【摘 要】腸道屏障功能對(duì)機(jī)體健康至關(guān)重要，生理狀態(tài)下，腸道發(fā)揮屏障功能可有效防止機(jī)體內(nèi)環(huán)境受到有害物質(zhì)的侵害，保障機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。當(dāng)各種因素使機(jī)體內(nèi)環(huán)境受到侵害，可導(dǎo)致腸道屏障功能受損，腸道通透性增加，從而出現(xiàn)腸道內(nèi)菌群移位、內(nèi)毒素吸收等一系列病理改變。本文對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索、整理、歸納發(fā)現(xiàn)腸道屏障功能的檢測(cè)與評(píng)價(jià)方法較多，通過測(cè)定血液、尿液、糞便或腸道組織等標(biāo)本中的某些指標(biāo)，從體內(nèi)、體外2個(gè)方面對(duì)腸道屏障功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，總結(jié)了腸道屏障功能的評(píng)價(jià)方法，并分析了每種評(píng)價(jià)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為后續(xù)此領(lǐng)域的研究提供參考。

【關(guān)鍵詞】腸道屏障功能；評(píng)估技術(shù)；研究進(jìn)展

【中圖分類號(hào)】R57【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【收稿日期】2024-01-21基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（編號(hào)：82074558）。

Research progress on intestinal barrier function assessment techniques

Luo Fangli，Sun Luqiang，Wang Siqi，Hou Yujun，Li Ying，Zhou Siyuan

（College of Acupuncture and Massage，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine）

【Abstract】Intestinal barrier function is very important for overall health. Under physiological conditions，intestinal barrier can effec‐tively prevent the internal environment from being affected by harmful substances and ensure the stability of the internal environment. When the internal environment of the body is damaged by various factors，the intestinal barrier function can be impaired，leading to increased intestinal permeability and thus a series of pathological changes such as intestinal flora shift and endotoxin absorption. By searching，sorting，and summarizing relevant literature，the authors found that there are many methods for detection and evaluation of intestinal barrier function. Indicators measured using blood，urine，stool，or intestinal tissue samples have been used to evaluate intestinal barrier function both in vivo and in vitro. This paper summarizes the methods of intestinal barrier function evaluation，and analyzes the advantages and disadvantages of each evaluation method，in order to provide a reference for the subsequent research in this field.

【Key words】intestinal barrier function；evaluation technique；research progress

腸道屏障構(gòu)成了機(jī)體外部和內(nèi)部環(huán)境之間的界面，它主要由機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和微生物屏障構(gòu)成，四者共同維持其功能的完整性。正常情況下，腸道屏障具有維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的功能，它不僅可以選擇性地吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和電解質(zhì)[1]，還能防止有害物質(zhì)如毒素和細(xì)菌通過腸壁進(jìn)入全身臟器和組織。當(dāng)免疫、生物、理化、應(yīng)激等各種因素?fù)p傷腸道屏障功能時(shí)，可導(dǎo)致腸道通透性增加，從而出現(xiàn)腸道內(nèi)菌群移位、內(nèi)毒素吸收等一系列病理改變[2]，與消化、免疫、神經(jīng)、代謝等多系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。腸道通透性的增高是腸道屏障功能受損的標(biāo)志，目前研究多通過檢測(cè)腸道通透性來評(píng)估腸道屏障功能受損程度。經(jīng)查閱、整理、歸納文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)腸道屏障功能的評(píng)價(jià)方法主要從體內(nèi)和體外2個(gè)角度入手。因各方法適用情況不同，所以在臨床或動(dòng)物研究的運(yùn)用中均存在一定的局限性。本文介紹了腸道屏障的組成及功能，綜述了不同腸道屏障功能評(píng)估技術(shù)的運(yùn)用現(xiàn)狀，為腸道屏障功能相關(guān)研究的開展提供參考。

