［摘" 要］" 目的" 探究部分氧化的海藻酸鈉凝膠聯(lián)合肌源性干細胞心肌內(nèi)注射對老齡心肌梗死大鼠心臟功能的改善作用。方法" 通過結扎冠狀動脈的方法構建老齡心肌梗死大鼠模型，造模成功的大鼠隨機分為生理鹽水對照組、海藻酸鈉組、肌源性干細胞組、海藻酸鈉聯(lián)合肌源性干細胞組（聯(lián)合組），各30只，各組于心肌梗死區(qū)分別注射等量的相應材料。在手術8周后通過超聲心動圖觀察心臟結構和功能情況，通過組織學方法觀察心室重構的差異，并檢測心室切片的血管生成及膠原分泌情況。結果" 聯(lián)合組超聲心動圖指標、組織學指標、單位面積血管密度及膠原陽性面積百分比均優(yōu)于其他組（P＜0.05）；海藻酸鈉組及肌源性干細胞組大鼠的超聲心動圖指標、組織學指標、單位面積血管密度及膠原陽性面積百分比均優(yōu)于生理鹽水對照組（P＜0.05），海藻酸鈉組及肌源性干細胞組的數(shù)據(jù)組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論" 海藻酸鈉聯(lián)合肌源性干細胞心肌內(nèi)注射能夠顯著改善老齡心肌梗死大鼠的心臟功能，其效果優(yōu)于海藻酸鈉或肌源性干細胞的單獨注射。

［關鍵詞］" 海藻酸鈉；肌源性干細胞；老齡大鼠；心肌梗死；心臟功能；心室重構" doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2025.01.003

收稿日期：2024-07-22" 修回日期：2024-09-23" 錄用日期：2024-09-24

*中國初級衛(wèi)生保健基金會基金（中衛(wèi)基協(xié)資出【201】號）

**通信作者：白秀萍，電子郵箱baixiuping2024@126.com

Experimental study of partially oxidized sodium alginate gel combined with myogenic stem cells

to improve cardiac function in aged rats with myocardial infarction

Ma Xinxin， Hou Xiaolu， Dong Peixin， Ye Jiayan， Gao Yangyang， Huang Ling， Bai Xiuping **

Department of Cardiology，the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Harbin" 150001

**Corresponding author：Bai Xiuping， email：baixiuping2024@126.com

［Abstract］" Objective" To investigate the effect of partially oxidized sodium alginate gel combined with intramyocardial injection of myogenic stem cells on cardiac function in aged rats with myocardial infarction. Methods" The models of myocardial infarction in aged rats were established by ligating the coronary arteries and divided randomly into the group of saline control group， sodium alginate group， myogenic stem cells group and sodium alginate combined with myogenic stem cells group（joint group）， each had 30 rats.The same amount of corresponding material was injected into the myocardial infarction area of rats in each group respectively.The cardiac structure and function of the rats were evaluated by echocardiography 8 weeks after the operation， and then the rats were executed.The hearts were removed to observe the differences in ventricular remodeling by histological analysis and the angiogenesis and collagen secretion of the ventricular slices were further analyzed. Results" The echocardiographic indexes， histological indexes， vessel density per unit area， and the percentage of collagen-positive area in the rats of the joint group were better than those in the other groups （Plt;0.05）.The echocardiographic indexes， histological indexes， vessel density per unit area， and the percentage of collagen-positive area in the rats of sodium alginate group and myogenic stem cell groups were better than those in the saline control group （Plt;0.05）， while there was no statistic difference between the sodium alginate group and myogenic stem cells group（Pgt;0.05）. Conclusion" Sodium alginate gel combined with intramyocardial injection of myogenic stem cells can significantly improve the cardiac function in aged rats with myocardial infarction， which also shows the better effects than the injection of sodium alginate or myogenic stem cells separately.

［Key words］" Sodium alginate; Myogenic stem cells; Aged rats; Myocardial infarction; Cardiac function; Ventricular remodeling

心肌梗死是心內(nèi)科常見的急危重癥，隨著我國人口老齡化的日益加劇，心肌梗死的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對老年人的健康和生活質(zhì)量帶來嚴重的影響。近年來，隨著冠狀動脈介入技術的普及，心肌梗死死亡率有所下降，然而心力衰竭的發(fā)病率仍居高不下［1］，其主要原因是心肌梗死后心肌細胞及細胞外基質(zhì)的破壞未得到修復［2］。本研究擬采用部分氧化的海藻酸鈉凝膠聯(lián)合肌源性干細胞進行心肌內(nèi)注射，探討該方法對老齡大鼠壞死心肌的修復效果及對心臟功能的改善效果，同時對修復機制進行初步的探討。

