肥，使土壤中的氮素得到更好地利用，同時也可以降低土壤中的氮素流失，促進(jìn)土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展［4］。有研究表明，低氮條件會降低植物的產(chǎn)量及品質(zhì)，但耐低氮種質(zhì)相比氮敏感種質(zhì)受影響較小，如：王玉乾等［5］對不同氮效率品種油菜（Brassica napus L.）進(jìn)行低氮處理，結(jié)果表明氮高效油菜為保障其光合速率和營養(yǎng)體生長，將更多的氮元素分配至地上部分；韓霖等［6］對超高產(chǎn)玉米（Zea mays L.）和普通玉米品種在低氮條件下產(chǎn)量的比較研究中發(fā)現(xiàn)，氮缺乏較大程度影響了普通玉米的產(chǎn)量，而超高產(chǎn)玉米則能保持較高的產(chǎn)量。由此可見，充分發(fā)掘和利用作物自身的遺傳潛力，篩選出耐低氮種質(zhì)，降低對肥料的過分依賴，是實(shí)現(xiàn)減肥增效的有效途徑之一，具有十分重要的意義。

披堿草（Elymus dahuricus Turcz.）是禾本科（Poaceae）小麥族（Triticea）披堿草屬（Elymus）的一種多年生植物。全世界范圍內(nèi)披堿草主要分布在溫帶和寒溫帶地區(qū)，在中國主要分布于四川、西藏、新疆、東北、華北等地［7］。披堿草作為一種小麥族野生近緣種，具有多種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗蟲、抗病的基因，這些特性使其成為改良麥類作物和豐富牧草遺傳多樣性的遺傳資源庫［8］。此外，披堿草作為高寒草原和草甸的建群種和優(yōu)勢種，具有分蘗能力強(qiáng)、再生性好和營養(yǎng)價值高等特點(diǎn)，使得其在畜牧業(yè)中具有顯著的應(yīng)用價值［9］。同時，披堿草在防風(fēng)固沙和水土保持等方面也發(fā)揮著不可或缺的作用［10］。因此，研究披堿草對牧草育種、草牧業(yè)發(fā)展及生態(tài)環(huán)境的保護(hù)都具有重要的意義。

目前，對于耐低氮品種的篩選與評價工作在煙草（Nicotiana tabacum L.）［11］、谷子（Setaria italica L.）［12］、大豆（Glycine max L.）［13］等植物上已有較多研究。如劉芯欣等［14］以株高、地上部鮮重、地上部干重、地下部干重、根冠比等9個指標(biāo)對大豆的耐低氮性進(jìn)行研究，從260份大豆資源中篩選出強(qiáng)耐低氮資源17份。張楚等［15］則以株高、莖粗、可溶性蛋白、根系超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）可溶性糖等25個指標(biāo)對苦蕎（Fagopyrum tataricum L.）的耐低氮性展開研究，從9個苦蕎品種中篩選出‘迪慶’苦蕎的耐低氮能力最強(qiáng)。然而，對于披堿草耐低氮性的相關(guān)研究報道較少，且主要集中在田間實(shí)驗(yàn)［16-17］，對披堿草進(jìn)行室內(nèi)苗期低氮脅迫試驗(yàn)來對披堿草耐低氮種質(zhì)篩選與評價鮮有報道。為此，本試驗(yàn)以22份不同披堿草種質(zhì)為材料，采用水培的方法，分析不同種質(zhì)披堿草苗期對全氮和低氮的響應(yīng)，通過Pearson相關(guān)性分析、主成分分析（Principal component analysis，PCA）、隸屬函數(shù)分析綜合評價各種質(zhì)的耐低氮性特征，篩選出耐低氮披堿草種質(zhì)，以期為披堿草耐低氮品種選育工作提供理論支持。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料由西南民族大學(xué)草地資源學(xué)院提供，選自具有不同地域代表性的披堿草種質(zhì)，且以下種質(zhì)均已通過核型鑒定，見表1。