1 腸道屏障的組成及功能

腸道屏障主要由機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和微生物屏障構(gòu)成。機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞間緊密連接及覆蓋在上皮細(xì)胞表面的黏液層共同構(gòu)成，只允許水分子和小分子水溶性物質(zhì)有選擇性通過，能抑制細(xì)菌移位，在細(xì)胞旁的通透性中起至關(guān)重要的作用；化學(xué)屏障由腸上皮細(xì)胞所分泌的黏液、消化液及正常菌分泌的抑菌物質(zhì)組成，可以防止病原菌直接接觸腸上皮細(xì)胞；免疫屏障主要由腸道相關(guān)淋巴細(xì)胞組織和彌散免疫細(xì)胞組成，具有抵御病原微生物入侵、抗過敏反應(yīng)、抑制免疫應(yīng)答等功能；微生物屏障是由腸道共生微生物構(gòu)成，抵抗并排斥病原菌定植、入侵，以維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[4-5]。4個(gè)屏障之間相互協(xié)同，將腸腔內(nèi)物質(zhì)與機(jī)體內(nèi)環(huán)境相隔離，共同維持腸道屏障功能的完整性；當(dāng)各種因素?fù)p傷腸道屏障功能時(shí)，可導(dǎo)致腸道通透性增加，從而出現(xiàn)腸道內(nèi)菌群移位等一系列病理改變（圖1）。

有大量研究表明，腸道屏障功能受損與多種疾?。ㄈ缱陨砻庖咝约膊?、炎癥性腸病、1型糖尿病、乳糜瀉、多發(fā)性硬化癥、自閉癥譜系障礙、帕金森病、阿爾茨海默病等）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這些疾病不僅占用了大量的醫(yī)療資源，還嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3，6-9]。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確、客觀地評(píng)估腸道屏障功能受損情況，對(duì)于疾病的診斷和治療具有重要意義。

2 體內(nèi)腸道屏障功能評(píng)估技術(shù)

2.1 分子探針

目前，分子探針是較為傳統(tǒng)的評(píng)估腸道屏障功能的方法，它主要從細(xì)胞旁途徑檢測(cè)腸道通透性以評(píng)估腸道屏障功能，其具有簡(jiǎn)單、可靠、無創(chuàng)的特點(diǎn)。糖分子探針、同位素探針、聚乙二醇類探針、熒光探針和酚紅探針是目前常用的5類分子探針。不同的分子探針反映不同腸段腸道通透性的改變，其分子探針的分類及特點(diǎn)等相關(guān)信息，見表1。

2.2 細(xì)菌相關(guān)標(biāo)志物

2.2.1 內(nèi)毒素脂多糖 內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是位于革蘭陰性細(xì)菌外膜中的10～20 kD蛋白質(zhì)，主要通過跨細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)穿過上皮，當(dāng)腸道屏障功能受損時(shí)，腸道通透性增高，細(xì)菌內(nèi)毒素（如LPS）可以被轉(zhuǎn)移到循環(huán)系統(tǒng)中，增加機(jī)體血清中LPS水平。因此，LPS血清水平被認(rèn)為是腸道通透性增加的潛在標(biāo)志[18]。但是血液中LPS檢測(cè)的方法多種多樣，檢測(cè)結(jié)果之間可能存在很大的差異[19]，不同方法和個(gè)體的LPS水平差異很大，很難解釋檢測(cè)到的LPS的意義[20]。因此，在進(jìn)行腸屏障功能紊亂的檢測(cè)時(shí)，LPS最好與其他腸道通透性標(biāo)志物聯(lián)合使用。

2.2.2 LPS結(jié)合蛋白 LPS結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）是1種急性期蛋白，由肝細(xì)胞、脂肪組織和腸細(xì)胞產(chǎn)生，并在血流中釋放。LBP與革蘭陰性菌的外膜結(jié)合，被認(rèn)為是內(nèi)毒素血癥的標(biāo)志物和腸道通透性增加的生物標(biāo)志物[21]。相較于LPS，LBP更好測(cè)量。在急性和慢性疾病中，循環(huán)LBP水平存在不同，且容易受到飲食和感染的影響，為了提高可靠性，常需要反復(fù)測(cè)量血漿LBP[22]。雖然LBP比LPS更穩(wěn)定，但LPB水平升高僅表明血液中發(fā)生了針對(duì)LPS的免疫反應(yīng)，仍然無法判斷體內(nèi)的LPS的來源。