1" 材料與方法

1.1" 老齡大鼠心肌梗死模型的制備

選取16月齡的老齡雄性SD大鼠［購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（黑）2013-001］，采用腹腔注射10%水合氯醛（0.1 mL/10 g）的方式進行麻醉，麻醉成功后進行經(jīng)口氣管插管并連接小動物呼吸機（成都泰盟科技設備有限公司，HX-101E型）及小動物心電監(jiān)護儀（成都泰盟科技設備有限公司，RWDPowerLab型）。大鼠取右側臥位，于左側第二肋間開胸，剔除心包膜，使用6-0手術縫合線永久閉合大鼠冠狀動脈左前降支近端，造成前壁心肌梗死。梗死的心肌呈蒼白色且失去搏動能力，同時伴有相應導聯(lián)的ST段抬高，表明造模成功［3］。造模成功后于心肌梗死區(qū)周邊分5個點共注射相應材料100 μL，而后逐層關胸，并于術后為大鼠連續(xù)肌內(nèi)注射青霉素（2.5萬單位/kg）3 d 預防感染。

1.2" 材料

將不同比率的過氧化鈉和海藻酸鈉（碧云天生物技術公司，貨號9005-38-3）在蒸餾水中混合，并在4" ℃黑暗條件下放置24 h以獲得不同氧化程度的藻酸二醛。在24 h后通過測定未消耗的過氧化鈉濃度對氧化程度進行評估，所選材料平均氧化度為50%～60%。通過混合藻酸二醛和明膠溶液獲得部分氧化的海藻酸鈉凝膠。肌源性干細胞系購自sigma公司，可用于單獨心肌內(nèi)注射或與海藻酸鈉凝膠混勻后進行注射，注射前用磷酸鹽緩沖液（Phos-phate buffer solution， PBS）將細胞稀釋成兩種濃度（5×106細胞/100 μL和2.5×106細胞/100 μL），以用于心肌內(nèi)注射。

1.3" 試驗分組

心肌梗死造模成功的大鼠隨機分為四組，各30只。聯(lián)合組注射材料為部分氧化的海藻酸鈉凝膠50 μL與濃度為5×106細胞/100 μL的肌源性干細胞懸液50 μL的混合物（約含肌源性干細胞2.5×106個）；海藻酸鈉組注射材料為部分氧化的海藻酸鈉凝膠100 μL；肌源性干細胞組注射材料為濃度為2.5×106細胞/100 μL的 肌源性干細胞懸液100 μL（約含肌源性干細胞2.5×106個）；生理鹽水對照組注射材料為生理鹽水100 μL。

1.4" 超聲心動圖觀察

于術后8周后采用腹腔注射10%水合氯醛的方式麻醉大鼠（0.1 mL/10 g），前胸部備皮，大鼠取仰臥位，使用小動物專用超聲探頭（美國通用電氣公司，VIVID7型）對大鼠進行超聲心動圖檢查，采集的指標包括：左室射血分數(shù)、梗死區(qū)室壁厚度、收縮末期左室內(nèi)徑、舒張末期左室內(nèi)徑、短軸縮短率［4］。所有的指標均于3個連續(xù)的心動周期內(nèi)采集并取平均值。

1.5" 組織學檢測

超聲心動圖檢測完成后采用尾靜脈注射10%氯化鉀的方式處死大鼠，使其心臟停搏于舒張期。取出心臟將其固定于10%福爾馬林溶液中，固定充分后平行于房室環(huán)，于房室環(huán)至心尖間取厚度約為3 mm的心室橫斷面組織1塊，而后對其進行石蠟包埋和5 μm厚度的連續(xù)切片，切片經(jīng)蘇木素-伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色后使用顯微鏡上的鏡載奧林巴斯高分辨率相機進行拍照，并通過IMAGE J軟件對所得的圖像進行測算，分析指標包括：平均瘢痕厚度及平均室壁厚度、左室腔面積、整個左室面積，然后計算出相對瘢痕厚度及膨脹指數(shù)。相對瘢痕厚度=平均瘢痕厚度/平均室壁厚度，膨脹指數(shù)=（左室腔面積/整個左室面積）/相對瘢痕厚度［5］。

1.6" 免疫熒光染色

取心臟切片進行CD31抗體（購于sigma公司，貨號E18-5113-2）染色：心臟切片脫蠟、水化，PBS沖洗，滴加山羊血清封閉液封閉，滴入CD31（1∶200稀釋）抗體50 μL，室溫靜置1～2 h。PBS沖洗后滴加FITC標記熒光二抗45～50 μL，室溫靜置90 min，PBS沖洗3次，封片劑封片，鏡下觀察［6］。所有大鼠梗死區(qū)CD31陽性的毛細血管密度在40倍放大后經(jīng)同一個圖像分析系統(tǒng)進行量化，并轉換為“血管數(shù)/mm2”。在每個研究樣本的6個不同區(qū)域重復進行同一測量，最后取平均值評估新生血管情況。同時通過免疫熒光染色對移植物中含有肌源性干細胞組的大鼠心臟切片進行心肌細胞標志物心肌肌鈣蛋白T（Cardiac troponin T，cTnT）的檢測，評估其移植后是否分化為心肌細胞。

