摘要：花骨魚魚肉肌間刺多，可食部分少，不宜直接加工食用。為了提高花骨魚魚肉的利用價值，該研究采用復(fù)合發(fā)酵法制作花骨魚魚露調(diào)味品。在探討溫度、時間等因素對魚露中氨基酸態(tài)氮含量影響的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化魚露的快速發(fā)酵工藝。響應(yīng)面實驗的顯著性分析結(jié)果顯示，所建立的擬合模型具有可靠性。在此基礎(chǔ)上，以氨基酸態(tài)氮含量最高為優(yōu)化目標，得出加鹽量20%、加曲量12%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間90 d時，魚露中氨基酸態(tài)氮含量最高。驗證實驗結(jié)果顯示，該發(fā)酵工藝制作的魚露中氨基酸態(tài)氮含量為0.941 g/100 mL，與預(yù)測值0.935 g/100 mL的相對誤差為0.68%。與傳統(tǒng)自然發(fā)酵工藝相比，該發(fā)酵工藝不僅使魚露的發(fā)酵時間縮短了87.7%，而且其氨基酸態(tài)氮和總氮的含量達到市售一級魚露標準，所制作的魚露的風味化合物中硫化物、萜烯類、有機芳香硫化物的含量更高。綜上，該研究建立的快速發(fā)酵工藝對花骨魚魚露的制作具有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：花骨魚；魚露；復(fù)合發(fā)酵；響應(yīng)面

中圖分類號：TS254.5 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）01-0147-06

Optimization of Rapid Fermentation Process of Fish Sauce with Hemibarbus maculatus

MA Hao-xin， PENG Hai-chuan， WANG Ao-dong， ZHOU Jiao， DONG Li， LI Qing， ZHANG Yin^*

（Key Laboratory of Meat Processing in Sichuan Province， Chengdu University， Chengdu 610106， China）

Abstract： Hemibarbus maculatus has many intramuscular spines and fewer edible parts， so it is not suitable for direct processing and consumption. In order to improve the utilization value of Hemibarbus maculatus， in this study， a compound fermentation method is used to prepare fish sauce condiment with Hemibarbus maculatus. On the basis of discussing the effects of temperature and time on the content of amino acid nitrogen in fish sauce， response surface method is used to optimize the rapid fermentation process of fish sauce. The significance analysis results of response surface experiment show that the established fitting model is reliable. On this basis， take the highest amino acid nitrogen content as the optimization goal， it is concluded that the content of amino acid nitrogen in fish sauce is the highest when the addition amount of salt is 20%， the addition amount of koji is 12%， fermentation temperature is 35℃ and fermentation time is 90 d.The results of verification experiment show that the amino acid nitrogen content in fish sauce produced by the fermentation process is 0.941 g/100 mL， with the relative error of 0.68% compared to the predicted value of 0.935 g/100 mL. Compared with traditional natural fermentation process， the optimized fermentation process not only shortens the fermentation time by 87.7%， but also makes the content of amino acid nitrogen and total nitrogen reach the standard of first-class fish sauce. Among the flavor compounds of fish sauce produced by the fermentation process， the content of sulfides， terpenes and organic aromatic sulfides is higher. In summary， the rapid fermentation process established in this study has guiding significance for the production of fish sauce with Hemibarbus maculatus.

Key words： Hemibarbus maculatus; fish sauce; compound fermentation; response surface

收稿日期：2024-07-23

基金項目：四川省科技廳苗子工程項目（MZGC20230123）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川創(chuàng)新團隊項目（sccxtd-2023-15）

作者簡介：馬昊鑫（1999—），男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與保藏。

*通信作者：張崟（1981—），男，教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與保藏。

魚露是由鹽腌水產(chǎn)品發(fā)酵而成的調(diào)味品，具有味道鮮咸、風味獨特的特點，在日本、韓國、泰國等國家廣受歡迎^[1-3]。我國廣東、福建等沿海地區(qū)也有食用魚露的習(xí)慣。魚露中既含有氨基酸、有機酸、牛磺酸等成分，又含有抗氧化、抗疲勞活性物質(zhì)^[4]。由于魚露獨特的風味和功能性，自其上市以來，受到調(diào)味品行業(yè)的重視，且自1980年以來得到快速發(fā)展，到2023年我國的魚露產(chǎn)量已達10萬噸以上^[5]。目前，魚露的制作方法主要以自然發(fā)酵和快速發(fā)酵為主，其中，快速發(fā)酵法因能有效縮短魚露的發(fā)酵時間而受到行業(yè)的重視。魚露的快速發(fā)酵工藝主要包括低鹽保溫法、外加酶法、外加曲法和復(fù)合法^[6]。其中，外加曲法所得產(chǎn)品不僅色澤、風味更好^[7]，而且操作簡便。