2.2.3 D-乳酸 D-乳酸是腸道固有細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物，哺乳動(dòng)物機(jī)體的其他組織均不產(chǎn)生D-乳酸，所以血漿中的D-乳酸基本上來源于腸道。在健康個(gè)體中D-乳酸水平很低，但在腸屏障功能喪失的情況下，細(xì)胞旁路徑增加導(dǎo)致腸道通透性增加，腸道中大量D-乳酸通過受損黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致血中D-乳酸水平增高[23]，因此，血中D-乳酸水平可及時(shí)反映腸黏膜損害程度和腸道通透性變化[24]。然而，D-乳酸的特異性較低，其含量的增加也可能與胃腸道中細(xì)菌數(shù)量的增加有關(guān)。因?yàn)榧?xì)菌的增加可能導(dǎo)致未消化的碳水化合物發(fā)酵為D-乳酸，導(dǎo)致其含量的增加，當(dāng)存在細(xì)菌過度生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋結(jié)果。

2.2.4 血清二胺氧化酶 血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）是1種位于腸黏膜上的細(xì)胞內(nèi)酶，具有高度的活性。大部分的DAO存在于小腸的黏膜及絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)[25]，因此，血液中的DAO可以反映小腸的功能及結(jié)構(gòu)狀況[26]。正常情況下，DAO在血清中含量極低，當(dāng)腸黏膜屏障功能受損時(shí)，DAO的釋放大量增加，DAO進(jìn)入細(xì)胞外空間、淋巴管和血流，從而提高了血清DAO的水平[27-28]。血清中的DAO活性與腸通透性呈負(fù)相關(guān)，因此，通過測(cè)定血清中的DAO水平可以反映腸黏膜損傷程度。目前，臨床上常用DAO活性的測(cè)定用于評(píng)估克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎或急性淋巴細(xì)胞白血病患者的腸道通透性。該檢測(cè)方法具有經(jīng)濟(jì)、便捷、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定的弊端，如易受溶血因素影響?？紤]到使用商業(yè)試劑盒用酶免疫測(cè)定法可以很容易地測(cè)量血清DAO活性，因此它可能成為未來評(píng)估腸道疾病患者腸通透性的一種方便方法。

2.2.5 結(jié)腸內(nèi)黏液細(xì)菌 結(jié)腸中存在一種黏液層，這層黏液由杯狀細(xì)胞中產(chǎn)生，可以有效的將腸道寄生菌與腸黏膜上皮細(xì)胞分開[29]。正常情況下細(xì)菌無法穿透結(jié)腸黏膜表面存在的黏液層，但在腸道屏障受損的情況下，管腔細(xì)菌進(jìn)入結(jié)腸內(nèi)黏液[29] 。因此，測(cè)量活組織檢查的結(jié)腸內(nèi)黏液中的細(xì)菌可以作為腸屏障功能和通透性的新標(biāo)志物。在臨床中這種檢查需要腸鏡輔助，具有一定的侵入性、其標(biāo)準(zhǔn)化也限制了其臨床應(yīng)用。與傳統(tǒng)的腸道通透性檢測(cè)相比，細(xì)菌相關(guān)的標(biāo)志物作為人類腸道通透性的標(biāo)志物的研究相對(duì)較少，檢測(cè)方法有待更加標(biāo)準(zhǔn)化。細(xì)菌相關(guān)標(biāo)志物可能反映腸道屏障的不同特征，可在未來相關(guān)研究中進(jìn)一步深入。

