摘要：為提高腐乳發(fā)酵劑的發(fā)酵效率，該研究在豆腐坯上接入單一菌種、混合菌種發(fā)酵劑，在單因素試驗的基礎上設計正交試驗，優(yōu)化腐乳前酵工藝并研究腐乳發(fā)酵過程中質構變化。結果表明，混合菌種發(fā)酵效果顯著優(yōu)于單一菌種發(fā)酵，而混合發(fā)酵劑A（少孢根霉、毛霉40899、保加利亞乳桿菌）的發(fā)酵效果優(yōu)于混合發(fā)酵劑B（少孢根霉、毛霉40899、酵母菌、保加利亞乳桿菌），混菌發(fā)酵腐乳最佳前酵工藝條件為接種濃度10⁶ CFU/mL、接種量3%、少孢根霉∶毛霉40899∶保加利亞乳桿菌為1∶1∶1、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間3 d，此時腐乳蛋白酶活力最高，為231.2 U/g，感官評分為83分。在后酵完成時，混合發(fā)酵劑A的硬度最小，彈性最大，內聚性和膠黏性最小。混合菌種發(fā)酵腐乳經(jīng)工藝優(yōu)化后，毛坯菌絲粗壯有光澤，生長旺盛，蛋白酶活力高于單一菌種發(fā)酵腐乳。該研究為開發(fā)復合發(fā)酵劑、提高腐乳產(chǎn)品質量提供了一定的理論依據(jù)。

關鍵詞：混合菌種；腐乳前酵；蛋白酶活力；質構

中圖分類號：TS214.2 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）01-0061-07

Optimization of Pre-Fermentation Process of Sufu Fermented by Mixed Bacteria and Its Texture Analysis

LIU Bei-ning， ZHANG Chen-rui， TIAN Juan， LIU Qin-ming， PI Yu-ran， HU Yong-jin^*

（College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract： In order to improve the fermentation efficiency of sufu fermentation agents， in this study， the single bacterium and mixed bacteria fermentation agents are added onto tofu blank， and orthogonal test is designed based on single factor test to optimize the pre-fermentation process of sufu and study the texture change of sufu during fermentation. The results show that the mixed bacteria fermentation effect is significantly better than the single bacterium fermentation， and the fermentation effect of the mixed fermentation agent A （Rhizopus oligosporus， Mucor 40899， Lactobacillus bulgaricus） is better than the mixed fermentation agent B （Rhizopus oligosporus， Mucor 40899， Saccharomyces cerevisiae， Lactobacillus bulgaricus）. The optimal pre-fermentation process conditions of mixed bacteria fermentation of sufu are as follows： inoculation concentration is 10⁶ CFU/mL， inoculation amount is 3%， Rhizopus oligosporus∶Mucor 40899∶Lactobacillus bulgaricus is 1∶1∶1， fermentation temperature is 30℃ and fermentation time is 3 d. At this time， the protease activity of sufu is the highest of 231.2 U/g， and the sensory score is 83 points. When the post-fermentation is completed， the mixed fermentation agent A has the smallest hardness， the greatest elasticity， and the smallest cohesion and adhesion. After process optimization of sufu fermented by mixed bacteria， the mycelia of the blank is thick， shiny and vigorous， and the protease activity is higher than that of sufu fermented by single bacterium. This study has provided a certain theoretical basis for the development of composite fermentation agent and the improvement of sufu product quality.

