中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）02-0185-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.02.09

摘要 目的 探討四物湯含藥血清對多囊卵巢綜合征（PCOS）卵巢顆粒細胞自噬的影響及潛在機制。方法 取3 月齡雌性SD大鼠，分別以生理鹽水和不同劑量四物湯灌胃，制備空白血清和不同濃度[0.52、1.04、2.08 g/（kg·d）]四物湯含藥血清。篩選四物湯含藥血清干預濃度后，將人卵巢顆粒細胞KGN分為對照組（細胞不進行任何處理）、脫氫表雄酮（DHEA）組（以50 μmol/L 的DHEA處理細胞48 h）、空白血清組（以50 μmol/L 的DHEA處理細胞48 h 后，再用10% 空白血清處理72 h）、中濃度四物湯含藥血清組（以50 μmol/L 的DHEA處理細胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h），觀察各組細胞中的自噬體數(shù)量以及通路相關蛋白[果糖-1，6-二磷酸酶1（FBP1）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）]、自噬相關蛋白[p62、微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3）]和FBP1 mRNA的表達水平。將（轉染）細胞分為四物湯組（以50 μmol/L 的DHEA處理細胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h）、四物湯+si-NC組（以50 μmol/L 的DHEA處理陰性對照小干擾RNA轉染細胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h）、四物湯+si-FBP1 組（以50 μmol/L 的DHEA處理FBP1 小干擾RNA轉染細胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h），考察敲低FBP1 對四物湯上述作用的影響。結果 與對照組比較，DHEA組細胞的自噬體數(shù)量明顯增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-mTOR/mTOR、FBP1 蛋白及mRNA的表達水平均顯著升高，p62 蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05）。與DHEA組和空白血清組比較，中濃度四物湯含藥血清組細胞的自噬體數(shù)量明顯減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著降低，p-mTOR/mTOR和p62 蛋白、FBP1 蛋白及mRNA的表達水平均顯著升高（P＜0.05）。敲低FBP1 后，與四物湯+si-NC組比較，四物湯+si-FBP1 組細胞的存活率、p62 蛋白的表達水平、FBP1 蛋白及mRNA 的表達水平、p-mTOR/mTOR 均顯著降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高（P＜0.05）。結論 四物湯可通過上調KGN細胞中FBP1 蛋白及mRNA的表達來促進mTOR蛋白的磷酸化，從而抑制其自噬。

關鍵詞 四物湯；含藥血清；多囊卵巢綜合征；卵巢顆粒細胞；FBP1/mTOR信號通路

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡期女性最常見的生殖內分泌疾病之一，是導致女性無排卵性不孕的最常見原因，以高胰島素血癥、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變、月經不調等為主要癥狀[1]。PCOS是高血壓、2 型糖尿病、妊娠期糖尿病、心血管疾病及子宮內膜癌等疾病的重要危險因素[2]。研究指出，卵泡發(fā)育異常是PCOS的主要特征，而卵泡內卵巢顆粒細胞的增殖、分化及自噬在卵泡生長發(fā)育過程中發(fā)揮著十分重要的作用[3]。其中，卵巢顆粒細胞在卵泡發(fā)育不同階段出現(xiàn)的過度自噬均會導致卵母細胞質量下降，從而導致排卵障礙和性激素合成失調，最終誘發(fā)PCOS[4]。

四物湯始載于《仙授理傷續(xù)斷秘方》，以熟地黃、當歸、川芎、白芍4 味藥材熬制而成，是中醫(yī)補血、養(yǎng)血的經典方。四物湯作為“婦科第一方”，可刺激卵泡發(fā)育、減少卵泡閉鎖，在治療PCOS方面獨具優(yōu)勢[5]，但其作用機制尚不明確。本課題組前期網(wǎng)絡藥理學初篩發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1 是四物湯的潛在靶基因；同時，全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1 是PCOS 易感基因之一[6]。Liu 等[7]研究表明，果糖-1，6-二磷酸酶1（fructose-1，6-bisphosphatase 1，F(xiàn)BP1）在以高雄激素培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細胞中表達異常，提示FBP1 蛋白可能參與了PCOS的發(fā)生發(fā)展過程。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是參與自噬負向調控的主要因子[8]。mTOR可通過影響細胞自噬、氧化應激、炎癥反應、線粒體功能、葡萄糖攝取等途徑來影響卵泡的發(fā)育和成熟，進而調控PCOS 進程[9]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1 可通過調控mTOR而抑制前列腺癌細胞自噬[10]。基于此，本研究從FBP1/mTOR 信號通路出發(fā)，初步探討四物湯含藥血清對卵巢顆粒細胞自噬的影響，以期為闡明該方治療PCOS的機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括JY300HC型通用型電泳儀（北京君意華鑫科技有限公司）、MK3 型酶標儀和LSC0150型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、FluorChem FC3 型化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple 公司）、MyGo Pro 型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（英國IT-IS 公司）、Axio Observer 3 型倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