2.3 上皮細(xì)胞損傷生物標(biāo)志物

2.3.1 瓜氨酸 瓜氨酸是由小腸細(xì)胞產(chǎn)生的以谷氨酰胺為前體的1 種不與蛋白質(zhì)結(jié)合的氨基酸，合成后通過腸上皮細(xì)胞基底膜釋放并進(jìn)入門靜脈[30]，但不經(jīng)肝臟代謝，大部分在進(jìn)入體循環(huán)后被近端腎小管上皮細(xì)胞重吸收并轉(zhuǎn)化為精氨酸，血漿瓜氨酸水平取決于腸上皮細(xì)胞合成效率[31]。血清瓜氨酸已成為評(píng)估小腸質(zhì)量和表面積的有價(jià)值的生物標(biāo)志物，血清瓜氨酸水平越低，腸道上皮損傷越重[31]。因此，測(cè)定循環(huán)瓜氨酸水平能夠反映腸道上皮損傷的程度。由于瓜氨酸是1種非蛋白質(zhì)氨基酸，血漿中的水平將取決于食物的吸收，因此，其結(jié)果易受飲食因素影響。還應(yīng)該注意的是，腎功能對(duì)血液中瓜氨酸的濃度有很大的影響，在中度腎損害患者中發(fā)現(xiàn)瓜氨酸水平升高，因此在測(cè)定瓜氨酸期間應(yīng)監(jiān)測(cè)肌酐濃度。

2.3.2 脂肪酸結(jié)合蛋白 脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acidbinding protein，F(xiàn)ABP）是1 種存在于小腸和大腸的成熟腸細(xì)胞中的小細(xì)胞質(zhì)蛋白。FABP根據(jù)起源組織不同分為3 種類型： 肝臟、腎臟和腸道中存在的脂肪酸結(jié)合蛋白，回腸中存在的膽汁酸結(jié)合蛋白，以及主要存在于空腸中的腸道脂肪酸結(jié)合蛋白（intestinal fatty acid-binding protein，I-FABP）。IFABP是從腸道中分離出來的低分子量胞液蛋白，由于其分子量低且溶解度相對(duì)較好，當(dāng)腸上皮膜受損時(shí)，I-FABP容易釋放到血液中，并被腎臟迅速清除，它可以在尿液或血漿中測(cè)量[32]。I-FABP的生理水平反映了腸上皮細(xì)胞的交換率，而I-FABP水平升高可能表明腸屏障受損。因此，I-FABP已成為腸屏障功能障礙的潛在生物標(biāo)志物。大量研究表明，在患有腸缺血、全身性發(fā)炎反應(yīng)綜合征或壞死性小腸結(jié)腸炎的人群中發(fā)現(xiàn)尿液中I-FABP水平升高[33]。由于FABP的多樣性取決于它們起源的組織，測(cè)量尿液和/或血漿中的單個(gè)蛋白質(zhì)可以成為定位組織損傷的有價(jià)值的工具。目前已有的檢測(cè)血清或尿液中I-FABP的試劑盒可望在人類腸道疾病中得到更廣泛的應(yīng)用。

2.3.3 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）是1 種胞質(zhì)酶的家族，包括αGST、μGST、πGST和θGST，其中αGST在腸道內(nèi)廣泛分布，通過與谷胱甘肽結(jié)合而參與細(xì)胞保護(hù)、抗氧化和細(xì)胞內(nèi)有毒和外來化合物的解毒。當(dāng)細(xì)胞膜被破壞時(shí)，它參與排毒并從多種細(xì)胞中釋放出來。監(jiān)測(cè)血漿GST濃度可以評(píng)估腸道損傷及其嚴(yán)重程度[34]，因此，αGST已被提議作為腸上皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志物。但是，αGST不僅存在于腸中，還在肝臟、腎臟的上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，因此，血漿或尿液中αGST水平升高可提示腸損傷以及肝和腎損傷。所以αGST作為腸道屏障損傷的標(biāo)志物的1個(gè)缺點(diǎn)是其特異性低，并且只有在消除了其他疾病的情況下才有用。