Key words： mixed bacteria; pre-fermentation of sufu; protease activity; texture

收稿日期：2024-08-29

基金項目：科技人才與平臺計劃（202105AF150049）；云南省高校食品微生物資源與利用重點試驗室（云教發(fā)[2018]135號）

作者簡介：劉貝寧（2001—），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學。

*通信作者：胡永金（1971—），男，教授，博士，研究方向：食品微生物學。

腐乳是我國特有的大豆發(fā)酵食品^[1]，又稱乳腐、毛豆腐、臭豆腐或霉豆腐^[2]，以其風味醇厚濃香、滋味鮮美、口感細膩的特點^[3]而深受消費者喜愛。豆腐經(jīng)發(fā)酵后，其中的蛋白質和淀粉被微生物酶分解成氨基酸、肽和其他營養(yǎng)物質，賦予了腐乳獨特的風味。按照傳統(tǒng)加工工藝在露天環(huán)境中生產(chǎn)的腐乳易被有害微生物污染，難以控制質量^[4]。腐乳的理化性質、質地和感官特性均會受到微生物的影響^[5]。根據(jù)其發(fā)酵所用的微生物，可將其分為毛霉型腐乳和根霉型腐乳^[6]。毛霉是腐乳發(fā)酵中最常用且用量最大、占比最高的發(fā)酵菌，在生產(chǎn)過程中能釋放出活力高的蛋白酶及其他有益酶系。毛霉型腐乳前酵期主要是以毛霉為主，多種微生物協(xié)同參與發(fā)酵的過程。在該過程中，微生物在營養(yǎng)豐富的條件下迅速生長繁殖，代謝產(chǎn)生大量種類繁多的酶，在蛋白酶的作用下大豆蛋白降解成多肽、游離氨基酸等，在增強腐乳營養(yǎng)、充實口感的同時賦予其獨特純正的風味^[7]，為后酵做好充足的準備。根霉耐高溫，在接近40℃的環(huán)境下仍能生長，常用于在夏季生產(chǎn)腐乳^[8]。而酵母菌和保加利亞乳桿菌協(xié)同發(fā)酵主要用于增香提味。

目前，國內外對腐乳營養(yǎng)成分、生理活性物質和單菌種改良生產(chǎn)工藝等的研究較多，但對于雙菌種或者多菌種混合發(fā)酵腐乳的研究較少。因此，本研究在雙菌種發(fā)酵腐乳的基礎上，加入對風味具有突出貢獻的酵母菌和保加利亞乳桿菌協(xié)同發(fā)酵，并監(jiān)測腐乳發(fā)酵過程中的質構變化，分析比較不同混合發(fā)酵劑在腐乳前酵中主要蛋白酶活力的變化情況，為優(yōu)化腐乳前酵工藝、提升腐乳品質、改善腐乳風味提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

毛霉40899：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；少孢根霉、酵母菌、保加利亞乳桿菌：云南省高校食品微生物資源與利用重點試驗室保存菌種。

大豆油、白酒、食鹽、花椒面、辣椒面、十三香：購于昆明市喜馬特超市。

1.2 試劑

PDA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：上海撫生實業(yè)有限公司；福林酚、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酪氨酸（均為分析純）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設備

BCM-1000A超凈工作臺 蘇州安泰技術有限公司；Eppendorf Research Plus單道可調量程移液槍（100～1 000μL/20～200μL） 南京貝登醫(yī)療股份有限公司；9053A烘箱 上海實研電爐有限公司；HHPX-9272ME恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；LX-B高壓蒸汽滅菌鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；725N分光光度計 南京曉曉儀器設備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 腐乳生產(chǎn)工藝流程

選豆→浸泡→磨漿→濾漿→煮漿→點漿→蹲腦→壓榨→劃坯→擺籠→接種→培菌→倒籠→涼花→搓毛→腌坯→裝壇→加入輔料→后酵產(chǎn)品。

1.4.2 菌種活化

將毛霉40899、少孢根霉、酵母菌接入PDA培養(yǎng)基中，毛霉40899、酵母菌于28℃搖床培養(yǎng) 2 d，取活化液于PDA培養(yǎng)基中活化3次；少孢根霉于32℃搖床培養(yǎng)2 d，取活化液于PDA培養(yǎng)基中活化3次，備用；在MRS培養(yǎng)基中活化保加利亞乳桿菌。