1.2" 試驗(yàn)設(shè)計

本試驗(yàn)采用紙上發(fā)芽法，選取籽粒飽滿的種子，1% 的NaClO溶液消毒5 min，蒸餾水沖洗3～4次，置于鋪雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿上進(jìn)行萌發(fā)，萌發(fā)后放入光溫周期為26℃光照16 h和16℃黑暗8 h的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待其幼苗生長至10 cm高左右時，挑選出長勢一致的披堿草幼苗定植于水培箱（45 cm×32 cm×20 cm）中，試驗(yàn)設(shè)置6個生物學(xué)重復(fù)，每個處理各定植6槽，每槽定植10株。使用霍格蘭營養(yǎng)液（海博生物技術(shù)有限公司www.hopebiol.com）水培。設(shè)置兩個供氮水平，分別為全氮（1 mmol·L-1）和低氮（0.01 mmol·L-1），以下簡稱TN和LN。本試驗(yàn)以Ca（NO3）2·4H2O為氮源，用CaCl2補(bǔ)充缺失的Ca2+。每7 d更換一次營養(yǎng)液，增氧泵通氣。經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)28 d后，從每個處理中選取6株長勢一致的健康植株進(jìn)行農(nóng)藝性狀指標(biāo)的測定。剪取披堿草幼苗的新鮮葉片于-80℃冰箱中保存，用于進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。

1.3" 相關(guān)指標(biāo)及其測定方法

1.3.1" 生長指標(biāo)測定" 從每個處理中完整取出6株長勢一致的披堿草，用卷尺測量其株高（Plant height，PH）和根長（Root length，RL）。分析天平（精度為 0.000 1 g）稱量地上部鮮重（Shoot fresh weight，SFW）和地下部鮮重（Root fresh weight，RFW）。再將植株鮮樣放入105℃的烘箱中殺青半小時，在65℃的烘箱中烘干至恒重，取出測定地上部分干重（Shoot dry weight，SDW）和地下部分干重（Root dry weight，RDW），根冠比（Root-shoot ratio，RSR）計算公式為：

根冠比（RSR）=地下部干重/地上部干重

1.3.2" 生理指標(biāo)測定" 光合指標(biāo)包括凈光合速率（Net photosynthesis rate，Pn）、蒸騰速率（Evapotranspiration rate，Tr）、氣孔導(dǎo)度（Transpiration rate，Gs）和胞間二氧化碳濃度（Intercellular CO2concentration，Ci），用Li-6800光合作用全自動測量系統(tǒng)（美國LI-COR公司研發(fā)）在大氣CO2濃度為400 μmol·m-1，光合有效輻射為1 200 μmol·m-2·s-1，葉片溫度為22℃的條件下，于上午9：00—12：00，下午14：00—17：00測定。谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）、硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）、谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）、谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS），均使用對應(yīng)指標(biāo)的微量法試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司www.cominbio.com）測定。過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）與超氧陰離子（Superoxide anion，O-2）含量均參照微量法試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司www.cominbio.com）測定。根據(jù)張志良等［18］的試驗(yàn)方法，對以下指標(biāo)進(jìn)行測定：丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法進(jìn)行測定；硝態(tài)氮（Nitrate nitrogen，NO-3-N）含量采用用水楊酸比色法進(jìn)行測定；可溶性糖（Soluble sugar，SS）含量采用蒽酮比色法進(jìn)行測定，可溶性蛋白（Soluble protein，SP）的含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定。

1.4" 數(shù)據(jù)處理

1.4.1" 耐低氮系數(shù)=低氮條件下性狀表型值/對照組性狀表型值

1.4.2" 各材料隸屬函數(shù)值公式如下：

U（Xj）=（Xj -Xmin）/（Xmax-Xmin），j=1，2，3，…，n（1）

其中：Xj表示第j個綜合指標(biāo)；Xmin和Xmax分別表示第j個綜合指標(biāo)最小值和最大值。

1.4.3 "各材料權(quán)重公式如下：

Wj=Pj/∑nj=1Pj，j=1，2，3，…，n（2）

其中：Wj代表第j個綜合指標(biāo)在整個評價體系中的權(quán)重；而Pj則是各個基因型第j個綜合指標(biāo)上的貢獻(xiàn)率。

1.4.4" 各材料綜合評價值公式如下：

D=∑nj=1［U（Xj）×Wj］，j=1，2，3，…，n（3）

其中：D值代表各基因型在低氮脅迫條件下，通過綜合指標(biāo)評價得出的耐低氮性綜合評價值。

所有數(shù)據(jù)用Excel 2020進(jìn)行整理，用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計分析和系統(tǒng)聚類，對各指標(biāo)進(jìn)行T檢驗(yàn)、根據(jù)耐低氮系數(shù)進(jìn)行主成分分析，隸屬函數(shù)分析，用Origin繪制柱狀圖和相關(guān)性熱圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 低氮脅迫下披堿草形態(tài)指標(biāo)的響應(yīng)