熟地黃、當歸、白芍、川芎配方顆粒[批號分別為2105012W、2201005C、2104012W、2109027C，規(guī)格分別為每袋裝3 g（相當于飲片10 g）、2 g（相當于飲片3 g）、1g（相當于飲片10 g）、1 g（相當于飲片3 g）]，均購自河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院；胎牛血清和DMEM/F12 培養(yǎng)基（ 批號分別為SH30070.01、SH30023.02）均購自美國Hyclone 公司；脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA；批號252805）購自美國Sigma 公司；兔微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociatedprotein 1 light chain 3，LC3）、p62、FBP1、mTOR、磷酸化mTOR （phosphorylated mTOR，pmTOR）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號分別為ab63817、ab109012、ab109732、ab134903、ab109268、ab8245、ab6721）均購自英國Abcam 公司；RIPA細胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒（批號分別為P0013J、P0010）均購自上海碧云天生物技術股份有限公司；綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-LC3質粒、FBP1 小干擾RNA及其陰性對照小干擾RNA（批號分別為91822、91889、91890）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；TurboFect 轉染試劑和RNA反轉錄試劑盒（批號分別為R0531、K1691）均購自美國Thermo FisherScientific公司。

1.3 動物

3 月齡SPF 級雌性SD大鼠40 只，體重（290±50）g，用于含藥血清的制備。大鼠由河南省實驗動物中心提供，動物生產許可證號為SCXK（豫）2020-0001。所有動物均飼養(yǎng)于溫度（23±1）?C、相對濕度（50±5）%、每12 h明暗循環(huán)的環(huán)境下，自由攝食、飲水。本動物實驗方案經河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會批準（批準文號PZ-HNSZYY-2022-070）。

1.4 細胞

人卵巢顆粒細胞KGN（批號CL-0603）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 四物湯顆粒藥液制備

按相關文獻[11]的組方配比制備四物湯顆粒藥液：取熟地黃、當歸、白芍、川芎配方顆粒，按飲片質量15∶10∶10∶6 混合，溶于生理鹽水中，制成相應濃度的四物湯顆粒藥液，備用。

2.2 空白血清和含藥血清制備

所有雌性SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d 后，隨機分為空白血清組和低、中、高劑量四物湯含藥血清組，每組10 只。四物湯顆粒成人用量為5 g/d，按成人體重60 kg 換算得日劑量，為0.083 3 g/（kg·d）；再進一步換算得大鼠給藥低劑量，為0.52 g/（kg·d）[12]?？瞻籽褰M大鼠灌胃等體積生理鹽水，低、中、高劑量四物湯含藥血清組大鼠分別灌胃四物湯顆粒0.52、1.04、2.08 g/（kg·d），每天灌胃2次，持續(xù)3 d。末次灌胃后3 h，各組大鼠經腹腔麻醉并于腹主動脈取血；血樣于4 ?C下靜置1 h，再以3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，過濾；血清于56 ?C 下滅活30 min，即得空白血清和低、中、高濃度四物湯含藥血清，于－20 ?C保存，備用。

2.3 藥物干預濃度篩選

取KGN 細胞，接種于含10% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，于37 ?C、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期后，以2×104個/孔接種于96 孔板中，并分為對照組（不進行任何處理）、DHEA 組（以50 μmol/L 的DHEA 處理48 h，以構建PCOS 細胞模型[13]）、空白血清組（以50 μmol/L 的DHEA處理48 h 后，再用10% 空白血清處理72 h）和低、中、高濃度四物湯含藥血清組（以50μmol/L 的DHEA 處理48 h 后，分別再用10% 低、中、高濃度四物湯含藥血清處理72 h[14]），并設置不含細胞、不含藥物的調零組，每組設置6 個復孔。每孔加入CCK-8溶液10 μL，反應2 h，使用酶標儀于450 nm波長下檢測各孔的吸光度（A）值并按下式計算細胞存活率：細胞存活率（%）＝（實驗組A值－調零組A值）/（對照組A值－調零組A值）×100%。根據(jù)檢測結果篩選后續(xù)實驗含藥血清的干預濃度。

