摘要：為明確產褐黃色鏈霉菌HEBRC45958菌株對番茄棒孢葉斑病的防控效果，采用平板對峙培養(yǎng)結合光學顯微鏡和掃描電鏡觀察確定HEBRC45958離體抑菌活性，并測定其產鐵載體能力和水解酶活性。同時采用盆栽試驗確定HEBRC45958發(fā)酵液對番茄棒孢葉斑病防控效果。結果表明，對峙培養(yǎng)條件下 HEBRC45958對多主棒孢的抑菌率為52.65%。掃描電鏡下觀察，與對照相比，HEBRC45958處理后多主棒孢菌絲發(fā)生扭曲和破裂，透射電鏡下觀察，多主棒孢細胞膜和細胞壁距離增加。HEBRC45958菌株能產生淀粉酶、纖維素酶、幾丁質酶和嗜鐵素。盆栽試驗結果表明，HEBRC45958發(fā)酵液對番茄棒孢葉斑病的防效為100%，具有較好的生防應用前景。

關鍵詞：產褐黃色鏈霉菌；番茄；多主棒孢；防效

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0416

中圖分類號：S476 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）11013607

由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的番茄棒孢葉斑病是番茄的一種重要病害，其寄主廣泛，可侵染380個屬內的500多種植物，包括黃瓜、辣椒、橡膠和一品紅等經濟作物[1]。該病害最早在美國佛羅里達地區(qū)爆發(fā)，隨后在日本和韓國等地也相繼發(fā)生。由于其寄主廣泛、侵染力強、傳播途徑多樣，加之近些年我國設施蔬菜面積不斷擴大，高溫高濕等環(huán)境為番茄棒孢葉斑病的發(fā)生提供了條件，在我國山東、海南和北京等地區(qū)大面積發(fā)生，嚴重影響了番茄生產[23]。目前棒孢葉斑病的防控主要依靠化學殺菌劑，然而，隨著殺菌劑的大量使用，多主棒孢出現了嚴重的抗藥性，如對多菌靈、啶酰菌胺和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑均產生嚴重的抗藥性[4-8]；另外，化學殺菌劑的大量使用會造成農藥殘留和環(huán)境污染，亟需更為安全有效的防控手段。

由于生物防控更安全，在作物病害防控中得到了廣泛應用。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）ZF2 菌株和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZF57菌株對黃瓜棒孢葉斑病具有良好的防控效果[910]；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）NBF809菌株和死亡谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）NBIF001菌株對番茄棒孢葉斑病具有良好的防控效果[1112]。前人關于棒孢葉斑病的生物防控研究主要集中于芽孢桿菌，而對鏈霉菌（Streptomycete）防控棒孢葉斑病的報道較少。鏈霉菌作為重要的生防微生物，可以產生多種抗生素、植物激素、水解酶等抑菌活性物質，對防控病害和提高植物抗病性具有重要作用，是創(chuàng)制新型生物農藥的重要資源。本研究從番茄根際土壤中分離出一株對多種植物病原真菌具有良好抑菌效果的產褐黃色鏈霉菌（Streptomycesphaeoluteichromatogenes）HEBRC45958，菌種保藏號為CCTCC NO：M2015768，進一步分析其對番茄棒孢葉斑病的防控效果和抑菌機理，以期為生物農藥的開發(fā)與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為多主棒孢（Corynespora cassiicola）和產褐黃色鏈霉菌（S. phaeoluteichromatogenes）HEBRC45958，均由湖北省生物農藥工程研究中心分離和保藏。供試藥劑為50%啶酰菌胺水分散粒劑，由巴斯夫歐洲公司生產。供試番茄品種為‘中雜109’，由中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 HEBRC45958菌株抑菌譜測定 HEBRC45958菌株從高氏1號斜面活化至高氏1號平板，瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum） 、辣椒疫霉（Phytophthora capsici） 、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、多主棒孢（C. cassiicola）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）共7 種植物病原菌由湖北省生物農藥工程研究中心分離保藏，從馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）斜面活化至PDA 平板備用。用直徑4 mm 打孔器打取HEBRC45958 菌餅，置于PDA 平板上、下、左、右4 個點，距離中心約30 mm，48 h后打取病原菌菌餅置于平板中央，以不加HEBRC45958 菌株作為對照，每個處理設3個重復，待對照菌落長滿培養(yǎng)皿時測量菌落直徑，并計算抑菌率，公式如下。