在低氮脅迫下，與TN相比，22份不同披堿草種質(zhì)的株高和根長均呈下降趨勢。從株高降幅來看，E13的株高下降最多（36.08%），其次是E12（33.98%），且差異極顯著（Plt;0.01），下降最少的是E14（6.03%）。從根長降幅來看，E6的根長下降最多為71.88%，E21下降較少為31.66%（圖1a～1b，表2）。地上部鮮重除E9上升了15.63%外，其余種質(zhì)均呈下降趨勢，降幅在15.63%～81.33%之間，其中E13下降了81.33%，E15下降了15.63%。地下部鮮重除E14上升了28.57%外，其余均呈下降趨勢，降幅在7.69%～72.00%之間，其中E20降幅最大為72%（Plt;0.001），E1降幅最小為7.69%。低氮條件下，披堿草干物質(zhì)量變化不一，整體表現(xiàn)為呈下降趨勢（圖1c～1f，表2）。然而對于披堿草幼苗根冠比，除E4，E1，E13，E21和E14的根冠比出現(xiàn)升高，且升高幅度分別為50%，40.9%，33.3%，20%和9.1%外，其余均呈下降趨勢，且下降幅度范圍為11.11%～74.07%，其中下降最多的為E16（74.07%），其次是E15（56%），E18下降最少（11.11%）（圖1g，表2）。

2.2" 低氮脅迫下披堿草光合作用的響應(yīng)

由圖2所示，與TN相比，22份披堿草種質(zhì)在低氮脅迫下的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）均有一定程度的降低，且差異顯著（Plt;0.05）。其中Pn下降幅度最大的是E12（53.41%），Pn下降最少的是E18（5.83%）；Tr降幅最大的是E12（44.81%），降幅最小的是E4（3.23%）；Ci降幅最大的是E1（24.87%），降幅最小的是E20（1.23%）；Gs降幅最大的是E11和E14（47.62%），降幅最小的是E7和E8（8.33%）。

2.3" 低氮脅迫下披堿草硝態(tài)氮的響應(yīng)

低氮脅迫顯著降低了硝態(tài)氮的含量，下降幅度不盡相同，低氮組和全氮組變化呈現(xiàn)極顯著差異（Plt;0.01）。其中下降較多為E14（99.5%），E9（99%），E18（98.8%）和E13（98.6%）。E20下降了65.4%，E12下降了67.2%，E1下降了68.8%，其他品種的變化趨于一致。且TN中E8的硝態(tài)氮含量最多，E15的硝態(tài)氮含量最少。低氮處理后E12，E20的硝態(tài)氮含量最高，E9，E13，E14和E18的硝態(tài)氮含量最低（圖3）。

2.4" 低氮脅迫下披堿草氮代謝相關(guān)酶的響應(yīng)

由圖4所示，低氮處理對披堿草的硝酸還原酶（NR）活性影響存在差異。除E3、E4、E5、E7和E21有上升趨勢外，其余大部分呈不同程度的下降趨勢，且差異顯著（Plt;0.05）。其中E10的NR活性降幅最多（65.56%），E8、E2和E15分別下降了65.07%，63.27%和62.29%，E14下降的最少（3.5%）（圖4a）。

與TN相比，低氮條件下除E1，E2，E5，E7，E8，E14，E15，E21和E22的谷氨酰胺合成酶（GS）活性有所下降外，其余披堿草的GS活性均有不同程度的上升，上升幅度在1.93%～93.74%之間。其中E17上升的最多（93.74%），E19上升的最少（1.93%）（圖4b）。

低氮脅迫下谷氨酸合成酶（GOGAT）活性與TN相比，大部分呈降低趨勢，少部分呈升高趨勢，多數(shù)披堿草降幅在60%左右。其中E20降幅最大（80.17%），E15降幅最小（6.64%）（圖4c）。