1.7" 膠原檢測

取心臟切片進行天狼星紅（購自sigma公司，貨號2610-10-8）染色，石蠟切片脫蠟，放入天青石藍液中5～10 min，用蒸餾水沖洗3次，而后放入天狼星紅-苦味酸溶液中15～30 min，染色后用無水乙醇進行分化與脫水，再進行二甲苯透明、光學樹膠封固［7］。染色后的切片采用顯微鏡上的鏡載奧林巴斯高分辨率相機拍照，采用IMAGE J軟件對各組圖片進行梗死區(qū)膠原陽性面積百分比檢測。

1.8" 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 10進行數(shù)據(jù)分析。服從正態(tài)分布的計量資料采用x±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（任意兩組比較采用LSD-t檢驗），檢驗水準α=0.05。

2" 結果

2.1" 正常大鼠及心肌梗死大鼠的心電圖及心臟彩超情況

相較于正常大鼠，心肌梗死大鼠心電圖會出現(xiàn)相應導聯(lián)ST段的抬高，因大鼠心率快，心電圖波形與人類略有不同（見圖1A），大鼠心肌梗死后的心電圖呈寬QRS波形形態(tài)（見圖1B）。正常大鼠左室射血分數(shù)在70%～80%（見圖1C），心肌梗死大鼠梗死區(qū)室壁運動明顯減弱，未治療情況下左室射血分數(shù)在20%～40%（見圖1D）。

2.2" 各組超聲心動圖檢測結果

肌源性干細胞組、海藻酸鈉組及聯(lián)合組的左室射血分數(shù)、梗死區(qū)室壁厚度及短軸縮短率均高于生理鹽水對照組（P＜0.05），收縮末期左室內(nèi)徑、舒張末期左室內(nèi)徑均低于生理鹽水對照組（P＜0.05）。聯(lián)合組的左室射血分數(shù)、梗死區(qū)室壁厚度及短軸縮短率高于肌源性干細胞組及海藻酸鈉組（P＜0.05），收縮末期左室內(nèi)徑、舒張末期左室內(nèi)徑低于肌源性干細胞組及海藻酸鈉組（P＜0.05）。海藻酸鈉組的各項超聲指標與肌源性干細胞組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3" 組織學檢測結果

心肌梗死大鼠切片HE染色可見梗死區(qū)室壁厚度明顯變薄、心室腔擴大，注射材料及細胞后大鼠梗死區(qū)室壁厚度和心室腔擴張均有所改善，見圖2。具體測算結果可見：肌源性干細胞組、海藻酸鈉組及聯(lián)合組的平均瘢痕厚度、相對瘢痕厚度、整個左室面積及左室肌面積均高于生理鹽水對照組（P＜0.05），擴張指數(shù)均低于生理鹽水對照組（P＜0.05）；聯(lián)合組的平均瘢痕厚度、相對瘢痕厚度、整個左室面積及左室肌面積均高于肌源性干細胞組及海藻酸鈉組（P＜0.05），擴張指數(shù)低于肌源性干細胞組及海藻酸鈉組（P＜0.05）；海藻酸鈉組的各項組織學指標與肌源性干細胞組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.4" 免疫熒光染色結果

CD31染色顯示：聯(lián)合組心臟切片中新生血管數(shù)量多于海藻酸鈉組及肌源性干細胞組（Plt;0.05），且這三組的新生血管數(shù)量均多于生理鹽水對照組（Plt;0.05），見圖3、表3。cTnT染色顯示：肌源性干細胞移植入心肌后能夠分化為心肌細胞，且聯(lián)合組新生心肌細胞數(shù)［（30±4）個/mm2］多于肌源性干細胞組［（22±2）個/mm2］（Plt;0.05），見圖4。

2.5" 膠原檢測結果

聯(lián)合組心臟切片中梗死區(qū)膠原陽性面積百分比高于海藻酸鈉組及肌源性干細胞組（P lt;0.05），且這三組均高于生理鹽水對照組（P lt;0.05），見表3、圖5。