1.4.3 混合發(fā)酵劑的制備

取0.1 mL活化后的菌液于相應固體培養(yǎng)基上涂布、培養(yǎng)，用接種環(huán)刮取新長出的菌種于無菌生理鹽水中，配制成一定濃度的混合發(fā)酵劑，將少孢根霉、毛霉40899、保加利亞乳桿菌混合菌命名為混合發(fā)酵劑A、將少孢根霉、毛霉40899、酵母菌、保加利亞乳桿菌混合菌命名為混合發(fā)酵劑B。

1.4.4 腐乳前酵工藝優(yōu)化單因素試驗

按照腐乳前酵的生產(chǎn)工藝流程，將菌液均勻接種于豆腐坯每個面后恒溫培養(yǎng)，分別考察混合菌種比例（混合發(fā)酵劑A：少孢根霉∶毛霉40899∶保加利亞乳桿菌分別為5∶3∶1、2∶2∶1、1∶1∶1、1∶2∶2、1∶3∶5；混合發(fā)酵劑B：少孢根霉∶毛霉40899∶酵母菌∶保加利亞乳桿菌分別為5∶3∶2∶1、4∶2∶2∶1、1∶1∶1∶1、1∶2∶2∶4、1∶2∶3∶5）、毛霉40899、少孢根霉、混合發(fā)酵劑A、B的接種濃度（10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸ CFU/mL）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%，豆腐質量）、發(fā)酵溫度（24，26，28，30，32，34，36℃）、發(fā)酵時間（1，2，3，4，5 d）對蛋白酶活力的影響。

1.4.5 蛋白酶活力的測定

毛坯蛋白酶活力參照GB/T 23527—2009進行測定。酪氨酸標準曲線線性回歸方程為y=0.018 6x－0.036 2，R²=0.999。

1.4.6 毛坯感官評價

毛坯的感官評價是考核腐乳前酵過程中菌絲生長程度能否形成菌絲衣包裹住腐乳、保證腐乳后酵過程中坯體完整的重要指標，為使前酵工藝達到最佳效果，特在優(yōu)化試驗中加入毛坯進行感官評價，感官評價標準見表1^[9]。

1.4.7 混合發(fā)酵劑前酵工藝正交試驗

在單因素試驗的基礎上，混合發(fā)酵劑前酵工藝以菌種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為變量，以蛋白酶活力和感官評分為指標，設計L₉（3³）正交試驗，優(yōu)化混合菌種前酵工藝，正交試驗因素水平見表2。

1.4.8 腐乳感官評價

腐乳的感官評價參照楊智慧等^[10]、沈子林等^[11]的評價標準并稍作改動。邀請10名本專業(yè)具有感官評價經(jīng)驗的同學進行感官評價，感官評價標準見表3。

1.4.9 單一菌種、混合菌種發(fā)酵腐乳的質構測定

對前酵樣品及制備的腐乳定時取樣測定質構。分別于12 h（Q1）、24 h（Q2）、36 h（Q3）、48 h（Q4）、60 h（Q5）、72 h（Q6）、15 d（H1）、30 d（H2）、45 d（H3）、60 d（H4）、75 d（H5）、90 d（H6）對混合發(fā)酵劑A、B發(fā)酵的腐乳進行隨機取樣。Q代表發(fā)酵前，H代表發(fā)酵后。

采用質構儀對不同發(fā)酵時間段2 cm×2 cm×2 cm的坯體（混合發(fā)酵劑A發(fā)酵、混合發(fā)酵劑B發(fā)酵）進行質構特性測定^[12]，測試條件和參數(shù)：TPA二次下壓；探頭型號P/36R；測前速度5.00 mm/s；測中速度1.00 mm/s；測后速度5.00 mm/s；下壓距離3 cm；觸發(fā)力5 g；采集速率200 pps，每個樣品測定3次，主要參數(shù)及定義見表4。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)分析，Excel 2018、Origin 9.0進行制表、繪圖。