在低氮脅迫下，谷氨酸脫氫酶（GDH）除E19有所下降外，其余均呈上升趨勢。上升幅度較大的3個種質(zhì)為E12gt;E16gt;E7（13.25%gt;10.91%gt;10.22%）（圖4d）。

2.5" 低氮脅迫下披堿草活性氧、氧化產(chǎn)物丙二醛的響應(yīng)

在低氮脅迫下，22份披堿草種質(zhì)中19份種質(zhì)超氧陰離子（O-2）含量均呈不同程度的上升趨勢，3份種質(zhì)呈下降趨勢。其中E2（168.22%）、E11（158.72%）、E20（137.46%）和E14（116.30%）上升幅度極為顯著（Plt;0.01）。其次E12上升了97.35%、E1上升了95.81%、E8上升了88.63%，E22變化最?。?.06%）。E6，E7和E9分別下降了1.93%，10.93%和16.90%。試驗(yàn)品種的過氧化氫（H2O2）含量變化除3份種質(zhì)呈下降趨勢，其余呈上升趨勢，且差異極顯著（Plt;0.01），上升幅度最為明顯的是E4（215%），E9上升了119.13%，E16上升了111.82%，E9上升幅度最?。?.3%）（圖5a～5b）。

所有試驗(yàn)品種的丙二醛（MDA）含量在低氮脅迫下除E5，E7，E9，E10和E20下降外，其余均有不同程度的上升，且差異極顯著（Plt;0.01），其中E19上升幅度最大（251.05%），其次是E8，E14，E2，E24，E22和E15，分別為175.89%，160.18%，160.11%，121.22%，106.63%和102.93%（圖5c）。

2.6" 低氮脅迫下披堿草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應(yīng)

低氮脅迫下，相比TN，試驗(yàn)中除E3，E16，E19，E21的可溶性蛋白（SP）含量有所上升外，其余披堿草種質(zhì)均有不同程度下降，且差異性顯著（Plt;0.05）。其中E4的下降幅度最大（52.35%），E15下降了44.93%，E1下降了44.25%，E7下降了41.47%，E8下降了40.34%，E20下降的最少（4.34%）。與此同時，E1，E9，E12，E13，E15，E16，E18的可溶性糖（SS）含量呈下降趨勢，且差異性顯著（Plt;0.05），其余披堿草種質(zhì)均呈上升趨勢。其中E12下降了49.53%，E15下降了31.35%，E9下降了22.68%，E1下降了14.74%，E13下降了13.95%，E16下降了10.82，E18下降了10.63%。而上升披堿草種質(zhì)中，E22和E20分別上升幅度較多且增幅較一致，分別為85.46%和83.28%；其次E2上升了73.41%，E5上升最少（0.08%）（圖6）。

2.7" 各指標(biāo)耐低氮系數(shù)相關(guān)性分析

根據(jù)1.4.1中的公式可以計算出不同披堿草指標(biāo)間的耐低氮系數(shù)（表3）。研究結(jié)果顯示12對指標(biāo)間均存在不同程度的相關(guān)性，綜合影響著披堿草幼苗的耐氮能力，其中株高（PH）與地上部干重（RDW）呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.543，與地上部鮮重（SFW）呈顯著正相關(guān)，與根冠比（RSR）呈顯著負(fù)相關(guān)；根長（RL）與地下部鮮重（RFW）、地下部干重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.597和0.665；根冠比與地下部鮮重、地下部干重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.602和0.549，與氣孔導(dǎo)度呈顯著正相關(guān)，與地上部干重呈顯著負(fù)相關(guān)；地上部鮮重（SFW）與地上部干重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.947，與地下部干重呈顯著正相關(guān)；地下部鮮重與地下部干重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.763，與硝態(tài)氮（NO-3-N）呈顯著負(fù)相關(guān)；地下部干重與硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)；凈光合速率（Pn）與蒸騰速率（Tr）呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.747，與氣孔導(dǎo)度（Gs）呈顯著正相關(guān)，與硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)；蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.576，與硝酸還原酶（NR）呈顯著正相關(guān)。（圖7）

