摘要：為探究褪黑素預(yù)處理對(duì)紫花苜蓿（Medicago sativa L.）幼苗抗旱性的影響，本試驗(yàn)以‘中苜一號(hào)’紫花苜蓿為材料，設(shè)置4個(gè)聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）濃度和5個(gè)褪黑素濃度進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，分別篩選出最佳的PEG和褪黑素濃度來(lái)處理紫花苜蓿幼苗，觀測(cè)處理前后紫花苜蓿幼苗的表型及生理指標(biāo)。結(jié)果表明，50 μmol·L-1和100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理能有效提高10% PEG模擬干旱脅迫下紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、幼苗鮮重及根長(zhǎng)；50 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理顯著提高了干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的葉片含水量、可溶性糖含量和脯氨酸含量，另外，電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量均顯著降低，抗氧化酶合成相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，抗氧化酶活性增強(qiáng)。本研究驗(yàn)證了適宜濃度的褪黑素處理能有效緩解干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗造成的損傷，增強(qiáng)紫花苜蓿幼苗的抗旱性，為褪黑素在紫花苜蓿耐旱栽培中的合理使用提供了一定的參考。

關(guān)鍵詞：褪黑素；干旱脅迫；紫花苜蓿；生理響應(yīng)

中圖分類號(hào)：S541.9""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）08-2575-09

Effect of Melatonin on Seed Germination and Physiological

Characteristics of Alfalfa Seedlings under Drought Dress

HUANG Jie-qiong， ZHAI Jia-xing， WANG Ying， CEN Hui-fang*，

ZHU Hui-sen*， XU Tao， XIA Fang-shan

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：To explore the impact of melatonin pretreatment on the drought resistance of alfalfa （Medicago sativa L.） seedlings，this experiment used ‘Zhonglu No.1’ alfalfa as the material，and set up 4 concentrations of polyethylene glycol and 5 concentrations of melatonin for germination experiments. Select the optimal concentrations of PEG and melatonin to treat alfalfa seedlings，and observe the phenotype and physiological indicators of alfalfa seedlings before and after treatment. The results showed that the seed germination rate，fresh weight and root length of seedlings were improved with 50 μmol·L-1 and 100 μmol·L-1 melatonin pretreatments under drought stress simulated by 10% PEG. Pretreatment with 50 μmol·L-1 melatonin significantly increased the leaf water content，soluble sugar content and proline content of alfalfa seedlings under drought stress. Additionally，the electrolyte leakage and malondialdehyde content were significantly decreased，and the expression levels of genes related to antioxidant enzyme synthesis were significantly upregulated，leading to enhanced antioxidant enzyme activity. In this study，we verified that melatonin pretreatment at appropriate concentrations could effectively alleviate the damage caused by drought stress on alfalfa seedlings and enhance the drought resistance of alfalfa seedlings，which might provide a certain reference for the rational use of melatonin in drought-tolerant cultivation of alfalfa.

Key words：Melatonin;Drought stress;Alfalfa;Physiological response

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為一種多年生豆科牧草，具有蛋白質(zhì)含量高、適口性強(qiáng)、易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)［1-2］，可以用作重要的蛋白質(zhì)飼料，因此被廣泛種植于美國(guó)、歐洲以及亞洲等地區(qū)，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義［3］。然而紫花苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育往往會(huì)受到環(huán)境的影響，干旱、鹽堿、高溫及重金屬離子等非生物脅迫均會(huì)導(dǎo)致紫花苜蓿品質(zhì)和產(chǎn)量的下降，這給苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展帶來(lái)了巨大的阻礙［4-6］。在我國(guó)，紫花苜蓿的主要種植區(qū)集中于華北、西北等地，這些地區(qū)干旱少雨，水分成為影響紫花苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育的首要因素。當(dāng)干旱脅迫達(dá)到一定閾值時(shí)，會(huì)顯著抑制作物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，嚴(yán)重的情況下會(huì)導(dǎo)致作物大幅減產(chǎn)，甚至發(fā)生植株死亡的現(xiàn)象［7］。因此，提高紫花苜蓿的抗旱性，降低干旱脅迫對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響一直是促進(jìn)紫花苜蓿種植業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要研究方向，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有著舉足輕重的意義。