在魚露制作原料方面，目前市售魚露主要以海魚居多，淡水魚相對較少，可能與淡水魚發(fā)酵工藝不成熟有關(guān)。為了進一步探討淡水魚快速發(fā)酵制作魚露的工藝，本研究以成都市農(nóng)林科學(xué)院培育的新魚種花骨魚為原料，采用外加曲快速發(fā)酵法制作魚露。花骨魚具有肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、富含蛋白質(zhì)和脂肪等特點，但其肌間刺多，可食用部分少，不宜直接加工食用。在此背景下，前期團隊比較了花骨魚、唇骨魚和雜交骨魚的營養(yǎng)成分，并選用3種魚中脂肪含量更低、氨基酸含量更高的花骨魚為原料，初步建立了花骨魚魚露快速發(fā)酵工藝，得到了風味獨特、營養(yǎng)豐富的花骨魚魚露^[4]。為了進一步優(yōu)化魚露發(fā)酵工藝和產(chǎn)品風味，本研究通過外加米曲霉滬釀3.042（酶系完整、產(chǎn)孢能力強、遺傳穩(wěn)定性好^[8]）快速發(fā)酵花骨魚魚露，并結(jié)合響應(yīng)面法^[9]優(yōu)化發(fā)酵工藝，以期為工業(yè)化制作花骨魚魚露提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米曲霉（Aspergillus oryzae，菌株編號：CICC2339）：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；花骨魚：成都市農(nóng)林科學(xué)院人工培育；海鹽：大連鹽化集團有限公司；麩皮：嘉興品碩商貿(mào)有限公司；面粉：延津克明面粉有限公司。

1.2 實驗試劑

PDA液體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（NA）（均為BR）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；固體氫氧化鈉、固體氯化鈉、甲醛（37%～40%）、濃鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、氧化鎂、硼酸（均為AR）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；無水乙醇、95%乙醇（均為AR）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實驗設(shè)備

PHSJ-4F型pH計 上海雷磁儀器廠；Aki-mini純水儀 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；LDZX-75L高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；LE104E電子分析天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；OpliClean-1300無菌操作臺 力康精密科技（上海）有限公司；SPL-150恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱、GFL-125烘箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；YCW-160A恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海捷呈實驗儀器有限公司；PEN3電子鼻檢測系統(tǒng) 德國Airsense公司；1550型酶標儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；KDN-102C半自動凱氏定氮儀 上海華燁試驗設(shè)備有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 發(fā)酵工藝

1.4.1.1 米曲霉活化

將米曲霉滬釀3.042接種于PDA固體斜面培養(yǎng)基中，置于35℃恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4.1.2 種曲制備

參照文獻[10]的方法，稱取40 g麩皮、10 g面粉和50 mL水混合均勻，用濕紗布掩蓋30 min后裝入500 mL三角瓶中，于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min，取出后冷卻至常溫，待接種。用無菌超純水沖洗活化后的米曲霉滬釀3.042斜面，用移液槍移取1 mL菌液接種于三角瓶麩皮培養(yǎng)基中，混合均勻后置于35℃生化培養(yǎng)箱中，1 d后白色菌絲布滿培養(yǎng)基，搖瓶，3 d后菌絲變?yōu)槟G色，此時種曲發(fā)酵成熟。

1.4.1.3 成曲制備

將去除頭和內(nèi)臟的花骨魚魚肉清洗干凈，置于斬拌機中制成魚糜，稱取適量種曲與魚糜混合均勻，置于35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約48 h后魚糜布滿黃綠色曲料，米曲霉成曲制備完成。

