摘要：TCP轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物多種生理過程，包括植物葉片發(fā)育、花發(fā)育、分枝的形成等方面。菊苣（Cichorium intybus L.）是一種優(yōu)良牧草，但目前還未有關(guān)于其TCP基因家族研究的報道。本研究基于菊苣全基因組數(shù)據(jù)，利用擬南芥（Arabidopsis thaliana）、生菜（Lactuca sativa L.）TCP基因家族的氨基酸序列，對菊苣TCP基因家族成員進(jìn)行鑒定篩選，最終得到39個菊苣TCP基因家族成員。接著利用生物信息學(xué)方法對這些成員進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，39個成員不均勻分布在9條染色體上；氨基酸數(shù)目為113～498，分子量為12 425.84～56 266.57Da；所有成員分為3個亞家族；均含有保守的basic-helix-loop-helix（bHLH）結(jié)構(gòu)域；順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，菊苣TCP家族成員具有多種激素、非生物脅迫和生長發(fā)育響應(yīng)元件；對CIN類TCP基因在菊苣各組織和高溫脅迫下進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，這些成員可能參與菊苣的葉片發(fā)育調(diào)控且對高溫脅迫響應(yīng)。本研究可以為改良菊苣牧草品質(zhì)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：TCP基因家族；菊苣；表達(dá)分析；家族分析

中圖分類號：Q949.783.5""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2428-12

Chicory TCP Gene Family Identification and Analysis

DU Yang1，2#， ZHANG Zhi-wei3#， LU Shuang1， LIU Xue2， LI Da-yong2，

XU Zhao-yang2， WANG Chen-chen2， ZHANG Bin2*，XU Li-xin1*

（1. College of Prataculture and Grassland， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China; 2. Institute of Vegetables，

Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100083， China;3. CCTEG Ecological Environment Technology

Co.， Ltd， Beijing 100020， China）

Abstract：The TCP gene family is involved in the regulation of a variety of physiological processes in plants，including plant leaf development，flower development，and branch formation. Chicory（Cichorium intybus L.） is an excellent forage，but no studies of its TCP gene family have been reported. Based on the whole genome data of chicory，the amino acid sequences of the Arabidopsis thaliana and Lactuca sativa L. TCP gene families were used to identify and screen the members of the chicory TCP gene family，and finally 39 chicory TCP gene family members were obtained. Then，bioinformatics methods were used to analyze these members and found that 39 members were unevenly distributed on 9 chromosomes. The number of amino acids is 113～498，and the molecular weight is 12 425.84～56 266.57 Da. All members contain conserved TCP domains，namely basic-helix-loop-helix（bHLH） domains，and are divided into 3 subfamilies. The analysis of cis-acting elements showed that members of the chicory TCP family had a variety of hormones，abiotic stress and growth and development response elements. The expression analysis of CIN class TCP genes in chicory tissues and under high temperature stress showed that these members may be involved in the regulation of leaf development and response to high temperature stress in chicory. This study can provide a theoretical basis for improving the quality of chicory forage.

Key words：TCP gene family;Cichorium intybus L.;Expression analysis;Family analysis

菊苣（Cichorium intybus L.），又稱歐洲菊苣，起源于地中海地區(qū)，是菊科（Asteraceae）菊苣屬（Cichorium）多年生草本植物，在20世紀(jì)70年代末期，引入我國開始種植。作為飼用牧草，菊苣具有礦物質(zhì)含量高、營養(yǎng)價值高、適口性好、易消化、生產(chǎn)率高和刈割后再生能力強等優(yōu)良特性［1-2］。其營養(yǎng)價值類似于苜蓿，含有較高的粗蛋白和能量，礦物質(zhì)含量甚至高于紫花苜蓿［3］。

TCP（Teosinte branched1/Cycloidea/Proliferating cell factor）基因家族被廣泛報道于很多物種，是一類非常重要的基因家族。家族成員均含有一個55～60堿基的TCP保守結(jié)構(gòu)域，即basic-helix-loop-helix（bHLH）結(jié)構(gòu)域［4］。依據(jù)這種結(jié)構(gòu)域的差別，可以將TCP家族分為兩個亞家族Class Ⅰ和Class Ⅱ，Class Ⅱ進(jìn)一步分為CIN和CYC/TB1兩個亞家族。Class Ⅰ亞族基因的調(diào)控作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)植物生長發(fā)育，但由于Class Ⅰ家族基因的冗余性導(dǎo)致其單突變體表型較弱甚至無表型，因此對于Class Ⅰ類基因家族的研究較少；Class Ⅱ亞族基因調(diào)控作用大多表現(xiàn)在抑制植物生長和細(xì)胞增殖［5］。Class Ⅱ亞族中的CIN類基因子集的AtTCP2，AtTCP3，AtTCP4，AtTCP10，AtTCP24均受microRNA319靶向抑制［6］。有研究分析了多毛番茄（S. habrochaites L.）和栽培番茄（S. lycopersicum L.）miR319家族在低溫和高溫脅迫下的表達(dá)特征，證實miR319a，b，c，d參與調(diào)控番茄耐高溫脅迫［7］。蘿卜（Raphanus Sativus L.）［8］和醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium L.）［9］中也有類似的報道。