褪黑素（Melatonin，MT）又稱褪黑激素、松果體素等，是一種生命必需的小分子吲哚胺類物質(zhì)，在植物中作用十分廣泛，它能夠調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物抗逆性，維持細(xì)胞膜完整性，防止葉綠素降解，調(diào)節(jié)植物晝夜節(jié)律、光周期等［8］。據(jù)報(bào)道，褪黑素引發(fā)能夠顯著提高棉花（Gossypium hirsutum L.）種子在干旱條件下的發(fā)芽率，提高幼苗對(duì)干旱脅迫的抗性［9］；在NaCl脅迫下，外源褪黑素能夠增強(qiáng)老芒麥（Elymus sibiricus L.）的抗氧化酶活性，并清除體內(nèi)過(guò)量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），抑制細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化，以此提高老芒麥幼苗的耐鹽性［10］。褪黑素處理能夠上調(diào)高溫脅迫下多年生黑麥草（Lolium perenne L.）根系褪黑素合成基因表達(dá)，提高內(nèi)源褪黑素含量，增強(qiáng)抗氧化酶活性，降低多年生黑麥草在高溫脅迫下受到的氧化損傷，同時(shí)提高滲透調(diào)節(jié)能力以增強(qiáng)多年生黑麥草的耐熱性［11］。鋁脅迫會(huì)使紫花苜蓿幼苗的根系受損傷而產(chǎn)生大量丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和過(guò)氧化氫（H2O2），影響紫花苜蓿幼苗的正常生長(zhǎng)，研究發(fā)現(xiàn)使用100～800 μmol·L-1褪黑素溶液處理能夠有效緩解鋁脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗造成的損傷，增強(qiáng)紫花苜蓿幼苗抵抗鋁脅迫的能力［12］。外源噴施0.2 mmol·L-1褪黑素能有效緩解干旱脅迫下煙草幼苗受到的脅迫損傷，能夠通過(guò)增強(qiáng)光合碳同化酶活性，調(diào)節(jié)葉片內(nèi)源激素和碳水化合物的代謝，從而緩解干旱脅迫對(duì)植物造成的傷害，增強(qiáng)煙草幼苗的抗旱性［13］。另外，外源噴施50 μmol·L-1褪黑素能夠有效調(diào)節(jié)玉米幼苗地上部和地下部的抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)能力，同時(shí)提高玉米幼苗地上部和地下部的生物量和伸長(zhǎng)量，減輕干旱脅迫對(duì)玉米根系構(gòu)型的影響［14］。

近年來(lái)，已經(jīng)有許多研究探索了提高紫花苜?？购敌缘母鞣N途徑，但關(guān)于外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生理特性影響的報(bào)道較少。本研究以‘中苜一號(hào)’紫花苜蓿為材料，探索外源褪黑素預(yù)處理對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗抗氧化特性的影響，以期為后續(xù)褪黑素在紫花苜蓿耐旱栽培中的合理使用提供一定的參考，也為紫花苜蓿的抗旱育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取‘中苜一號(hào)’紫花苜蓿為材料，種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.2 干旱脅迫下紫花苜蓿種子的萌發(fā)情況

選取大小相似、籽粒飽滿的紫花苜蓿種子，使用75%乙醇浸泡消毒1 min，蒸餾水沖洗3～5次，于濾紙上自然晾干。使用聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）溶液處理紫花苜蓿種子來(lái)模擬干旱脅迫，分別設(shè)置濃度為0，5%，10%，15% 的PEG-6000溶液，以雙層濾紙為發(fā)芽床進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，分別使用上述濃度的PEG溶液浸潤(rùn)濾紙后鋪入一次性培養(yǎng)皿中，均勻地?cái)[放50粒種子，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（恒溫20℃、16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度12 000 Lux）。每天定時(shí)稱重補(bǔ)充水分，記錄10 d內(nèi)種子的發(fā)芽情況。