2 結果與分析

2.1 單一菌種、混合菌種發(fā)酵腐乳前酵工藝單因素試驗

2.1.1 混合菌種比例對腐乳前酵的影響

由圖1可知，混合發(fā)酵劑A發(fā)酵腐乳前酵過程中蛋白酶活力隨著保加利亞乳桿菌比例的上升而上升，原因是乳酸菌生長繁殖時會產(chǎn)生各類有機酸和其他化合物，使坯體呈現(xiàn)微酸性環(huán)境，有利于根霉、毛霉的生長，催化大豆蛋白降解，從而體現(xiàn)出較高的酶活^[13]。當少孢根霉∶毛霉40899∶保加利亞乳桿菌為1∶1∶1時，蛋白酶活力達到最高值，但保加利亞乳桿菌的比例持續(xù)上升，其繁殖代謝產(chǎn)生的大量乳酸不僅不會協(xié)同毛霉、根霉發(fā)酵，而且會抑制這兩種菌，導致蛋白酶活力呈下降趨勢。

由圖2可知，混合發(fā)酵劑B蛋白酶活力隨著少孢根霉比例的下降而上升，當少孢根霉∶毛霉40899∶酵母菌∶保加利亞乳桿菌為4∶2∶2∶1時蛋白酶活力最高，可能是該菌種比例有利于菌種間協(xié)同共生^[14]。說明根霉和毛霉是腐乳前酵產(chǎn)蛋白酶的主要菌群，乳酸菌和酵母菌協(xié)同完成前酵，當后兩者比例不斷上升逐漸占據(jù)主導發(fā)酵地位時，其代謝產(chǎn)生的酸類、醇類對根霉、毛霉的生長繁殖產(chǎn)生多重抑制，而毛霉、根霉的代謝產(chǎn)物也對乳酸菌和酵母菌產(chǎn)生抑制，在雙向抑制的作用下，微生物不能正常生長，影響了代謝物的分泌，蛋白酶活力迅速降低。

2.1.2 單一菌種、混合菌種發(fā)酵腐乳不同工藝對前酵的影響

由圖3可知，接種濃度低時微生物數(shù)量偏低，毛坯單位面積上的酶數(shù)量較少，故蛋白酶活力偏低。蛋白酶活力隨著接種濃度的上升而逐漸升高，混合發(fā)酵劑A在10⁶ CFU/mL時達到最高值，為230.9 U/g。當達到較高酶解率時，盡管接種濃度有所增加，但能夠在豆腐坯上正常生長繁殖的微生物數(shù)量基本達到飽和，單位時間內蛋白酶活力不再有明顯提高。

由圖4可知，當接種量為3%時，微生物能較好地利用底物的營養(yǎng)物質，混合發(fā)酵劑B蛋白酶活力達到最大值，混合發(fā)酵劑A、毛霉40899、少孢根霉蛋白酶活力在接種量為4%時達到最大值。接種量過大時，會導致微生物數(shù)量超出其最佳生長階段的適宜范圍，而營養(yǎng)組分有限，只能滿足菌體自身生長發(fā)育，不利于蛋白酶等代謝物的分泌^[15]，可能導致原料中的各類成分被過度分解利用，使得蛋白酶活力不升反降^[16]，尤其是菌種較多的混合發(fā)酵劑B，不同菌種之間的競爭能力不同，多種菌種共同爭奪營養(yǎng)，蛋白酶活力下降幅度明顯^[17-18]。

由圖5可知，在24～36℃，混合發(fā)酵劑A的蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢，少孢根霉和保加利亞乳桿菌屬于嗜溫菌^[19]，30℃時混合發(fā)酵劑A的蛋白酶活力達最高值；混合發(fā)酵劑B的蛋白酶活力也先上升后下降，28℃時達到最高值。這可能是因為菌種的生長對溫度的要求較高，特別是混合菌種，在適宜溫度范圍內才能快速生長繁殖，產(chǎn)生大量的蛋白酶。過低和過高的溫度也會影響微生物的生長代謝，進而降低微生物分泌的產(chǎn)酶量^[20]。超過最適溫度，細胞功能急劇下降甚至死亡，部分酶失活，溫度越高，死亡和變性失活越明顯，導致發(fā)酵難以進行。