2.8" 披堿草各指標(biāo)主成分分析

由表4可知，在21項(xiàng)指標(biāo)的耐低氮系數(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行主成分分析，結(jié)果提取出7個主成分，方差貢獻(xiàn)率分別為20.36，18.29，12.474，10.283，8.355，6.473和4.975，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到81.21%。第一主成分（PC1）特征值和貢獻(xiàn)率分別為4.276%，20.36%，主要由蒸騰速率（Tr），氣孔導(dǎo)度（Gs）決定，代表著光合作用指標(biāo)信息;第二主成分（PC2）特征值和貢獻(xiàn)率分別為3.841%和18.29%，主要受地上部鮮重（SFW）、地下部干重（RDW）、根長（RL）、地上部干重（SDW）作用，反映了地上部生長和根系生長信息;第三主成分（PC3）特征值和貢獻(xiàn)率分別為2.619%和12.474%，主要受株高（PH）和凈光合速率（Pn）作用，與第一主成分反映基本一致；第四主成分（PC4）特征值和貢獻(xiàn)率分別為2.16%，10.283%，主要受丙二醛（MDA）、超氧陰離子（O-2），反映了披堿草的抗氧化能力；第五主成分（PC5）特征值和貢獻(xiàn)率分別為1.755%和8.355%，主要受谷氨酰胺合成酶（GS）作用，反映了披堿草的氮代謝效率。第六主成分（PC6）特征值和貢獻(xiàn)率分別為1.359%，6.473%，主要受過氧化氫（H2O2）作用，反映了披堿草的抗氧化能力；第七主成分（PC7）特征值和貢獻(xiàn)率分別為1.045%，4.975%，主要受可溶性蛋白（SP）作用，反映了滲透調(diào)節(jié)能力。綜上分析，7個主成分中貢獻(xiàn)率占主導(dǎo)的性狀可作為披堿草苗期綜合評價的指標(biāo)。

2.9" 隸屬函數(shù)分析及綜合評價

通過隸屬函數(shù)計算各指標(biāo)的隸屬值，進(jìn)而綜合評價22份披堿草種質(zhì)對低氮脅迫的耐受能力。根據(jù)1.4.2中的公式（1）進(jìn)行主成分隸屬函數(shù)分析并根據(jù)7個主成分的貢獻(xiàn)率，利用1.4.3中的公式（2）計算出各主成分的權(quán)重。最后，利用公式（3）得出22份種質(zhì)對低氮脅迫的耐受綜合值（D值）。22份種質(zhì)中耐低氮性綜合評分（D值）排名平均值越大，說明該種質(zhì)耐低氮能力越強(qiáng)，平均值越小，說明該種質(zhì)耐低氮性越弱。由低到高排序?yàn)椋篍12lt;E16lt;E13lt;E2lt;E20lt;E11lt;E6lt;E15lt;E22lt;E19lt;E10lt;E5lt;E1lt;E21lt;E3lt;E7lt;E8lt;E18lt;E4lt;E14lt;E9lt;E17（表5）。

2.10" 不同披堿草種質(zhì)聚類分析結(jié)果

利用歐式距離法對D值進(jìn)行系統(tǒng)聚類，可以綜合評估不同披堿草種質(zhì)的對低氮環(huán)境的耐受能力。當(dāng)歐式距離閾值為10時，可以將22份披堿草材料分為三類。其中E17、E9的耐氮性較強(qiáng)，E12和E16屬于低氮敏感型種質(zhì)，其余種質(zhì)則被歸類為低氮脅迫中間型（圖8）。

3" 討論

3.1" 低氮條件下披堿草苗期生長的響應(yīng)

氮素是植物生長發(fā)育過程中必不可少的主要元素之一，植物在氮素虧缺環(huán)境下生長時，因其無法獲得正常生長所需的氮含量，導(dǎo)致植物體對氮素吸收利用效率降低，生長受抑制，進(jìn)而影響其產(chǎn)量和品質(zhì)［11］。有研究表明：低氮條件下9個藜麥基因型的株高較正常氮水平均有所下降［19］。趙明麗［20］研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下普通型野大豆與耐低氮型野大豆的地上部和地下部的生物量均下降，但耐低氮型野大豆的降幅顯著低于普通型野大豆。郭紅霞等［21］研究表明，低氮脅迫下不同藜麥品系的株高、莖粗和莖葉干重均有所降低。在本試驗(yàn)中，22份披堿草種質(zhì)的株高、根長趨勢與前人研究結(jié)果相符，但E9的降幅與其他種質(zhì)相比較小，說明E9較其他種質(zhì)受低氮影響較小。有研究表明，植物在受到低氮脅迫時，植物會優(yōu)先將吸收的氮素供給葉片合成葉綠素，增強(qiáng)對環(huán)境的適應(yīng)性，從而提高氮素的利用效率［22］，故推測E9為耐低氮型種質(zhì)。