1.2.2 HEBRC45958菌株對多主棒孢菌絲作用觀察 從對峙培養(yǎng)的平板抑菌帶邊緣和對照菌落邊緣挑取多主棒孢菌絲，掃描電鏡和透射電鏡菌絲處理參考Li等[13]的方法，觀察菌絲形態(tài)和細胞結構的變化。

1.2.3 產嗜鐵素和水解酶活性測定 產嗜鐵素活性測定：使用打孔器打取HEBRC45958菌餅接種于CAS培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后觀察是否產生黃色暈圈[14]。產水解酶活性測定：將HEBRC45958菌株分別接種于幾丁質、酪蛋白、羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose，CMC）、淀粉和茯苓粉培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后觀察是否產透明圈[1516]。其中，酪蛋白平板需在培養(yǎng)后加入10%三氯乙酸；CMC平板需加入1 g·L-1剛果紅染1 h后，倒掉染液，再用1 mol·L-1 NaCl溶液浸泡1 h；淀粉平板需加入2.5% 盧氏碘液，浸泡15 min后倒掉，用無菌水沖洗。

1.2.4 HEBRC45958菌株對番茄棒孢葉斑病的防效測定 將番茄種子催芽后播種于32孔穴盤中，溫室常規(guī)管理30 d。按照Miyamoto等[17]方法制備多主棒孢病原菌孢子。將斜面病原菌活化至PDA平板，在25 ℃黑暗培養(yǎng)10 d，用無菌手術刀片刮去表面氣生菌絲，隨后在BLB（black lightblue）燈下繼續(xù)培養(yǎng)3 d使其產孢。刷取孢子并用無菌水調至104 CFU·mL-1備用。

將HEBRC45958菌株孢子從斜面培養(yǎng)基劃線至高氏1號平板培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后用4 mm打孔器打取菌餅至ISP2液體培養(yǎng)基，500 mL三角瓶裝入100 mL ISP2 液體，搖床180 r·min-1，28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d作為種子液，隨后按5%體積接入ISP2 液體培養(yǎng)基，500 mL 三角瓶裝入100 mLISP2液體，搖床180 r·min-1，28 ℃振蕩培養(yǎng)7 d備用。將發(fā)酵液原液及25和50倍稀釋液均勻噴施番茄葉面至飽和，以有效成分333.3 μg·mL-1啶酰菌胺作為對照藥劑，無菌水作為空白對照。每處理3次重復，每重復16棵番茄。24 h后噴霧接種病原菌孢子懸浮液，28 ℃保濕培養(yǎng)4 d后統計各處理病情指數并計算防效。分級標準按照Ishii等[18]方法。

1.3 數據分析

使用SPSS 13.0軟件進行試驗數據的整理及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 HEBRC45958 菌株對植物病原菌離體抑菌效果

在供試的幾種病原菌中，HEBRC45958菌株對灰葡萄孢、多主棒孢和核盤菌的抑菌活性較好，抑菌率分別達到59.63%、52.65%和53.33%；對辣椒疫霉及尖孢鐮刀菌無抑菌活性（表1）。HEBRC45958菌株對峙的多主棒孢菌落邊緣氣生菌絲稀疏（圖1）。

2.2 HEBRC45958 菌株對多主棒孢菌絲作用分析

在掃描電鏡下觀察，與對照相比，經HEBRC45958處理后多主棒孢菌絲出現扭曲和破裂（圖2）。透射電鏡下觀察，與對照相比，經HEBRC45958 處理后多主棒孢菌細胞壁外層加厚，細胞壁和細胞膜間距變大（圖3）。

2.3 HEBRC45958 菌株的嗜鐵素和水解酶活性分析

對HEBRC45958菌株分泌的嗜鐵素和5種細胞水解酶活性進行測定，結果（圖4）表明，HEBRC45958菌株能夠在淀粉、幾丁質、茯苓粉和CMC平板上產生透明圈，說明該菌株能產生淀粉酶、幾丁質酶、和纖維素酶；且能夠在CAS平板產生黃色暈圈，說明菌株能夠產生嗜鐵素。

2.4 HEBRC45958 菌株發(fā)酵液防控番茄棒孢葉斑病

盆栽試驗（表2和圖2）表明，HEBRC45958菌株發(fā)酵液對番茄棒孢葉斑病具有良好的防控效果，經HEBRC45958菌株發(fā)酵液原液及25和50倍稀釋液處理后，番茄病情指數顯著降低，由對照的96.88分別降為0.00、6.90和11.11。HEBRC45958菌株發(fā)酵液原液及25和50倍稀釋液的防效分別為100.00%、92.88% 和88.53%，均高于對照藥劑啶酰菌胺。

3 討論

關于棒孢葉斑病的生物防控研究多集中于芽孢桿菌，而鏈霉菌的報道較少。金麗穎[19]報道了Streptomyces inhibens NEAU-D10 發(fā)酵液對黃瓜棒孢葉斑病具有良好的防控效果，本研究首次報道了S. phaeoluteichromatogenes HEBRC45958防控棒孢葉斑病。