已經(jīng)在多種物種中鑒定和分析了TCP家族，如煙草［10］、茄子［11］、荔枝［12］、刺槐［13］、紫花苜蓿［14］等。但目前還未見在菊苣中的TCP基因家族報道。TCP家族蛋白廣泛參與植物葉片形態(tài)建成［15］、脅迫響應(yīng)［16］、花發(fā)育［17］、激素調(diào)節(jié)［18］等生理生化活動，因此這些轉(zhuǎn)錄因子的研究對于提高菊苣的牧草品質(zhì)、對增強抗逆性有很大的幫助。

在我國，菊苣主要分布在中部和北部地區(qū)，而限制菊苣分布的主要因素之一就是溫度。菊苣植株生長的最適溫度一般在17～20℃之間，幼苗期的植株耐高溫能力稍強，生長適溫為20～25℃。有研究發(fā)現(xiàn)，高溫會誘導(dǎo)菊苣抽薹開花［19-20］，進(jìn)而影響其營養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)量，降低其作為牧草的品質(zhì)。因此，本文利用生物信息學(xué)的方法對菊苣的TCP蛋白家族成員進(jìn)行了鑒定篩選并分析，同時進(jìn)行了高溫脅迫下的表達(dá)模式分析，以期為研究TCPs對于植物應(yīng)對高溫的作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養(yǎng)

試驗在北京市農(nóng)林科學(xué)研究院蔬菜所（116°42′10.41″ E，39°42′1.35″ N）進(jìn)行，所用菊苣品種為‘普那’（K017）。挑選飽滿種子播種于濕濾紙上，進(jìn)行萌發(fā)；當(dāng)芽伸長約2 cm時，轉(zhuǎn)到蛭石∶營養(yǎng)土為3∶1比例的基質(zhì)中；5～6天后轉(zhuǎn)入大棚，自然培養(yǎng)。當(dāng)菊苣生長至抽薹開花，取其莖、老葉、幼葉、花、萼片和薹上葉；參考相關(guān)研究［19］，35℃高溫培養(yǎng)，取0 h，1 h，4 h，8 h，16 h和24 h的幼嫩葉片，立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以備后續(xù)實驗使用。

1.2 菊苣TCP基因家族鑒定及基本特征分析

在網(wǎng)站（ftp：//ftp.agis.org.cn/Inulin_plants/）下載菊苣全基因組數(shù)據(jù)；在TAIR（https：//www.arabidopsis.org）下載擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）TCP成員基因序列、蛋白編碼序列和全長氨基酸序列；在數(shù)據(jù)庫Phytozome v13（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/）下載生菜（Lactuca sativa L.） TCP成員基因序列、蛋白編碼序列和全長氨基酸序列。本文使用擬南芥和生菜的TCP基因家族成員的基因序列在菊苣全基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對，刪掉E值大于1e-16的基因；然后將序列上傳至在線分析軟件Batch CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi），刪掉不含TCP保守結(jié)構(gòu)域的基因，最終確定了39個菊苣TCP基因家族成員。利用psRNATaget（https：//www.zhaolab.org/psRNATarget/）網(wǎng)站對microRNA319靶基因進(jìn)行預(yù)測。使用TBtools［21］軟件獲得各成員在染色體上對應(yīng)的位置信息，并進(jìn)行可視化作圖。利用Prot Param（https：//web.expasy.org/protparam/）在線工具對39個TCP蛋白序列進(jìn)行分析，得出其蛋白分子量、理論等電點、氨基酸數(shù)量等理化性質(zhì)數(shù)據(jù)。通過在線工具WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp）對39個蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.3 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用已下載好的擬南芥TCP家族蛋白、生菜TCP家族蛋白與篩選好的39個菊苣TCP基因家族蛋白序列在MEGA7.0軟件中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。構(gòu)建時，選擇ClustalW進(jìn)行多序列比對，設(shè)置參數(shù)：鄰接法（Neighbor-Joining），Partial Deletion，P-distance，Bootstrap為1000次。