3.2" 低氮條件下披堿草苗期光合作用的響應(yīng)

植物光合酶系統(tǒng)及光合器官的建成依賴于氮素供應(yīng)，土壤中氮素的供應(yīng)量影響著植物對光能的吸收，進(jìn)而影響著光合作用能否正常運(yùn)轉(zhuǎn)［23］。在正常處理下，植物會將土壤中吸收的氮，作為氮源供給健壯的葉片，增強(qiáng)光合作用；低氮處理下，植物光合作用一般會受到抑制［24］。佟容等［23］在探究低施氮對菠菜生長發(fā)育及品質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn)，在低氮條件下菠菜葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度呈下降趨勢。王曉慧等［24］發(fā)現(xiàn)花生葉片在缺氮處理會因缺乏葉綠素而變黃，且氮會從衰老組織轉(zhuǎn)移至幼嫩組織。也有研究表明谷子葉片在氮限制條件下，光合速率及葉綠素都會呈現(xiàn)出下降趨勢，影響植株光合作用［25］。在本試驗(yàn)中，披堿草的所有光合指標(biāo)都表現(xiàn)出下降趨勢，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，但E12下降幅度較其他種質(zhì)更明顯，表明低氮脅迫能夠更大程度抑制葉綠素和相關(guān)酶含量合成，而葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵色素［26］，其減少會直接影響到光能的捕獲和轉(zhuǎn)換效率，從而降低光反應(yīng)和暗反應(yīng)的速率，推測E12為氮敏感型種質(zhì)。

3.3" 低氮條件下披堿草苗期氮代謝的響應(yīng)

氮代謝是植物體內(nèi)基礎(chǔ)且重要的生理過程，涉及對氮素的吸收、同化和利用［24］。植物通過根系吸收土壤中的無機(jī)氮，但這些氮不能被植物直接利用，都要經(jīng)過一系列酶的參與和調(diào)控，才能轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮，進(jìn)而被植物利用［27］。硝酸還原酶（NR）作為氮代謝中的限速酶，對植物吸收硝態(tài)氮至關(guān)重要，而谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶則對植物同化氨起關(guān)鍵作用［28］。王漢霞等［29］通過研究小麥品種氮代謝遺傳差異及其氮效率之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，正常氮供應(yīng)下，小麥葉片及根部的NR含量相較于低氮水平均有所降低。劉鵬等［30］通過研究低氮環(huán)境下不同基因型高粱的生理響應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，低氮敏感型高粱葉片的NR，GS和GOGAT活性顯著降低，顯示出高粱不同基因型對氮脅迫反應(yīng)存在差異。本研究中，各種質(zhì)NR活性在低氮條件下均呈現(xiàn)被抑制的狀態(tài)，其中E14的被抑制效果最弱，說明該種質(zhì)能夠在低氮環(huán)境下相對維持氮同化效率。

3.4" 低氮條件下披堿草苗期抗氧化能力的響應(yīng)

植物遭受低氮脅迫時，體內(nèi)會產(chǎn)生損傷細(xì)胞膜的活性氧（ROS），導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧代謝紊亂，為了維持生理之間的動態(tài)平衡，植物會產(chǎn)生ROS清除劑來進(jìn)行防御，從而緩解ROS引起的氧化損傷［31］。ROS清除劑包含過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、氧化物歧化酶（SOD）等，ROS包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O-2）等［32］。相關(guān)研究表明，干旱和低氮脅迫誘發(fā)小麥植株體內(nèi)超氧陰離子、過氧化氫及羥基自由基等活性氧數(shù)量增多［33］。同時MDA是衡量細(xì)胞膜損傷程度的指標(biāo)，作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，MDA能夠反映細(xì)胞膜損傷程度，MDA含量積累越多，說明膜脂過氧化程度越嚴(yán)重［15］。王文博［34］在黃瓜低氮耐受性指標(biāo)評價中發(fā)現(xiàn)，氮脅迫下黃瓜種質(zhì)23、種質(zhì)47、種質(zhì)9930地上部及根系的丙二醛含量顯著增加，說明這三種種質(zhì)都受到不同程度的氧化脅迫傷害。趙陽等［35］研究發(fā)現(xiàn)甜菜幼苗在缺氮及低氮環(huán)境下，其根和葉的丙二醛含量上升。本試驗(yàn)中，低氮處理下大部分披堿草種質(zhì)的MDA含量呈上升趨勢，說明披堿草的細(xì)胞膜系統(tǒng)受到了氧化損傷。而E9的丙二醛含量下降，推測可能與植物體內(nèi)基因表達(dá)水平的上調(diào)及活性氧清除酶的活性能力明顯增強(qiáng)有關(guān)，為了應(yīng)對活性氧的積累，提高其耐氮能力，植物會增加編碼活性氧清除酶基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)體內(nèi)活性氧清除酶的活性［38］。