1.3 褪黑素預(yù)處理對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

選取大小相似、籽粒飽滿的紫花苜蓿種子，使用75%乙醇浸泡消毒1 min，蒸餾水沖洗3～5次，分別使用0，50，100，500，1000 μmol·L-1的褪黑素溶液低溫（4℃）浸泡12 h，蒸餾水沖洗3～5次，于濾紙上自然晾干。以雙層濾紙為發(fā)芽床進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，使用10%的PEG-6000溶液浸潤(rùn)濾紙后鋪入一次性培養(yǎng)皿中，均勻擺放50粒種子，以蒸餾水浸潤(rùn)濾紙作發(fā)芽床為對(duì)照CK，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（恒溫20℃、16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度12 000 Lux）。每天定時(shí)稱重補(bǔ)充水分，保持PEG濃度相對(duì)穩(wěn)定，記錄10 d內(nèi)種子的發(fā)芽情況。

1.4 褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響

選取健康飽滿的紫花苜蓿種子種植于混合營(yíng)養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土∶沙∶蛭石= 2∶1∶1）中，于溫室中恒溫培養(yǎng)［（25±2）℃，16 h光照/8 h黑暗］至株高約20 cm。設(shè)置四個(gè)不同處理：葉面噴施0.4%乙醇后正常條件培養(yǎng)（WT）；葉面噴施0.4%乙醇后干旱培養(yǎng)（D）；葉面噴施50 μmol·L-1褪黑素（使用0.4%乙醇溶解）后正常條件培養(yǎng)（MT）；葉面噴施50 μmol·L-1褪黑素后干旱培養(yǎng)（MT+D）。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。乙醇溶液及褪黑素溶液于每天18：00進(jìn)行噴施，每組噴施量均為50 mL，使苜蓿葉片均勻掛珠，共處理3天，期間各組正常澆水，噴施結(jié)束后，CK和MT處理正常條件培養(yǎng)，D及MT+D處理停止?jié)菜囵B(yǎng)至各組間出現(xiàn)較明顯差異。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 以胚根大于種子長(zhǎng)度1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，直到第10 d發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取10株幼苗測(cè)量根長(zhǎng)及鮮重并計(jì)算平均值。按照以下公式計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽勢(shì)=第4 d正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽率=第10 d正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/t），Gt為在第t日的發(fā)芽數(shù)，t為相應(yīng)天數(shù)。

1.5.2 幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定 相對(duì)含水量（Relative water content，RWC）測(cè)定采用稱重法，取紫花苜蓿葉片稱取鮮重（Fresh weight，F(xiàn)W）、干重（Dry weight，DW）及飽和鮮重（Saturated fresh weight，SFW），相對(duì)含水量=（鮮重-干重）/（飽和鮮重-干重）［15］。

電解質(zhì)滲透率（Electrolyte leakage，EL）測(cè)定采用電導(dǎo)儀法，取紫花苜蓿葉片約0.2 g，加入蒸餾水后搖床震蕩24 h測(cè)定初始電導(dǎo)率；130℃高溫處理20 min后搖床震蕩24 h測(cè)定終電導(dǎo)率［16］，電解質(zhì)滲透率=初始電導(dǎo)率/終電導(dǎo)率×100%［16］。

可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法，取紫花苜蓿葉片約0.5 g制備勻漿，95℃水浴后室溫離心取上清為提取液，加入蒽酮乙酸乙酯溶液和濃硫酸在95℃下水浴10 min，冷卻至室溫后在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值［16］。

脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮比色法，取紫花苜蓿葉片約0.5 g，用磺基水楊酸進(jìn)行提取，與冰醋酸及酸性茚三酮反應(yīng)后使用甲苯進(jìn)行萃取，取上層紅色液體在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值［16］。