2.4 其他生物標(biāo)志物

2.4.1 糞鈣衛(wèi)蛋白 糞鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin，CP）是腸道黏膜上皮細(xì)胞上的1種蛋白質(zhì)，正常情況下只存在于腸道內(nèi)中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中，不應(yīng)該進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。如果糞鈣衛(wèi)蛋白濃度升高，說明腸道屏障受損，腸道通透性增加，允許有害物質(zhì)和細(xì)菌穿過屏障進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。許多研究已經(jīng)確定糞鈣衛(wèi)蛋白是腸道炎癥的敏感標(biāo)志物[35]。在臨床中，糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)可用于診斷壞死性腸炎，區(qū)分炎癥性腸病和腸易激綜合征，還可用于監(jiān)測(cè)炎癥性腸病治療和評(píng)估治療反應(yīng)[36]。糞鈣衛(wèi)蛋白成分較為穩(wěn)定，有較好的耐熱性，不易被細(xì)菌和各種酶類破壞，還具有檢測(cè)無創(chuàng)、患者接受程度高和操作方便等多種優(yōu)點(diǎn)[37]。

2.4.2 α1-抗胰蛋白酶 α1-抗胰蛋白酶（alpha-1-antitryp‐sin，AAT）是1種常見的絲氨酸蛋白酶抑制劑，相對(duì)分子質(zhì)量為51.8 kD，主要是由肝臟合成，具有抗蛋白酶活性，可不在胃腸道內(nèi)發(fā)生蛋白質(zhì)水解并以完整結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在糞便中。在急性炎癥期間，AAT的濃度可能增加很多倍，當(dāng)AAT從血液進(jìn)入腸腔時(shí)，由于腸黏膜的炎癥和潰瘍以及腸通透性的增加，可在糞便中檢測(cè)到高濃度的AAT。因此，糞便AAT含量表明損失蛋白質(zhì)進(jìn)入腸腔，用作腸道蛋白損失的標(biāo)志物[38]，可反映腸黏膜屏障破壞程度，已被公認(rèn)為腸道通透性的標(biāo)志。有一種商業(yè)試劑盒可以測(cè)量糞便AAT，研究人員正在探索這種檢測(cè)方法的應(yīng)用，尤其是在患有腸道疾病的嬰兒中[39]。該檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、方便，但無疾病特異性。

2.4.3 連蛋白 連蛋白是1 種在腸道和肝細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)，是人內(nèi)源性細(xì)菌腸毒素閉環(huán)帶毒素的類似物，通過分解腸上皮中的緊密連接蛋白復(fù)合物來調(diào)節(jié)腸通透性。連蛋白從腸中釋放，可在血液樣品中測(cè)量，血清連蛋白與腸通透性增加相關(guān)，是最早被用于腸道通透性血液檢測(cè)的生物標(biāo)志物，其水平升高與乳糜瀉和肥胖等疾病密切相關(guān)[40]。盡管血清連蛋白在人類疾病中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究，但連蛋白在調(diào)節(jié)腸道通透性方面的重要作用已經(jīng)確立，并將在未來的應(yīng)用中具有很大的前景。

2.5 腸黏膜組織學(xué)觀察

通過光鏡、電鏡、共聚焦激光顯微內(nèi)鏡等直接觀察腸黏膜組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)及其損傷程度，是評(píng)估腸道屏障功能最直接的方法。

光鏡可觀察絨毛長(zhǎng)度、隱窩數(shù)量及深度、炎癥浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞的數(shù)量及糖胺聚糖的改變等情況，結(jié)合相應(yīng)的指標(biāo)給出病理評(píng)分，以判斷腸黏膜損傷的程度[41-42]。電鏡可觀察上皮細(xì)胞間隙、細(xì)胞間緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)，上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體的密度、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)改變，杯狀細(xì)胞的大小和密度等[43-45]。以上這些指標(biāo)可以從超微結(jié)構(gòu)水平反映腸道黏膜屏障的損傷情況，在一定程度上可以反映腸黏膜屏障的通透性。