由圖6可知，毛霉40899和少孢根霉生長繁殖迅速，可快速利用豆腐坯的營養(yǎng)物質進行能量轉化，發(fā)酵3 d時蛋白酶活力達到最高值，但隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)增加，微生物可利用的營養(yǎng)物質減少^[21]，菌體過度生長繁殖，易老化衰退，代謝廢物增多，導致蛋白酶活力下降。

綜上，單一菌種發(fā)酵腐乳前酵工藝中，少孢根霉生長迅速、產(chǎn)酶能力強、適應溫度域廣，因此，選擇少孢根霉進行腐乳后發(fā)酵研究。但由于在最適溫度下，菌株生長代謝快，孢子量大，菌絲致密^[22]，易老化變黃，搓毛后，坯體呈黑褐色，影響腐乳整體感官。因此，本研究選擇與最適生長溫度下蛋白酶活力差異不大的32℃進行少孢根霉的后發(fā)酵研究。

在混合菌種發(fā)酵腐乳前酵工藝中，其最高蛋白酶活力均高于單一菌種前酵腐乳，原因是多菌種復配后，代謝合成的化合物使微生物生長環(huán)境發(fā)生了變化，菌群之間產(chǎn)生協(xié)同效應，有利于菌種繁殖產(chǎn)酶^[23]，混合發(fā)酵劑A在不同工藝條件下均比混合發(fā)酵劑B表現(xiàn)出更高的蛋白酶活力。后酵風味的形成是通過前酵累積的酶系不斷催化分解，生成一系列呈香呈味物質，獲得最佳發(fā)酵效果的過程，因此，選擇蛋白酶活力最高的混合發(fā)酵劑A進行后發(fā)酵試驗。

2.2 混合發(fā)酵劑前酵工藝正交試驗

在單因素試驗的基礎上，控制混合發(fā)酵劑A接種濃度為10⁶ CFU/mL、接種量為3%，對其進行正交試驗優(yōu)化，試驗結果見表5，方差分析結果見表6。

由表 5可知，各因素對蛋白酶活力影響的主次順序為菌種比例＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間，而發(fā)酵時間為影響感官評分的主要因素。綜合顯著性影響得出，混合發(fā)酵劑A最佳前酵工藝為A₂B₂C₂，由于不在正交試驗表內，對其進行驗證試驗。由表 6可知，混合發(fā)酵劑A發(fā)酵腐乳前酵工藝中，菌種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對蛋白酶活力的影響顯著。

由表7可知，混合發(fā)酵劑A發(fā)酵腐乳前酵工藝經(jīng)優(yōu)化后蛋白酶活力高，感官評分較好，菌絲有光澤、長勢良好，坯體完整不缺角，具有淡淡的發(fā)酵香氣，可用于后酵試驗。

2.3 腐乳發(fā)酵過程中質構的變化

2.3.1 腐乳發(fā)酵過程中硬度、膠黏性和咀嚼性的變化

少孢根霉、毛霉40899在生長繁殖過程中產(chǎn)生大量菌絲，包裹住坯體，使其具有一定的抗形變能力，此外，微生物代謝繁殖釋放少量熱能^[24]，加速了水分揮發(fā)，導致前酵階段腐乳的硬度不斷增加。食鹽的加入導致坯體中的水分析出，硬度大幅上升^[25]。H1～H6階段，腐乳中的蛋白質、多肽、脂肪等經(jīng)微生物轉化分解，生成小分子物質及呈香呈味物質，坯體變軟，內部質地更加細膩，硬度更小。發(fā)酵完成時混合發(fā)酵劑A、B的硬度最低，為500 g，說明混合菌種之間的協(xié)同作用更有利于物質分解轉化，能夠改善腐乳的硬度，使腐乳的質地更加潤滑，口感更加細膩。