2.4 細胞中自噬體數(shù)量檢測

取KGN 細胞，按2×105個/孔接種于24 孔板中，于37 ?C、5%CO2條件下孵育24 h，待細胞融合至70% 時進行GFP-LC3 質粒轉染（將GFP-LC3 質粒0.5 μg 與無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基100 μL 混合，隨后加入TurboFect轉染試劑2 μL混勻，轉染48 h），若熒光顯微鏡下可見細胞發(fā)出明顯的綠色熒光即為轉染成功。取轉染后的細胞，分為對照組、DHEA組、空白血清組、中濃度四物湯含藥血清組（四物湯含藥血清干預濃度根據(jù)“2.3”項下結果設置），各組細胞均按“2.3”項下方法處理，每組設置6個復孔。取各組細胞，用4% 多聚甲醛溶液于室溫下固定20 min，再加入0.02%Triton X-100 試劑于室溫下孵育5 min，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后，使用熒光顯微鏡觀察細胞中的自噬體（GFP-LC3 綠色熒光斑點）并記錄其數(shù)量。

2.5 細胞中自噬相關蛋白、mTOR蛋白、FBP1 蛋白及mRNA表達檢測

采用Western blot 法檢測相關蛋白表達。取對數(shù)生長期的KGN 細胞，按5×105 個/孔接種于6 孔板中，按“2.4”項下方法分組、處理。收集各組細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度后加熱變性。取變性蛋白30 μg 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移到硝酸纖維素膜上，用5% 脫脂奶粉于室溫下孵育2 h；洗膜后，加入自噬相關蛋白一抗（LC3、p62，稀釋比例分別為1∶900、1∶800）、通路相關蛋白一抗（FBP1、mTOR、p-mTOR，稀釋比例分別為1∶700、1∶700、1∶1 000）、內參蛋白一抗（GAPDH，稀釋比例為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例為1∶2 000），于37 ℃下孵育1 h；洗膜后，加入發(fā)光試劑，并置于化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)下顯影曝光。使用Image Lab 軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白的條帶灰度值比值表示目的蛋白的表達水平，再以LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的表達水平比值（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）表示自噬活性，以p-mTOR 與mTOR 的表達水平比值（p-mTOR/mTOR）表示mTOR蛋白的磷酸化水平。結果以對照組為參照進行歸一化處理。

采用實時熒光定量PCR法檢測FBP1 mRNA表達。取對數(shù)生長期的KGN細胞，按5×105個/孔接種于6 孔板中，按“2.4”項下方法分組、處理。收集細胞，經Trizol試劑裂解后，提取總RNA，經純度、含量檢測后，將其反轉錄合成cDNA，再以此cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR 反應體系包括cDNA 模板 1 μL，PCR 正/反向引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，雙蒸水 8μL，共20 μL。PCR 反應條件為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共循環(huán)40 次。以GAPDH 為內參，用2－ΔΔCt法計算FBP1 mRNA的表達水平。PCR 引物由北京擎科生物科技有限公司設計、合成。FBP1 正向引物序列為5′-CTCTATGGCATTGCTGGTTCTA-3′，反向引物序列為5′-CGTGGCAAAGGATGACTTTAAC-3′，擴增產物長度為108 bp；GAPDH正向引物序列為5′-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3′，反向引物序列為5′-ATTGGGCTCTTCCACACAGG-3′，擴增產物長度為166 bp。結果以對照組為參照進行歸一化處理。

2.6 敲低FBP1 對四物湯含藥血清作用的影響檢測

取KGN 細胞，按2×105個/孔接種于24 孔板中，于37 ?C、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細胞融合至80% 時進行細胞轉染[取陰性對照小干擾RNA 和FBP1 小干擾RNA各1 μg，分別與不含血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基（含TurboFect 轉染試劑2.5 μL）1 mL 混合，再與KGN 細胞共同孵育24 h，即得陰性對照小干擾RNA 轉染細胞和FBP1 小干擾RNA 轉染細胞，Western blot 檢測示二者FBP1 蛋白表達水平分別較未轉染細胞變化不大或顯著降低，即為轉染成功]。將KGN細胞和轉染細胞分為四物湯組（以50 μmol/L 的DHEA處理KGN細胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h）、四物湯+si-NC 組（以50 μmol/L 的DHEA 處理陰性對照小干擾RNA轉染細胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h）、四物湯+si-FBP1 組（以50 μmol/L 的DHEA 處理FBP1 小干擾RNA 轉染細胞48 h 后，再用10% 中濃度四物湯含藥血清處理72 h），每組設置6 個復孔。取各組細胞，按“2.3”項下方法檢測其存活率，按“2.5”項下方法檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-mTOR/mTOR 和p62蛋白、FBP1 蛋白及mRNA的表達水平。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢測。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 四物湯含藥血清干預濃度的篩選結果