1.4.2 魚露發(fā)酵

將花骨魚去除魚頭和內(nèi)臟，用純凈水清洗干凈后放入1 000 mL滅菌后的發(fā)酵罐中，按比例加入成曲、海鹽和2倍魚肉質(zhì)量的無菌水，混合均勻，用紗布封住發(fā)酵罐口，置于生化培養(yǎng)箱中進行單因素實驗。

1.4.3 單因素實驗

稱取200 g預(yù)處理后的魚肉和400 mL純凈水置于滅菌后的1 000 mL發(fā)酵罐中，選取加鹽量、加曲量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4個因素進行單因素實驗。

加鹽量：設(shè)定加曲量12%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間30 d，調(diào)節(jié)加鹽量分別為10%、15%、20%、25%、30%，以氨基酸態(tài)氮含量為評價指標，得出最佳加鹽量。

加曲量：以最佳加鹽量為條件，設(shè)定發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間30 d，調(diào)節(jié)加曲量分別為3%、6%、9%、12%、15%，以氨基酸態(tài)氮含量為評價指標，得出最佳加曲量。

發(fā)酵溫度：以最佳加鹽量和加曲量為條件，設(shè)定發(fā)酵時間30 d，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度分別為31，33，35，37，39℃，以氨基酸態(tài)氮含量為評價指標，得出最佳發(fā)酵溫度。

發(fā)酵時間：以最佳加鹽量、加曲量和發(fā)酵溫度為條件，設(shè)定發(fā)酵時間分別為30，60，90，120，150 d，以氨基酸態(tài)氮含量為評價指標，得出最佳發(fā)酵時間。

1.4.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化

以加鹽量、加曲量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間的限值為參數(shù)，以氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面實驗，見表1。

1.4.5 魚露中氨基酸態(tài)氮和總氮含量的測定

參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的甲醛滴定法測定樣品中氨基酸態(tài)氮的含量；參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定樣品中總氮的含量。

1.4.6 電子鼻分析

用移液槍吸取0.5 mL魚露樣品放入頂空進樣瓶中，密封，平衡25 min。將進樣針插入頂空進樣瓶中，取頂空氣體進行檢測，檢測分析55 s。樣品檢測完畢后，設(shè)置儀器自動清洗時間為60 s^[11]。每個樣品平行測定3次。PEN3電子鼻傳感器信息見表2。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2019b對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪圖。利用Design-Expert 13軟件進行響應(yīng)面實驗方案設(shè)計，并對實驗結(jié)果進行擬合優(yōu)化。利用WinMuster分析軟件對電子鼻數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 加鹽量對魚露氨基酸態(tài)氮含量的影響

氨基酸態(tài)氮含量是表征發(fā)酵程度的指標，一般情況下，該指標越高說明魚露的風味物質(zhì)含量越高^[12]。不同加鹽量條件下魚露中氨基酸態(tài)氮含量的變化見圖1。

由圖1可知，隨著加鹽量的增加，氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢，并在加鹽量20%時達到峰值0.385 g/100 mL。因此，選擇加鹽量15%和25%作為響應(yīng)面設(shè)計時加鹽量的限值。當加鹽量低于20%時，無法抑制發(fā)酵液中腐敗微生物的生長繁殖，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮被作為氮源消耗，使得魚露的風味劣化^[13]。當加鹽量高于20%時，氨基酸態(tài)氮含量直線下降，這可能是由于高濃度鹽引發(fā)的高滲透壓抑制了發(fā)酵微生物的生長繁殖^[14]，使得發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的水解程度下降^[15]。這些因素可能是導(dǎo)致圖1中氨基酸態(tài)氮含量隨著加鹽量的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢的主要原因。