共聚焦激光顯微內(nèi)窺鏡檢查（confocal laser endomicros‐ copy，CLE）是一種新型內(nèi)窺鏡成像工具，具有復(fù)雜的高分辨率技術(shù)，通過將共聚焦激光顯微鏡整合到傳統(tǒng)內(nèi)窺鏡的遠(yuǎn)端，突出消化道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的異常，可實(shí)現(xiàn)腸道黏膜變化的可視化，在檢查過程中，使用激光束產(chǎn)生488 nm的激發(fā)波，它可以穿透250 μm的黏膜，獲得7 μm的光學(xué)切片，相當(dāng)于活體組織學(xué)圖像，激光束指向組織表面，光被反射到透鏡上，然后透鏡通過1個(gè)水平孔在同一平面上重新聚焦，產(chǎn)生放大圖像高達(dá)1 000倍，圖像可以以數(shù)字方式存儲(chǔ)[46]。CLE檢查時(shí)靜脈注射或局部噴灑熒光劑，可突出黏膜某些成分，提高實(shí)時(shí)“光學(xué)活檢”的靈敏度。腸屏障受損，腸上皮細(xì)胞之間的間隙的增強(qiáng)，熒光素滲漏到腸腔中，激光共聚焦探針能直接可視化[46]。通過檢測(cè)腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞密度、上皮破裂、腔熒光素滲漏、腸細(xì)胞之間存在的熒光素量、緊密連接狀態(tài)以及絨毛間隙變寬來評(píng)價(jià)腸屏障破壞的程度[46]。

腸黏膜組織的組織學(xué)評(píng)估方法可以評(píng)估腸道黏膜結(jié)構(gòu)變化的信息，以上所有評(píng)估方法需要取腸道活組織，有一定的侵入性，使其在臨床上應(yīng)用相對(duì)較少，更多地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。與標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)相比，雖然CLE具有動(dòng)態(tài)分析腸屏障功能和形態(tài)特征的優(yōu)勢(shì)，但因其視野小、成本及技術(shù)要求較高，也限制了它的應(yīng)用。

3 體外腸道屏障功能評(píng)估技術(shù)

3.1 尤斯室

尤斯室于1951年首次被描述，其通過模擬體內(nèi)生理環(huán)境來測(cè)量離子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥物等在各種上皮組織中的轉(zhuǎn)運(yùn)[47]。尤斯室系統(tǒng)由2個(gè)半室組成，2個(gè)半室中間有1個(gè)樣本夾可夾持固定組織樣本，使得組織的兩邊分別面對(duì)2個(gè)半室。在這種結(jié)構(gòu)中，2個(gè)半室之間的交流都要通過組織進(jìn)行的。通過測(cè)量探針（異硫氰酸熒光素標(biāo)記葡聚糖、辣根過氧化物酶等）通過率或經(jīng)上皮電阻值/細(xì)胞跨膜電阻值來檢測(cè)腸道通透性，高探針通過率和低經(jīng)上皮電阻值/細(xì)胞跨膜電阻值表明通透性增加[48]。尤斯室被廣泛用于人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體外研究，是目前較先進(jìn)的一種評(píng)估腸道屏障功能的方法，其主要優(yōu)點(diǎn)是能夠測(cè)量胃腸道特定區(qū)域的通透性和離子運(yùn)輸，標(biāo)記的細(xì)菌或抗原可以用作生物學(xué)相關(guān)的探針，可以通過在腔室或單層的頂端側(cè)添加拮抗劑或激動(dòng)劑來進(jìn)行機(jī)制研究。因其需要活組織檢查或手術(shù)取腸道組織標(biāo)本，具有一定侵入性。然而，值得注意的是，活檢組織從機(jī)體移除后，缺乏與神經(jīng)和管腔內(nèi)容物的接觸，可能無法反映體內(nèi)過程的復(fù)雜性，所以其并不能完全反映腸屏障功能[49]。此外，活檢組織細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)過程中的存活時(shí)間受到質(zhì)疑，細(xì)胞培養(yǎng)條件的差異也可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)的顯著差異，使研究之間的比較變得困難[49]。

3.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)

目前常用Caco-2細(xì)胞系、T84細(xì)胞系、SK-CO15細(xì)胞系、HT-29細(xì)胞系等體外細(xì)胞培養(yǎng)作為評(píng)估腸黏膜通透性模型。