1.4 基因結(jié)構(gòu)，Domain，Motif分析

使用菊苣基因組GFF文件和篩選后的菊苣TCP家族的核苷酸序列，利用TBtools軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的分析。將菊苣39個TCP家族成員蛋白序列上傳至在線分析軟件Batch CD-Search進(jìn)行Domain分析；使用在線網(wǎng)站MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進(jìn)行Motif分析，motif數(shù)目設(shè)置為10。使用TBtools軟件對菊苣TCP家族基因結(jié)構(gòu)、Domain，Motif分析進(jìn)行可視化作圖。

1.5 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

將確定好的菊苣TCP家族成員蛋白序列依次上傳到蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)在線預(yù)測網(wǎng)站Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org），得到各成員的蛋白質(zhì)三維預(yù)測結(jié)構(gòu)。

1.6 順式作用元件分析

在網(wǎng)站下載菊苣全基因組序列與GFF文件，使用TBtools軟件，提取每個成員基因序列上游2 000 bp區(qū)域的序列。將其上傳至在線預(yù)測網(wǎng)站PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行預(yù)測。使用TBtools軟件對預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行可視化作圖。

1.7 熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析

選擇18S作為內(nèi)參基因，根據(jù)各成員CDS序列在在線網(wǎng)站設(shè)計引物（表1）。采集菊苣的莖、幼葉、老葉、花、萼片和薹上葉進(jìn)行RNA提取。RNA提取和實時熒光定量PCR預(yù)混液均采用南京諾唯贊公司試劑盒進(jìn)行，試驗方法以說明書為準(zhǔn)，RT-qPCR實驗以羅氏（Roche）LC480熒光定量PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)檢測。選用2-ΔΔCt方法［22］進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將每一個樣本技術(shù)重復(fù)3次，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊苣TCP基因家族鑒定及基本特征分析

本研究以擬南芥、生菜TCP蛋白序列為檢索序列，基于菊苣全基因組數(shù)據(jù)，共鑒定出39個菊苣TCP基因（表2）。同時，使用生菜microRNA319基因序列在菊苣基因組中blast出了3個基因。對菊苣TCP基因家族成員和blast出的菊苣microRNA319基因的染色體定位信息，進(jìn)行可視化作圖。39個TCP家族成員在菊苣9條染色體中呈不均勻分布（圖1）。其中，3號染色體擁有最多的TCP家族成員，有15個家族成員；4號染色體分布最少，僅有1個家族成員；其余染色體分布2～4個家族成員；microRNA319分布在1號、7號和9號染色體上，其靶基因分布在1號、3號、5號和7號染色體上。按照各成員在染色體上分布的位置順序進(jìn)行命名，將39個基因命名為CiTCP1～CiTCP39；microRNA319基因命名為MIR319A，MIR319B和MIR319C。對39個菊苣TCP基因家族成員的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：氨基酸數(shù)目為113（CiTCP21）～498（CiTCP30），對應(yīng)分子量為12 425.84～56 266.57Da；所有成員均為親水蛋白，且不穩(wěn)定系數(shù)均大于40；等電點介于4.13～10.13，亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示除CiTCP8位于細(xì)胞質(zhì)、CiTCP11位于葉綠體、CiTCP28位于線粒體外，其余成員均位于細(xì)胞核內(nèi)（表2）。

2.2 菊苣TCP家族基因蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究利用MEGA7.0軟件，對擬南芥、菊苣和生菜中被報道的TCP家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。參考擬南芥TCP基因家族的分類，將菊苣TCP家族分為Class Ⅰ和Class Ⅱ兩類，其中Class Ⅰ又稱PCF亞族，Class Ⅱ可進(jìn)一步劃分為兩個亞家族CIN，CYC/TB1。CIN，CYC/TB1亞家族中各有12個菊苣基因，PCF亞家族中則含有15個菊苣基因，是分布最多的亞家族。其中CiTCP13～18不止在染色體上的分布位置聚集，親緣關(guān)系也較為接近，推測其在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮相似的功能。