MDA含量、H2O2含量、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性及過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性均使用試劑盒（A003-1-2；A007-1-1；A084-3-1；A001-1-2；A007-1-1）進(jìn)行測(cè)定，上述試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5.3 干旱響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)分析 干旱脅迫后，選取0.1 g各處理下紫花苜蓿幼苗相同部位的成熟葉片提取總RNA，所用通用型植物RNA提取試劑盒（ZH120）購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司，利用Nanodrop2000檢測(cè)提取出的RNA的質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以紫花苜蓿Actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況，所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser（Code No. RR047A）及熒光定量試劑盒Takara TB Green Premix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）（Code No. RR420A）均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（TAKARA），反應(yīng)體系及程序參考試劑盒所附使用說(shuō)明書(shū)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量，所用到的引物序列見(jiàn)下表1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和計(jì)算，使用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 9.5.1進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PEG對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

在使用不同濃度PEG-6000模擬的干旱脅迫下對(duì)紫花苜蓿種子進(jìn)行發(fā)芽處理。如圖1所示，在10%和15%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及幼苗鮮重、根長(zhǎng)相較于對(duì)照組均顯著降低（Plt;0.05）；在5%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發(fā)芽指數(shù)、幼苗鮮重和根長(zhǎng)較對(duì)照組顯著降低（Plt;0.05），發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。其中，在10%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率為58.67%，相較對(duì)照組降低了41.33%，而15%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率僅為30%，因此選用該濃度作為后續(xù)紫花苜蓿種子發(fā)芽過(guò)程中模擬干旱脅迫的最適濃度。

2.2 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

如圖2所示，不同濃度褪黑素預(yù)處理對(duì)PEG模擬干旱脅迫下紫花苜蓿種子的萌發(fā)存在不同程度的影響。在10%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗鮮重和根長(zhǎng)與對(duì)照組相比顯著降低（Plt;0.05），但經(jīng)過(guò)不同濃度（50，100，500，1000 μmol·L-1）的褪黑素溶液預(yù)處理后，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、鮮重及根長(zhǎng)均有顯著提升（Plt;0.05），其中，50 μmol·L-1褪黑素溶液預(yù)處理后紫花苜蓿種子在干旱脅迫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及根長(zhǎng)達(dá)到最高；100 μmol·L-1褪黑素溶液預(yù)處理后幼苗鮮重達(dá)到最高。因此，選用50 μmol·L-1作為后續(xù)干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗褪黑素預(yù)處理的最佳濃度。

2.3 外源褪黑素預(yù)處理對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

據(jù)報(bào)道，褪黑素能夠調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物抗逆性，減輕植物在逆境脅迫下受損傷的程度。本研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫處理前，外源噴施褪黑素對(duì)紫花苜蓿幼苗的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，而在干旱脅迫10 d后，未經(jīng)褪黑素預(yù)處理（D）的紫花苜蓿幼苗葉片明顯萎蔫、干枯，經(jīng)過(guò)外源褪黑素預(yù)處理（MT+D）的紫花苜蓿幼苗植株萎蔫程度明顯較輕（圖3A）。測(cè)定干旱脅迫10 d后各組紫花苜蓿幼苗的葉片相對(duì)含水量，發(fā)現(xiàn)褪黑素預(yù)處理（MT+D）組植株葉片相對(duì)含水量為65.91%，顯著高于未經(jīng)褪黑素處理（D）組植株的24.89%（Plt;0.05）；而正常培養(yǎng)條件下褪黑素預(yù)處理對(duì)紫花苜蓿幼苗的葉片含水量無(wú)顯著影響（圖3B）。

2.4 外源褪黑素預(yù)處理對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗膜透性的影響

干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜透性增加，造成電解質(zhì)外滲。可溶性糖和脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有助于維持細(xì)胞的滲透平衡，緩解植物受到的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的電解質(zhì)滲透率和脯氨酸含量較正常條件顯著增加。在干旱脅迫下，經(jīng)過(guò)褪黑素預(yù)處理能夠顯著降低紫花苜蓿幼苗的電解質(zhì)滲透率，MT+D組紫花苜蓿幼苗的電解質(zhì)滲透率為13.97%，顯著低于D組的29.16%（Plt;0.05）（圖4A）；褪黑素預(yù)處理能夠顯著提高紫花苜蓿在干旱脅迫下的可溶性糖和脯氨酸含量，干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的可溶性糖含量較正常條件顯著降低，而經(jīng)過(guò)褪黑素預(yù)處理后紫花苜蓿幼苗的可溶性糖含量與正常條件差異不顯著（圖4B），干旱脅迫下經(jīng)過(guò)褪黑素預(yù)處理的紫花苜蓿幼苗脯氨酸含量為309.07 μg·g-1 FW，顯著高于D組的253.33 μg·g-1 FW（Plt;0.05）（圖4C）。