2.1.2 加曲量對魚露氨基酸態(tài)氮含量的影響

不同加曲量條件下魚露中氨基酸態(tài)氮含量的變化見圖2。

由圖2可知，隨著加曲量的增加，氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)增長趨勢，當加曲量達9%后，氨基酸態(tài)氮含量趨于平穩(wěn)，當加曲量為12%時，氨基酸態(tài)氮含量達到峰值0.395 g/100 mL，加曲量繼續(xù)增加，氨基酸態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定。因此，在設(shè)計優(yōu)化實驗方案時，選擇9%和15%作為加曲量的限值。當加曲量為3%～9%時，氨基酸態(tài)氮含量增長較快，這可能是成曲的加入使發(fā)酵液中米曲霉數(shù)量增加所致。米曲霉中含有的蛋白酶使蛋白質(zhì)水解加速。此外，成曲麩皮培養(yǎng)基中含有大量的植物蛋白，增加用曲量的同時也增加了物料中的蛋白質(zhì)總量^[16]。當加曲量繼續(xù)增加時，蛋白酶對蛋白質(zhì)的分解量達到了極限。這些因素可能是導(dǎo)致圖2中氨基酸態(tài)氮含量隨著加曲量的增加先增加后趨于穩(wěn)定的主要原因。

2.1.3 發(fā)酵溫度對魚露中氨基酸態(tài)氮含量的影響

不同發(fā)酵溫度條件下魚露中氨基酸態(tài)氮含量的變化見圖3。

由圖3可知，發(fā)酵溫度在31～39℃范圍內(nèi)，魚露中氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵溫度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，發(fā)酵溫度在35℃時氨基酸態(tài)氮含量達到最高，為0.390 g/100 mL。因此，選擇33℃和37℃作為響應(yīng)面設(shè)計時發(fā)酵溫度的限值。31～35℃是酶反應(yīng)的適宜溫度，酶活性升高^[17]。隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中的腐敗微生物滋生，可能抑制曲霉的生長，導(dǎo)致蛋白酶活性降低^[18]。這些因素可能是導(dǎo)致圖3中氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵溫度的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢的主要原因。

2.1.4 發(fā)酵時間對魚露中氨基酸態(tài)氮含量的影響

不同發(fā)酵時間條件下魚露中氨基酸態(tài)氮含量的變化見圖4。

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，魚露中氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當發(fā)酵時間為90 d時，氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.930 g/100 mL。因此，在優(yōu)化實驗中，選擇60 d和120 d作為發(fā)酵時間的限值。在0～90 d期間，魚肉在米曲霉中的蛋白酶和魚體內(nèi)源性酶的共同作用下降解產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮，使其含量快速增加。90 d后魚肉中大部分蛋白質(zhì)被分解，氨基酸態(tài)氮被用作微生物的氮源消耗^[19]。這些因素可能是導(dǎo)致圖4中氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢的主要原因。

2.2 花骨魚魚露發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 實驗方案和優(yōu)化結(jié)果

以加鹽量15%和25%、加曲量9%和15%、發(fā)酵溫度33℃和37℃、發(fā)酵時間60 d和120 d分別作為限值，以發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值，對花骨魚魚露發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。響應(yīng)面實驗方案和結(jié)果見表3。

2.2.2 擬合模型和方差分析

利用Design-Expert 13軟件對數(shù)據(jù)進行擬合分析，得到氨基酸態(tài)氮含量（Y）與加鹽量（A）、加曲量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）之間的擬合方程：Y=0.929 2+0.014 8A－0.007 7B－0.005 4C+0.048 7D+0.027 8AB－0.008AC－0.005 2AD－0.015 8BC+0.02BD－0.000 5CD－0.082 8A²-0.048 6B²-0.045 4C²-0.162 2D²。

擬合結(jié)果的方差分析見表4。

由表4可知，所得擬合模型的Plt;0.000 1，失擬項的P=0.155 9gt;0.05，回歸系數(shù)R²=0.987 1，說明所建立的擬合模型具有可靠性，可用于發(fā)酵條件的優(yōu)化。由表4中P_A=0.003 4＜0.01，P_D＜0.000 1可知，加鹽量（A）和發(fā)酵時間（D）對氨基酸態(tài)氮含量有極顯著影響。因此，在花骨魚魚露發(fā)酵過程中，加鹽量（A）和發(fā)酵時間（D）應(yīng)作為關(guān)鍵控制因素。

2.2.3 擬合模型可靠性驗證

為了進一步驗證所得氨基酸態(tài)氮含量擬合模型的可靠性，對氨基酸態(tài)氮含量測定值和預(yù)測值進行比較（見表3）。數(shù)據(jù)顯示，氨基酸態(tài)氮含量測定值與預(yù)測值的相對誤差均小于5%。由此可知，所得擬合模型具有一定的可靠性，可用于花骨魚魚露發(fā)酵最優(yōu)工藝的優(yōu)化。