2.3 菊苣TCP家族Domain、基因結(jié)構(gòu)、Motif分析

利用TBtools軟件與在線工具對菊苣TCP家族進(jìn)行Domain、基因結(jié)構(gòu)和Motif分析。Domain分析發(fā)現(xiàn)，39個家族成員均含有TCP保守結(jié)構(gòu)域或TCP superfamily保守結(jié)構(gòu)域，說明39個成員均能發(fā)揮TCP結(jié)構(gòu)功能?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖3所示，菊苣TCP家族成員基因結(jié)構(gòu)較簡單，其中15個成員有內(nèi)含子，所有成員均不含UTR區(qū)。Motif分析發(fā)現(xiàn)，所有的成員均含有Motif 1結(jié)構(gòu)，說明Motif 1是TCP基因家族成員發(fā)揮功能的重要結(jié)構(gòu)。Motif 4僅在PCF亞族中出現(xiàn)，Motif 9僅在CYC/TB1亞族中出現(xiàn)，推測其可能是這兩個亞家族的特有結(jié)構(gòu)。

2.4 菊苣TCPs蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

上傳各成員蛋白序列至Swiss-Model在線工具，預(yù)測各成員的蛋白三維結(jié)構(gòu)模型（圖4）。其中CiTCP16，CiTCP21，CiTCP26，CiTCP39的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測的GMQE值低于0.4，預(yù)測結(jié)構(gòu)不可信。根據(jù)預(yù)測的結(jié)果，TCP家族蛋白均含有非典型的bHLH（basic-helix-loop-lelix）結(jié)構(gòu)。其中PCF作為TCP家族Class Ⅰ類中的分支，明顯比另兩個亞家族中的成員結(jié)構(gòu)堿性區(qū)短，CIN亞族堿性區(qū)比CYC/TB1亞族稍短但不明顯。

2.5 菊苣TCPs順式作用元件分析

順式作用元件在一定程度上可以反映基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。提取菊苣各成員上游2000 bp序列，上傳到PlantCARE網(wǎng)站進(jìn)行分析，利用TBtools進(jìn)行作圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菊苣TCP家族成員上游啟動子區(qū)域含有與5種激素有關(guān)的作用元件。有脫落酸響應(yīng)元件（31個成員）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（24個成員）、生長素響應(yīng)元件（19個成員）、赤霉素響應(yīng)元件（15個成員）、水楊酸響應(yīng)元件（12個成員）。

在脅迫方面，有厭氧誘導(dǎo)元件（34個成員）、干旱響應(yīng)元件（21個成員）、低溫響應(yīng)元件（19個成員）、防御和應(yīng)激作用元件（12個成員）。

在植物生長發(fā)育上，鑒定到的元件有晝夜節(jié)律控制元件（11個成員）、分生組織表達(dá)元件（12個成員）、MYBHv1結(jié)合位點作用元件（11個成員）。

綜上所述，菊苣TCP家族可能在植物激素調(diào)控、生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫方面發(fā)揮作用。

2.6 CIN類基因組織表達(dá)模式分析

本文對菊苣TCP基因家族中的CIN亞族中的基因進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果顯示如圖6。此子集基因在各組織中的表達(dá)量差異較大，各基因在莖的表達(dá)量都極低，甚至不表達(dá)，在幼葉、老葉、花和萼片中的表達(dá)量大不相同。CiTCP25，CiTCP26，CiTCP31，CiTCP38，CiTCP19在幼葉、老葉、花和萼片中的表達(dá)量相差不大；CiTCP2在老葉中的表達(dá)量較高；CiTCP8在老葉和萼片中的表達(dá)量要稍高于幼葉和花；CiTCP11在各部位的表達(dá)量相差不大，在老葉和花中的表達(dá)量稍高于幼葉和萼片部位的表達(dá)量；CiTCP20在萼片中的表達(dá)量稍高于幼葉、老葉和花部位的表達(dá)量；CiTCP30在花中的表達(dá)量明顯高于幼葉、老葉和萼片部位的表達(dá)量；CiTCP32在花中的表達(dá)量低于幼葉、老葉和萼片部位的表達(dá)量；CiTCP36在花、萼片中的表達(dá)量較高。各成員在薹上葉的表達(dá)量均高于在其他部位的表達(dá)量，可能與各成員參與葉片發(fā)育調(diào)控有關(guān)。

2.7 CIN類基因高溫脅迫下的表達(dá)模式分析

耐熱性較差是限制菊苣分布的重要因素，因而本文對菊苣進(jìn)行了高溫脅迫處理，對CIN亞族中的基因進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果顯示如圖7。各基因在高溫脅迫下的表達(dá)量均有不同程度的升高。除基因CiTCP26，CiTCP30表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢外，其余成員的表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢上升后下降的趨勢。這種變化區(qū)別可能是由于各成員對高溫脅迫的不同的響應(yīng)機制造成的。