2.5 外源褪黑素預(yù)處理對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗抗氧化特性的影響

干旱脅迫會(huì)引起植物體內(nèi)活性氧的過(guò)量積累，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化。通常植物會(huì)通過(guò)增加抗氧化酶的活性來(lái)清除過(guò)量的活性氧，以減輕細(xì)胞的氧化損傷，從而適應(yīng)干旱環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的丙二醛和過(guò)氧化氫含量較正常條件顯著增加（Plt;0.05）。干旱脅迫下，紫花苜蓿幼苗的丙二醛含量為5.58 μmol·g-1 FW，經(jīng)過(guò)50 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理后紫花苜蓿幼苗的丙二醛含量顯著降低，僅為3.53 μmol·g-1 FW（圖5A）。同樣，在干旱脅迫下，紫花苜蓿幼苗的H2O2含量為11.21 μmol·g-1 FW，經(jīng)過(guò)褪黑素預(yù)處理后紫花苜蓿幼苗的H2O2含量顯著降低，僅為7.70 μmol·g-1 FW（Plt;0.05）（圖5B），說(shuō)明褪黑素處理能顯著降低紫花苜蓿在干旱脅迫下的膜脂過(guò)氧化程度，減少活性氧的積累。在干旱脅迫下，紫花苜蓿幼苗的CAT，SOD，POD等抗氧化酶活性較正常條件顯著提高，但經(jīng)過(guò)褪黑素預(yù)處理后的紫花苜蓿幼苗的CAT，SOD，POD酶活性均顯著高于未經(jīng)褪黑素預(yù)處理的紫花苜蓿植株，分別提高了43.17%，13.45%和21.06%（Plt;0.05）（圖5C-5E）。

2.6 外源褪黑素預(yù)處理對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗干旱響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗抗逆性的影響，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同處理下紫花苜蓿幼苗葉片中編碼抗氧化酶的基因及褪黑素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，50 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理能夠使紫花苜蓿中CAT，CuZn-SOD，APX基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比，均顯著上調(diào)，分別上調(diào)了39.73%，38.16%和17.31%，褪黑素合成相關(guān)基因TDC基因表達(dá)量上調(diào)23.65%（Plt;0.05）（圖6）。

3 討論

水是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，能夠?yàn)橹参锾峁┧璧酿B(yǎng)分、維持植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能、參與植物的新陳代謝、調(diào)節(jié)植物的溫度，對(duì)植物的生命活動(dòng)至關(guān)重要。植物在生命活動(dòng)過(guò)程中水分供應(yīng)不足會(huì)嚴(yán)重影響種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植株萎蔫甚至死亡［17］。大量研究表明，外源施加特定的植物激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有助于緩解植物在逆境條件下受到的損傷，增強(qiáng)植物對(duì)各種非生物脅迫的耐受性。外源0.125 mmol·L-1水楊酸（Salicylic acid，SA）引發(fā)能夠有效促進(jìn)干旱脅迫下甜高粱（Sorghum bicolor L.）種子的萌發(fā)［18］；使用赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（indole-3-acetic acid）及6-芐基氨基嘌呤（6-BA）引發(fā)處理能有效提高干旱脅迫下玉米（Zea mays L.）種子的發(fā)芽率［19］。20 μmol·L-1褪黑素處理有助于促進(jìn)低溫脅迫下棉花種子萌發(fā)和胚根伸長(zhǎng)，提高抗氧化酶活性，減少M(fèi)DA和H2O2的積累，降低細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，增強(qiáng)棉花對(duì)低溫環(huán)境的抵抗能力［20］。與這些研究一致，本研究中使用50 μmol·L-1褪黑素對(duì)紫花苜蓿種子進(jìn)行預(yù)處理，有效促進(jìn)了種子在干旱脅迫條件下的萌發(fā)以及幼苗的生長(zhǎng)；另外，使用50 μmol·L-1褪黑素對(duì)2月齡紫花苜蓿幼苗進(jìn)行噴施處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)褪黑素預(yù)處理的紫花苜蓿幼苗在干旱脅迫下的萎蔫程度明顯小于未經(jīng)處理的幼苗，葉片含水量也有顯著的提升。在干旱脅迫下維持細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性是植物抗旱性體現(xiàn)的重要組成部分，為了減緩細(xì)胞干旱條件下失水導(dǎo)致的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡［21］。本研究中，在干旱脅迫下，經(jīng)過(guò)50 μmol·L-1褪黑素溶液預(yù)處理的紫花苜蓿幼苗體內(nèi)累積大量可溶性糖和脯氨酸，顯著降低了葉片的電解質(zhì)滲透率，表明外源施加褪黑素可以通過(guò)增加紫花苜蓿體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，進(jìn)而提高紫花苜蓿幼苗對(duì)干旱脅迫的耐受性。