2.2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化及驗證

根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸態(tài)氮含量擬合模型，以產(chǎn)物的氨基酸態(tài)氮含量最大為目標，對花骨魚魚露最優(yōu)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，得到的最佳發(fā)酵條件為加鹽量20.58%、加曲量12.48%、發(fā)酵溫度34.80℃、發(fā)酵時間94.76 d，此發(fā)酵條件下氨基酸態(tài)氮含量預(yù)測值為0.935 g/100 mL。

為了進一步驗證所得最優(yōu)工藝的可靠性，以加鹽量20%、加曲量12%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間90 d為工藝條件制備發(fā)酵產(chǎn)物，并對產(chǎn)物的氨基酸態(tài)氮含量進行測定，所得氨基酸態(tài)氮含量為（0.941±0.005）g/100 mL。測定值與預(yù)測值的相對誤差為0.68%。因此，最終確定加鹽量20%、加曲量12%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間90 d為花骨魚魚露發(fā)酵最優(yōu)工藝條件。此外，該發(fā)酵工藝下得到的魚露總氮含量為5.59 g/100 mL，達到GB/T 42463—2023《魚露質(zhì)量通則》市售一級魚露水平。

2.3 花骨魚魚露與市售魚露的風味物質(zhì)比較

2.3.1 雷達圖分析

花骨魚魚露與市售魚露風味雷達圖見圖5。

由圖5可知，HG魚露與其他5種魚露的響應(yīng)值差異明顯。在所有魚露樣品中，W1W（硫化物、萜烯類）的響應(yīng)值最高，其次依次是W1S（甲基類）、W2W（有機芳香硫化物）、W5S（氮氧化合物）和W2S（醇類、醛酮類），其他傳感器的響應(yīng)值較小，表明硫化物、萜烯類、甲基類、有機芳香硫化物、氮氧化合物、醇類、醛酮類是魚露的主要風味貢獻物。

HG魚露的W1W和W2W響應(yīng)值尤為突出，表明相較于市售魚露，花骨魚魚露具有更高含量的硫化物、萜烯類物質(zhì)和有機芳香硫化物含量。HG魚露的W1S和W2S響應(yīng)值更小，表明花骨魚魚露的甲基類、醇類、醛酮類物質(zhì)含量低于市售魚露。萜烯類物質(zhì)能賦予食品花香^[20]、果香^[21]，硫化物一般具有肉味、洋蔥味和大蒜味^[22]，而甲基類物質(zhì)往往伴隨著腐敗魚肉味和氨臭味^[23]。因此，與市售魚露相比，花骨魚魚露具有更突出的香味。

2.3.2 主成分分析（PCA）

主成分分析（PCA）是一種線性降維算法，能夠通過方差直觀展示數(shù)據(jù)的差異性。通過主成分分析花骨魚魚露和5種市售魚露氣味的空間分布和距離，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，6種魚露樣品的區(qū)分度明顯，且第一主成分的貢獻率為94.12%，第二主成分的貢獻率為5.67%，貢獻率之和為99.79%，累計貢獻率能代表魚露樣品的主要信息特征^[24]。6種魚露樣品中HG魚露、WL魚露、YZ魚露和JT魚露樣品能完全分開，且在PC1上差距較大，表明這4種魚露的氣味存在較大差異，可能是HG魚露的原料是淡水魚，而其他市售魚露的原料是海魚，受生長環(huán)境等因素的影響，淡水魚與海魚的氣味存在較大差異^[25]；也可能是HG魚露采用外加曲法發(fā)酵，成曲的加入豐富了發(fā)酵系統(tǒng)中的微生物種類，增加了微生物數(shù)量，對HG魚露氣味形成產(chǎn)生了積極的影響^[26]。

3 結(jié)論

響應(yīng)面實驗結(jié)果顯示，加鹽量為20%、加曲量為12%、發(fā)酵溫度為35℃、發(fā)酵時間為90 d時，花骨魚魚露氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.941 g/100 mL。電子鼻分析結(jié)果顯示，花骨魚魚露的硫化物、萜烯類物質(zhì)和有機芳香硫化物含量較高，花骨魚魚露具有與市售魚露截然不同的風味。

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