3 討論

3.1 菊苣TCP家族基因的結(jié)構(gòu)特點及功能

本研究在菊苣中鑒定到39個家族成員，與其他植物TCP家族成員［10-14］數(shù)量相比偏多，這可能與不同物種之間的基因擴張程度有關(guān)［7］。

本研究參考模式植物擬南芥的分類，將菊苣的TCP家族成員分為3個亞類：Class I（PCF），Class II（CIN）和Class II（CYC/TB1），這與前人的研究結(jié)果一致。根據(jù)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果，聚類分析越是相近的基因，說明功能和結(jié)構(gòu)越相似。保守基序的結(jié)果顯示，在39個CiTCPs基因中，菊苣TCP基因家族的不同亞族之間的保守基序存在差異，基因家族結(jié)構(gòu)上的統(tǒng)一性和變異性，為菊苣TCP家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用提供了多樣性。菊苣TCP基因家族包含了大量的順式作用元件、有5種激素響應(yīng)元件，脅迫相關(guān)響應(yīng)元件和生長發(fā)育相關(guān)元件。有研究探討了栽培番茄和多毛番茄microRNA319在溫度脅迫中發(fā)揮的功能，高溫脅迫下，早期（1 h）miR319a，b，d表達(dá)量提高，抑制TCP3，TCP29和TCP2的表達(dá)，microRNA319可以提高植物應(yīng)對溫度脅迫的能力［7］。對水稻中TCP5基因的研究發(fā)現(xiàn)，其對于植物干旱和鹽脅迫有所響應(yīng)［23］。植物形態(tài)結(jié)構(gòu)與植物激素之間的相互作用可以提高植物抗逆性，TCP4可能通過調(diào)控主根伸長參與了干旱脅迫響應(yīng)［24］。這些研究與本文順式作用元件的結(jié)果一致，說明TCP基因家族的表達(dá)可能受植物生長發(fā)育、激素和環(huán)境脅迫的調(diào)控。

3.2 菊苣CIN類TCP家族基因的表達(dá)特點

TCP基因家族已經(jīng)被很多研究證實參與植物的生長發(fā)育。microRNA319靶基因CiTCP2，CiTCP8，CiTCP25，CiTCP26，CiTCP30和CiTC-P32均為CIN亞族基因，因此本文選擇了CIN類基因，對其在不同組織和高溫脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各成員在薹上葉組織中的基因表達(dá)量均較高；CiTCP2，CiTCP8，CiTCP11，CiT-CP32，CiTCP36在老葉、幼葉、萼片中的表達(dá)量也比其他組織高，說明這些基因可能在葉片發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。AtTCP5參與調(diào)控葉邊緣形態(tài)［25］，TCP4可以調(diào)控子葉毛狀體的發(fā)育［26］等研究都說明，這些CIN類的TCP基因可能對葉片的形態(tài)構(gòu)成有重要的調(diào)控作用。

王利彬［27］對大豆在高溫脅迫應(yīng)答中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了篩選，確定TCP對高溫有所響應(yīng)。在本文中，高溫脅迫下大部分成員表達(dá)量均上升，在升至最高點后，呈現(xiàn)下降趨勢。其中，除CiTCP26，CiTCP30外其余基因表達(dá)變化趨勢較為相似，變化較為平緩，推測它們應(yīng)對高溫脅迫的響應(yīng)機制類似。這可能與TCP基因功能存在高度的冗余有關(guān)。CiTCP2，CiTCP8，CiTCP25，CiTCP26，CiTCP30和CiTCP32為miR319的靶基因，miR319對于靶基因的調(diào)控為負(fù)調(diào)控［15］，番茄中miR319a，b，d在熱處理下的表達(dá)量呈現(xiàn)由高到低的變化，miR319c表達(dá)量下調(diào)［7］，這與本文中這些基因的表達(dá)變化一致。

4 結(jié)論

本研究確定了菊苣39個TCP家族成員，并對這些成員基因進(jìn)行分析，初步探明了其可能會在植物中發(fā)揮的功能。接著對CIN類的成員在各組織和高溫脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了探究，結(jié)果顯示，TCP家族CIN類成員在不同組織中表達(dá)各異，主要參與葉片發(fā)育調(diào)控；各成員均對高溫脅迫有不同程度的響應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）