3.5" 低氮條件下披堿草苗期滲透調(diào)節(jié)能力的響應(yīng)

可溶性蛋白（SP）與可溶性糖（SS）等有機(jī)物含量的積累，有助于增加滲透調(diào)節(jié)能力，維護(hù)蛋白質(zhì)生物合成系統(tǒng)，從而提高自身對逆境的抗性，所以許多研究人員認(rèn)為SP和SS積累的數(shù)量可作為植物的耐性指標(biāo)［36］。在植物體內(nèi)，氮代謝與碳代謝相互作用，共同影響著植物生長發(fā)育，可溶性糖是植物體內(nèi)重要的碳源，而糖酵解對生產(chǎn)碳骨架具有不可替代的作用，幫助植物應(yīng)對不良環(huán)境［38］。李強(qiáng)等［39］研究表明，玉米苗期葉片在低氮條件下可溶性蛋白含量會降低，但耐低氮性強(qiáng)的品種可溶性蛋白含量降幅較小。羅穎等［37］對低氮脅迫下不同皮燕麥的早期生理響應(yīng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)18份皮燕麥的SS和SP含量顯著降低。張心怡等［40］的研究顯示，在低氮處理下，耐低氮品種燕麥的可溶性糖含量降幅最小。在本研究中，E12的SS含量降幅最大，可能是由于低氮條件下含氮化合物減少，影響了披堿草的SS的合成，從而降低披堿草自身水分吸收能力與滲透調(diào)節(jié)能力，誘導(dǎo)早期披堿草葉片衰老，故推測E12為低氮敏感型品種。低氮條件下，部分披堿草種質(zhì)可溶性蛋白含量降低，說明此時的低氮脅迫并沒有促進(jìn)披堿草可溶性蛋白的合成。而少數(shù)種質(zhì)可溶性糖上升，可能跟糖酵解的代謝過程有關(guān)。

3.6" 披堿草苗期耐低氮種質(zhì)篩選

植物在面對脅迫時會表現(xiàn)出一種整體的反應(yīng)機(jī)制，這種應(yīng)對方式并不因其抗性強(qiáng)弱而有所不同，顯示出在脅迫下，植物普遍采取相似的生理和代謝調(diào)節(jié)方式。但不同種質(zhì)植物可能會表現(xiàn)出各指標(biāo)變化幅度的差異，這種差異成為種質(zhì)篩選的關(guān)鍵指標(biāo)之一。如：馬越等［41］對92份番茄種質(zhì)進(jìn)行干旱處理，結(jié)果表明在干旱脅迫下6個指標(biāo)均顯著降低，但仍可通過綜合評價將其分為抗旱性不同的幾類；羅鑫等［42］以垂穗披堿草為研究對象進(jìn)行干旱復(fù)水處理，結(jié)果表明：在脅迫下9份材料各形態(tài)和生理指標(biāo)均表現(xiàn)為相似趨勢，但根據(jù)不同種質(zhì)的變化程度結(jié)合隸屬函數(shù)法綜合評價體系，成功計算出9份垂穗披堿草的抗旱性強(qiáng)弱順序；趙繼秀等［43］在研究燕麥苗期性狀對低氮脅迫的響應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，耐低氮種質(zhì)和低氮敏感種質(zhì)的各指標(biāo)在低氮脅迫下表現(xiàn)一致，但較對照組變化程度有所差異，故其認(rèn)為：一致的變化趨勢是燕麥在低氮脅迫下的統(tǒng)一應(yīng)對措施，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行主成分分析、隸屬函數(shù)分析和聚類分析是篩選耐低氮種質(zhì)的常用方法。故本研究中，通過分析不同種質(zhì)披堿草所表現(xiàn)出的各項(xiàng)指標(biāo)變化幅度的差異，可以更好地評估不同種質(zhì)在低氮脅迫下的表現(xiàn)和適應(yīng)能力。