與對照組（100%）比較，DHEA 組細胞的存活率[（35.4±3.6）%]顯著降低（P＜0.05）。與DHEA 組和空白血清組[（34.8±4.5）%]比較，低、中、高濃度四物湯含藥血清組細胞的存活率[（52.5±6.7）%、（78.3±7.8）%、（81.6±6.9）%]均顯著升高（P＜0.05）。其中，中濃度四物湯含藥血清組細胞的存活率與高濃度四物湯含藥血清組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），遂后續(xù)僅使用中濃度四物湯含藥血清進行實驗。

3.2 四物湯含藥血清對KGN細胞自噬及相關蛋白表達的影響

與對照組比較，DHEA組細胞中自噬體數(shù)量明顯增多，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高，p62 蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05）。與DHEA 組和空白血清組比較，中濃度四物湯含藥血清組細胞中自噬體數(shù)量明顯減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著降低，p62 蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.05）。結果見圖1、圖2、表1。

3.3 四物湯含藥血清對KGN 細胞中通路相關蛋白、mRNA表達的影響

與對照組比較，DHEA 組細胞中p-mTOR/mTOR、FBP1 蛋白及mRNA的表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與DHEA組和空白血清組比較，中濃度四物湯含藥血清組細胞中p-mTOR/mTOR、FBP1 蛋白及mRNA的表達水平亦顯著升高（P＜0.05）。結果見圖3、表2。

3.4 敲低FBP1 對四物湯含藥血清相關作用的影響

與四物湯組比較，四物湯+si-NC組細胞的存活率、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-mTOR/mTOR、p62 蛋白、FBP1 蛋白及mRNA的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與四物湯+si-NC組比較，四物湯+si-FBP1 組細胞的存活率、p62蛋白的表達水平、FBP1 蛋白及mRNA 的表達水平、pmTOR/mTOR 均顯著降低，LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ顯著升高（P＜0.05）。結果見圖4、表3。

4 討論

PCOS 患者的主要臨床表現(xiàn)包括卵泡發(fā)育異常、排卵障礙及流產[1]。作為卵泡發(fā)育的標志，卵巢顆粒細胞的生長分化是原始卵泡啟動和生長的關鍵，其能通過受體介導途徑調控生長期卵泡的發(fā)育及卵泡閉鎖，從而在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調控作用[15]。長期的臨床應用表明，四物湯用于女性月經紊亂相關疾病的療效確切[16]。現(xiàn)代中醫(yī)學認為，PCOS屬于“不孕”“閉經”范疇，主要病機為痰濕瘀血。該方中，君藥熟地黃可補血滋陰，臣藥當歸可補血行血，佐藥川芎可祛瘀止痛，佐藥白芍可養(yǎng)血調經，契合PCOS上述病機。本研究使用不同劑量的四物湯灌胃大鼠，制備了3 種不同濃度的四物湯含藥血清，CCK-8 實驗結果顯示，各濃度四物湯含藥血清對KGN細胞的存活均有促進作用。

研究表明，PCOS模型動物/患者的卵巢顆粒細胞自噬會被異常激活[17]。過度自噬會引起細胞結構受損，影響卵細胞正常發(fā)育，從而導致排卵障礙和性激素合成失調[4]。因此，通過改變卵巢顆粒細胞的自噬水平有望成為PCOS治療的有效途徑之一。根據(jù)研究報道，四物湯活性成分豆甾醇、β-谷甾醇及山柰酚均可抑制細胞自噬[18―19]，由此本課題組推測，該方可能具有調控卵巢顆粒細胞自噬水平的作用。本研究結果顯示，四物湯含藥血清可顯著下調KGN 細胞中自噬體數(shù)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，上調p62 蛋白的表達，升高mTOR 蛋白的磷酸化水平，說明四物湯含藥血清可抑制KGN細胞自噬。

學者發(fā)現(xiàn)，在高雄激素培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細胞及源自PCOS患者的誘導性多能干細胞中，F(xiàn)BP1 蛋白的表達均明顯升高[20―21]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，經DHEA 處理后，KGN細胞中FBP1 蛋白及mRNA的表達水平均顯著升高，與之前報道一致[7]；經四物湯含藥血清處理后，KGN細胞中FBP1 蛋白及mRNA的表達水平進一步升高；敲低FBP1 后，四物湯含藥血清對KGN細胞存活率的促進作用和對自噬的抑制作用均被減弱，說明FBP1在PCOS進展過程中具有保護作用，高水平的FBP1 可抑制卵巢顆粒細胞的自噬。

綜上所述，四物湯含藥血清可通過上調KGN細胞中FBP1 蛋白及mRNA的表達來促進mTOR蛋白的磷酸化，從而抑制其自噬，這可能是四物湯改善PCOS的潛在作用機制。

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（收稿日期：2024-07-23 修回日期：2024-12-25）

（編輯：鄒麗娟）