經HEBRC45958處理后，在掃描電鏡下觀察，多主棒孢的菌絲出現扭曲和破裂；透射電鏡下觀察，細胞膜和細胞壁間距離變大。由此推斷破壞細胞壁結構可能是HEBRC45958 的一種抑菌機理。這與Xiong 等[20] 報道Streptomyces padanusJAU4234 的代謝產物多烯大環(huán)內酯抗生素Antifungalmycin 702對立枯絲核菌菌絲作用的結果相似。

HEBRC45958能產生嗜鐵素、淀粉酶、幾丁質酶和纖維素酶等抑菌物質。其中淀粉酶、幾丁質酶和纖維素酶作為細胞壁水解酶，能夠水解病原菌細胞壁[2021]，該結果與掃描電鏡觀察結果一致。Fe3+是微生物生長的關鍵因子，嗜鐵素具有與病原菌競爭Fe3+ 能力，從而達到抑制病原菌生長[2223]。因此HEBRC45958菌株代謝產生嗜鐵素也是防控棒孢葉斑病的一種抑菌機制。

鏈霉菌能產生豐富的次級代謝產物，除了水解酶外，還能產生多種類型的抗生素。Ma等[24]報道，不吸水鏈霉菌梧州亞種（Streptomyces ahygroscopicussubsp. wuzhouensis）11371菌株能產生的一種26環(huán)四烯大環(huán)內酯類抗生素四霉素，其對黃瓜棒孢葉斑病盆栽防效達到79.70%。HEBRC45958 菌株產生的抗生素種類還需要進一步鑒定。本研究通過盆栽試驗評價了HEBRC45958菌株對多主棒孢的防效，后續(xù)需要進一步進行田間防控效果的評價。

參考文獻

［1］ 李寶聚，高葦，石延霞，等.多主棒孢和棒孢葉斑病的研究進

展[J].植物保護學報，2012，39（2）：171-176.

LI B J， GAO W， SHI Y X， et al .. Progress in researches on

Corynespora leaf spot [J]. Acta Phytophylacica Sin.， 2012， 39（2）：

171-176.

［2］ 田守波，朱為民，朱龍英，等.番茄棒孢葉斑病病原鑒定及生

物學特性研究[J].植物保護，2020， 46（3）：157-162.

TIAN S B， ZHU W M， ZHU L Y， et al .. Identification of the

pathogen from Corynespora leaf spot of tomato and research on

its biological characteristics [J]. Plant Prot.， 2020， 46（3）：

157-162.

［3］ 李明遠.李明遠斷病手跡（六十一）北京發(fā)現番茄棒孢葉斑

病[J].農業(yè)工程技術，2015（10）：84-85.

［4］ DUAN Y B， XIN W J， LU F， et al.. Benzimidazole- and QoIresistance

in Corynespora cassiicola populations from greenhousecultivated

cucumber： an emerging problem in China [J].

Pesticide Biochem. Physiol.， 2019， 153： 95-105.

［5］ ZHU F D， SHI Y X， XIE X W， et al .. Occurrence distribution

and characteristics of boscalid-resistant Corynespora cassiicola

in China [J]. Plant Dis.， 2019， 103（1） ：69-76.

［6］ SHI Y， ZHU F， SUN B， et al .. Two adjacent mutations in the

conserved domain of SdhB confer various resistance

phenotypes to fluopyram in Corynespora cassiicola [J]. Pest

Manage. Sci.， 2021， 77（9）：3980-3989.

［7］ SHI Y， SUN B， XIE X， et al .. Site-directed mutagenesis of the

succinate dehydrogenase subunits B and D from Corynespora

cassiicola reveals different fitness costs and sensitivities to

succinate dehydrogenase inhibitors [J]. Environ. Microbiol.， 2021，

23（10）：5769-5783.

［8］ SUN B X， ZHU G X， XIE X W， et al.. Double mutations on

succinate dehydrogenase are involved in SDHI resistance in

Corynespora cassiicola [J/OL]. Microorganisms， 2022， 10（1）： 132

[2023-04-30]. https：//doi.org/10.3390/microorganisms10010132.

［9］ 趙昱榕，李磊，謝學文，等.貝萊斯芽胞桿菌ZF2對多主棒孢

病菌防治效果[J].中國生物防治學報，2019，35（2）：217-225.

ZHAO Y R， LI L， XIE X W， et al .. Biocontrol effect of Bacillus

velezensis strain ZF2 against Corynespora cassiicola [J]. J. Chin.

Biol. Control.， 2019， 35（2）：217-225.

［10］ 李新宇，李磊，石延霞，等.黃瓜棒孢葉斑病拮抗細菌的篩選，

鑒定及防治效果[J].植物保護學報，2020，47（3）：620-627.

LI X Y， LI L， SHI Y X， et al .. Screening， identification and

control effects of antagonistic bacteria against cucumber

Corynespora leaf spot [J]. J. Plant Prot.， 2020， 47（3）：620-627.