膠黏性表示硬度和內聚性的乘積^[26]，反映破碎食物時所需要的能量，其與樣品分子內部的蛋白質結構或交聯(lián)有關^[27]。前酵過程中膠黏性隨著微生物的代謝分泌和蛋白質結構的改變而不斷增大。后酵過程中蛋白網(wǎng)絡結構不斷被破壞，進一步分解成小分子的多肽和水溶性蛋白，硬度隨之降低，分子鍵型發(fā)生變化，膠黏性也降低，腐乳更容易破碎。后酵完成時，混合發(fā)酵劑A的膠黏性較低，為 133.25 N。

咀嚼性是硬度、內聚性、彈性三者的乘積^[28]，其受硬度變化的影響最大。兩種方式發(fā)酵腐乳的咀嚼性均為前酵過程中基本保持不變，后酵時隨著食鹽、白酒等輔料的加入迅速增加，在乳酸菌所分泌的脂肪水解酶和蛋白水解酶的長時間作用下^[5]，蛋白質-蛋白質鏈、蛋白質-脂肪鏈、蛋白質-淀粉鏈斷裂嚴重，分子間作用力降低，難以保持網(wǎng)絡組織結構，因此咀嚼性逐漸下降。發(fā)酵完成時，混合發(fā)酵劑A的咀嚼性為74.1 N，混合發(fā)酵劑B的咀嚼性較低，為65.07 N。

2.3.2 腐乳發(fā)酵過程中彈性和內聚性的變化

彈性是變形材料在去除變形力后恢復到未變形狀態(tài)的速率^[29]。前酵時，以蛋白酶為主的各類酶作用于豆腐坯上，由于酶解作用，腐乳的凝膠網(wǎng)絡空間瓦解，蛋白質、脂肪、多糖碎片層疊堆積，彈性也隨之減小^[30]。隨著輔料的加入，腐乳的彈性回升，原因可能是水分滲出增大了凝膠網(wǎng)絡的形變空間，形變程度更大，彈性有所回升。后酵完成時，混合發(fā)酵劑A的彈性最大，為0.55，混合發(fā)酵劑B的彈性為0.44。

內聚性代表組成樣品內部結合鍵的強度，反映了樣品抵抗受損并保持完整的能力^[31]。研究表明，內聚性與樣品分子內部的蛋白分子結構和鍵型有關^[32]。前酵階段相比于后酵階段，內聚性下降幅度更小，原因是雖然后酵期酶活受到一定的抑制，但作用于蛋白的時間長，催化分解更充分。由于微生物和酶系的作用，后酵期大豆蛋白、多肽分解較徹底，因此發(fā)酵完成時內聚性較低，混合發(fā)酵劑A的內聚性較混合發(fā)酵劑B低。

2.4 腐乳的感官評分

混合發(fā)酵劑A發(fā)酵的腐乳坯體為亮紅色，剖面呈淡黃色，色澤锃亮。腐乳質地柔軟，咸淡適中，口感細膩綿長，輔料與發(fā)酵獨特的香味相協(xié)調，香氣純正誘人，有助于增進食欲，感官評分較高。

3 結論

混合發(fā)酵劑A前酵的最優(yōu)工藝為接種濃度10⁶ CFU/mL、接種量3%、菌種比例1∶1∶1、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間3 d，該工藝條件下蛋白酶活力為231.2 U/g，感官評分為83分。在后酵完成時，混合發(fā)酵劑A的彈性最大，其酶解作用更完全；對于內聚性和膠黏性而言，混合發(fā)酵劑A均最小，蛋白質降解得更徹底?；旌暇N協(xié)同作用有利于營養(yǎng)物質轉化，混合菌種發(fā)酵的腐乳蛋白酶活力和感官評分均明顯高于單一菌種發(fā)酵的腐乳。

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