植物抗氧化酶系統(tǒng)是植物體內(nèi)的一種保護(hù)機(jī)制，用于清除持續(xù)的干旱脅迫在植物體內(nèi)累積的活性氧分子，防止其對(duì)細(xì)胞和組織造成損傷。在環(huán)境脅迫下，植物可以通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)來(lái)增加抗氧化酶的產(chǎn)量，增加抗氧化酶的合成和活性［22］。隨著干旱程度的增加，大豆（Glycine max L.）植株中POD，CAT活性呈先升后降的趨勢(shì)，復(fù)水后又逐步下降至對(duì)照組水平［23］。對(duì)甜高粱幼苗的研究表明，褪黑素可顯著降低干旱脅迫下甜高粱葉片MDA含量，積累更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，提高葉片含水量，顯著提高葉片POD和硝酸還原酶活性，通過(guò)增強(qiáng)植物的抗氧化酶活性，從而提高了其對(duì)干旱脅迫的抵抗力［24］。本研究中，在干旱脅迫下，使用50 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理后，紫花苜蓿幼苗葉片中MDA含量顯著下降，H2O2積累量減少，抗氧化酶（CAT，POD及SOD）的活性較對(duì)照顯著提高。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，干旱脅迫下，外源褪黑素能夠誘導(dǎo)紫花苜蓿中編碼抗氧化酶合成的基因CAT，CuZn-SOD，APX及褪黑素合成關(guān)鍵基因TDC的上調(diào)表達(dá)，表明褪黑素能夠通過(guò)提高干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗編碼抗氧化酶生物合成基因的表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化酶活性，提高紫花苜蓿幼苗的抗旱性。本研究篩選出了外源噴施較為適宜的褪黑素濃度，能夠?yàn)樘岣咦匣ㄜ俎？购敌蕴峁┮欢ǖ膮⒖家罁?jù)，為后續(xù)深入研究褪黑素在紫花苜蓿培育中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在PEG模擬的干旱脅迫下，‘中苜一號(hào)’紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和鮮重隨著PEG濃度的升高而降低，使用不同濃度（50，100，500，1000 μmol·L-1）褪黑素溶液對(duì)紫花苜蓿種子進(jìn)行浸種處理均能緩解干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響，其中褪黑素溶液濃度為50 μmol·L-1時(shí)效果最佳。葉面噴施50 μmol·L-1褪黑素能夠通過(guò)增加植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量維持滲透平衡，并通過(guò)調(diào)控紫花苜蓿幼苗抗氧化酶生物合成基因表達(dá)水平，增強(qiáng)抗氧化酶活性，進(jìn)而提高紫花苜蓿幼苗對(duì)干旱脅迫的耐受性。本研究為褪黑素在紫花苜蓿耐旱栽培中的合理運(yùn)用提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）