［11］ 黃大野，賁海燕，曹春霞，等.死亡谷芽胞桿菌NBIF-001防治

番茄棒孢葉斑病研究[J].植物保護，2017，43（6）：192-195.

HUANG D Y， BEN H Y， CAO C X， et al .. Control effect of

Bacillus vallismortis NBIF001 on Corynespora leaf spot on

tomato [J]. Plant Prot.， 2017， 43（6）：192-195.

［12］ 黃大野，曹春霞，張亞妮，等.枯草芽孢桿菌NBF809防治番茄

棒孢葉斑病研究[J].中國蔬菜， 2018（12）：40-44.

HUANG D Y， CAO C X， ZHANG Y N， et al .. Studies on

controlling tomato Corynespora leaf spot by Bacillus subtilis

NBF809 [J]. China Veget.， 2018（12）：40-44.

［13］ LI Q， NING P， ZHENG L， et al .. Effects of volatile substances

of Streptomyces globisporus JK-1 on control of Botrytis cinerea

on tomato fruit [J]. Biol. Cont.， 2012， 61（2）：113-120.

［14］ 王超，申成美，鄭麗，等.煙草青枯病生防細菌的篩選與生防

效果研究[J].植物保護，2014，40（2）：43-47.

［15］ 武志江，王亞軍，楊柳，等.百合枯萎病拮抗細菌的篩選，鑒定

及其抑菌物質研究[J].微生物學通報，2015，42（7）：1307-1320.

WU Z J， WANG Y J， YANG L， et al .. Isolation and

identification of an antagonistic bacterium against Fusarium on

lily and its antifungal substances [J]. Microbiol. China， 2015，

42（7）：1307-1320.

［16］ MUDYTWA R M， CHAIBVA P， TAKAWIRA M， et al ..

Evaluation of Trichoderma harzianum in controlling dampingoff

（Pythium spp.） on tomato （Solanum lycopersicum） seedling

varieties [J]. Ann. Biolo. Res.， 2016， 7（6）：6-11.

［17］ MIYAMOTO T， ISHII H， SEKOT， et al.. Occurrence of

Corynespora cassiicola isolates resistant to boscalid on cucumber in

Ibaraki Prefecture， Japan [J]. Plant Pathol.， 2009， 58（6）：1144-

1151.

［18］ ISHII H， YANO K， DATE H， et al .. Molecular characterization

and diagnosis of QoI resistance in cucumber and eggplant

fungal pathogens [J]. Phytopathology， 2007， 97（11）：1458-1466.

［19］ 金麗穎. 抗黃瓜棒孢葉斑病放線菌的篩選及Streptomyces

inhibens 多相分類研究[D].哈爾濱：東北農業(yè)大學，2019.

JIN L Y. Screening of actinomycetes against cucumber target leaf

spot disease and polyphasic taxonomy study of Streptomyces

inhibens [D]. Harbin： Northeast Agricultural University， 2019.

［20］ XIONG Z Q， TU X R， WEI S J， et al .. The mechanism of

antifungal action of a new polyene macrolide antibiotic

antifungalmycin 702 from Streptomyces padanus JAU4234 on

the rice sheath blight pathogen Rhizoctonia solani [J/OL]. PLoS

One， 2013， 8（8）：e73884 [2023-04-30]. https：doi.org/10.1371/

journal.pone.0073884.

［21］ 董章勇，王振中.植物病原真菌細胞壁降解酶的研究進展[J].

湖北農業(yè)科學， 2012，51（21）： 4697-4700.

DONG Z Y， WANG Z Z. Research progress of fungal cell walldegrading

enzyme [J]. Hubei Agric. Sci.， 2012， 51（21）：4697-

4700.

［22］ 臧超群，白元俊，張海東，等.暗黑鏈霉菌PY-1活性產物分析

及其對葡萄霜霉病田間防效評價[J].植物保護學報， 2018，

45（4）： 864-870.

ZANG C Q， BAI Y J， ZHANG H D， et al .. Study on bioactive

metabolite of Streptomyces atratus PY-1 and the field control

efficiency against grapevine downy mildew [J]. J. Plant Prot.，

2018， 45（4）： 864-870.

［23］ 榮良燕，姚拓，趙桂琴，等.產鐵載體PGPR菌篩選及其對病原

菌的拮抗作用[J].植物保護， 2011， 37（1）：59-64.

RONG L Y， YAO T， ZHAO G Q， et al .. Screening of

siderophore-producing PGPR bacteria and their antagonism

against the pathogens [J]. Plant Prot.， 2011， 37（1）：59-64.

［24］ MA D C， ZHU J M， JIANG J G， et al .. Evaluation of bioactivity

and control efficacy of tetramycin against Corynespora

cassiicola [J]. Pest. Biochem. Physiol.， 2018， 152（12）：106-113.