以往研究表明，由于缺乏足夠的氮素供應(yīng)，會導(dǎo)致植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受損，細(xì)胞分裂和生長受限，進(jìn)一步導(dǎo)致作物的產(chǎn)量和品質(zhì)下降［22］。由于試驗(yàn)品種或種質(zhì)的不一，其耐受能力也因其基因型不同而不同［13］。目前，為了使篩選出的耐低氮材料更加準(zhǔn)確可靠，Liu等［44］采用皮爾森相關(guān)性分析、主成分分析及從屬函數(shù)分析相結(jié)合的方法，對20個糜子品種在氮脅迫條件下的株高、根長、地上部生物量及氮含量進(jìn)行綜合評估，從而精確評估它們的耐低氮性。安立昆等［45］采用變異系數(shù)、相關(guān)性、主成分和隸屬函數(shù)分析對低氮下8種青稞品種的生理指標(biāo)進(jìn)行評價，認(rèn)為根部GS活性可以作為青稞耐低氮資源的初步篩選指標(biāo)，而滲透調(diào)節(jié)物與抗氧化酶活性在青稞耐低氮性中占主導(dǎo)地位，是篩選耐低氮青稞的關(guān)鍵指標(biāo)。貴會平等［45］在低氮和適氮兩個處理下，對棉花苗期的氮積累量、SPAD值、總干物質(zhì)質(zhì)量等指標(biāo)進(jìn)行分析，并通過主成分分析及隸屬函數(shù)法，篩選出了32個低氮耐受性品種以及32個對氮脅迫敏感品種。以上文獻(xiàn)均說明測定生理生化指標(biāo)并結(jié)合數(shù)據(jù)分析如主成分分析和隸屬函數(shù)分析等方法可以構(gòu)建作物種質(zhì)資源篩選與評價體系，得出較可靠結(jié)論，在品種篩選上廣泛運(yùn)用，且較為成熟。所以本研究基于披堿草21項(xiàng)指標(biāo)的的耐低氮系數(shù)，通過主成分分析法將22份不同披堿草種質(zhì)的農(nóng)藝性狀與生理性狀簡化為7個主成分。將主成分分析與隸屬函數(shù)相結(jié)合，通過D值計算對不同披堿草種質(zhì)的耐低氮性進(jìn)行綜合評價。結(jié)果顯示耐低氮性較強(qiáng)的種質(zhì)為E17，E9，較弱的為：E16，E12，其余材料為中間型種質(zhì)。再進(jìn)一步結(jié)合歐式距離法將D值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，篩選出三大類種質(zhì)。E17，E9，E14，E18，E4，E8，E7，E3，E21劃分為耐低氮種質(zhì)，將E12和E16劃分為氮敏感種質(zhì)，其余種質(zhì)均為中等耐低氮型。由隸屬函數(shù)綜合評價與系統(tǒng)聚類分析可以看出二者耐低氮型種質(zhì)與中等耐低氮型種質(zhì)劃分較為一致，說明此綜合分析方法對于綜合評價披堿草的耐低氮性具有較高的可靠性。

4" 結(jié)論

與全氮處理組相比：低氮顯著降低了披堿草幼苗的株高，縮短了其根長；低氮顯著降低了披堿草幼苗的硝態(tài)氮含量、凈光合速率、蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度、氣孔導(dǎo)度、硝酸還原酶和谷氨酸合成酶活性以及可溶性糖含量；低氮顯著提高了谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶活性，同時顯著增加了超氧陰離子、過氧化氫以及可溶性蛋白的含量。

在22份披堿草種質(zhì)中，E17，E9為耐低氮型種質(zhì)。E12和E16為低氮敏感型種質(zhì)。

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（責(zé)任編輯" 劉婷婷）