3" 討論

心肌梗死后心力衰竭是眾多老年人的死亡原因，其治療一直是困擾醫(yī)學界的一個難題，即便是再次開通血管，壞死的心肌細胞和細胞外基質(zhì)仍無法重建，隨著心室重構的進展，壞死心肌會逐漸變薄，收縮力會逐漸減弱，整個心臟也會逐漸擴大，心力衰竭也就隨之日益加重。眾多的方法被科研工作者們用來嘗試解決這些問題，其中試驗效果相對理想的方法是梗死區(qū)生物材料和細胞的移植，然而如何構建最適合的生物材料和選擇最適宜移植的細胞仍是亟待解決的問題［8-9］。基于此，本實驗選擇了部分氧化的海藻酸鈉作為修復材料，海藻酸鈉在類似試驗中已展現(xiàn)出了良好生物相容性的優(yōu)勢，但仍存在力學性能差等劣勢［10-11］。本研究通過過氧化鈉對其進行部分氧化，使其在保持原有優(yōu)勢的情況下具備了固化后更類似于真實心肌細胞外基質(zhì)力學性能的特點，這一特點使其不僅能夠良好地補充丟失的心肌細胞外基質(zhì)，更有利于為接下來的細胞移植提供類心肌內(nèi)環(huán)境，使細胞的生長分化趨勢更接近真實心肌組織。在細胞移植上本研究選擇的是肌源性干細胞，它是肌肉來源的一種多能干細胞，能夠分化為各種肌肉細胞。這種細胞既能夠避免骨髓間充質(zhì)干細胞移植后更多分化為成纖維細胞的缺點，也能彌補胚胎干細胞的倫理學缺陷，在相應生物環(huán)境和力學特性的條件下還會定向分化成心肌細胞［12］。本試驗將其與海藻酸鈉凝膠進行混合注射，使其移植后的生長環(huán)境更接近于未破壞的心肌組織，其分化也就必然更趨向于心肌細胞，這一點在cTnT染色結果中也得到了證實。

在本研究中，無論單獨注射部分氧化的海藻酸鈉或是肌源性干細胞，相較于生理鹽水對照組均能改善老齡大鼠心肌梗死后的心臟功能，而聯(lián)合移植則效果更佳，心臟功能和心室重構情況顯著優(yōu)于對照組，這一結果得益于生物材料和細胞的相輔相成，說明本研究材料的選擇是正確的。本研究中，在組織學檢查過程中發(fā)現(xiàn)生物材料移植后會導致心肌梗死區(qū)瘢痕厚度的增加，心肌梗死后的瘢痕修復是一把雙刃劍，一方面瘢痕的增加可以在一定程度上降低心臟破裂的概率和心功能惡化的速度；另一方面瘢痕的增加會導致心臟電活動的異常，影響心臟正常電信號的傳導，同時瘢痕部位易誘導室性心律失常的產(chǎn)生。這說明本研究的材料在心肌梗死后的電生理修復方面存在一定的缺陷，有待于在后續(xù)的研究中加以改善。心肌梗死后的梗死區(qū)原有的毛細血管被破壞，失去了供血供氧能力，使其所供應的心肌細胞隨之死亡。在心肌梗死的修復中，重要的一環(huán)就是恢復梗死區(qū)的毛細血管網(wǎng)絡，因此能否促進毛細血管再生也就成為檢驗一種修復材料是否有潛力的重要指標。本研究通過CD31抗體檢測了各組大鼠心臟切片中梗死區(qū)的新生毛細血管數(shù)量，結果顯示，無論單獨注射部分氧化的海藻酸鈉或是肌源性干細胞，單位面積內(nèi)新生毛細血管數(shù)量均優(yōu)于生理鹽水對照組，而聯(lián)合移植則效果更佳，這說明本研究選擇的修復材料有良好地促進血管再生的作用，這也是其能夠修復心臟功能的機制之一。心肌梗死中細胞外基質(zhì)的丟失使心肌的穩(wěn)定性遭到破壞，同時使心肌細胞缺失了應有的生存環(huán)境，而心肌細胞外基質(zhì)中最重要的成分就是膠原，因此，能否維持或再生梗死區(qū)的膠原成分是評估修復材料功能的另一項重要指標。在本研究中，通過天狼星紅染色評估了各組大鼠心肌梗死區(qū)的膠原含量，結果顯示，無論單獨注射部分氧化的海藻酸鈉或是肌源性干細胞，梗死區(qū)的膠原含量及分布情況均優(yōu)于生理鹽水對照組，而聯(lián)合組移植則效果最佳，說明本研究中選擇的修復材料對膠原的保持和再生具有良好的作用，這是其修復機制的另一個重要環(huán)節(jié)。

本研究通過從大體到微觀的不同角度論證了部分氧化的海藻酸鈉和肌源性干細胞修復材料的有效性，然而本研究也存在著檢測指標少和未對機制進行更加深入研究的局限性，有待于進一步的試驗去完善。相信隨著研究的不斷深入，生物材料和細胞的聯(lián)合移植能夠為心肌梗死后心力衰竭的老年患者帶來新的希望。參考文獻

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