Caco-2表達(dá)了運(yùn)輸細(xì)胞特性，母體細(xì)胞系起源于結(jié)腸，由人類結(jié)腸腺癌發(fā)展而來，是研究腸屏障功能時(shí)最常用的細(xì)胞系之一。雖然是結(jié)腸起源，細(xì)胞自發(fā)分化成一個(gè)極化單層表達(dá)腸細(xì)胞的幾個(gè)形態(tài)和功能特征。因此，該細(xì)胞系具有小腸的共同特征。Caco-2細(xì)胞系提供了小腸上皮模型，可用于研究上皮-顆粒/細(xì)菌/探針的相互作用及其對(duì)腸道通透性的影響[50]。

與Caco-2類似，T84細(xì)胞系也起源于結(jié)腸，來源于結(jié)直腸腺癌的肺轉(zhuǎn)移。細(xì)胞系自發(fā)分化為單層，融合后呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能成熟的吸收性上皮細(xì)胞[51]。然而，與Caco-2細(xì)胞系相反，T84細(xì)胞在整個(gè)分化過程中并沒有獲得小腸特征，而是保留了許多原有的結(jié)腸特征。因此，與Caco-2相比，T84細(xì)胞系是研究結(jié)腸屏障功能的更好模型。

SK-CO15細(xì)胞系來源于人結(jié)腸腺癌，在不滲透細(xì)胞培養(yǎng)支架上培養(yǎng)時(shí)形成緊密極化上皮，具有頂端連接復(fù)合物和圓頂。SK-CO15細(xì)胞系類似于結(jié)腸上皮，缺乏常見的小腸分化標(biāo)志物。目前，SK-CO15細(xì)胞已被用于研究乙醇誘導(dǎo)的結(jié)腸屏障破壞[52]，以及通過黏附和緊密連接研究結(jié)腸腸屏障功能的調(diào)節(jié)[53]。

HT29細(xì)胞屬于異質(zhì)性腺癌細(xì)胞系，在分化時(shí)呈現(xiàn)小腸結(jié)構(gòu)。黏液層是腸屏障的重要組成部分，由于HT29細(xì)胞能夠產(chǎn)生黏液，因此它被廣泛用作研究共生菌和致病菌對(duì)宿主細(xì)胞黏附的模型。HT29克隆來源于HT29的單細(xì)胞，并在葡萄糖中的標(biāo)準(zhǔn)條件下自發(fā)極化，并顯示出通透性研究的重要特征，如微絨毛、緊密連接和高跨膜電阻。因此，這種特定的克隆可以作為一種替代方案，用于模擬腸道屏障[54-55]。

單獨(dú)的細(xì)胞系可視為腸上皮的簡(jiǎn)單模型，其缺乏與免疫細(xì)胞的接觸以及來自神經(jīng)和腔內(nèi)刺激的信號(hào)，因此無法完全模擬正常的腸道內(nèi)狀態(tài)，這對(duì)腸屏障功能的研究有很大影響。為了建立更真實(shí)的體外模型來模擬腸道內(nèi)的環(huán)境，可以建立幾種細(xì)胞系共培養(yǎng)模型，甚至三重培養(yǎng)模型[56]。

3.3 腸道類器官

為了更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)腸道的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，腸道類器官應(yīng)運(yùn)而生。腸道類器官模型整合了三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和干細(xì)胞生物學(xué)的優(yōu)勢(shì)以模擬腸道細(xì)胞形態(tài)。腸道類器官來源于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。與類腸一樣，iPSCs衍生的類腸器官在富含生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基存在的細(xì)胞外支持基質(zhì)中生長(zhǎng)，由此產(chǎn)生的類腸器官具有與類腸相似的形態(tài)[57]。由于iPSCs衍生的腸類器官保留了腸細(xì)胞的特異性和功能，因此腸類器官成為了以活檢組織為基礎(chǔ)的研究腸道通透性的可行替代方法。目前，多用Lgr5+干細(xì)胞培養(yǎng)出具有完整腸道上皮結(jié)構(gòu)的球狀3D腸道類器官，其內(nèi)部為空心，包括了所有種類的腸上皮功能細(xì)胞（包括腸上皮的吸收性腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、簇狀細(xì)胞和M細(xì)胞），使腸類器官成為研究腸屏障功能的一個(gè)非常重要的新模型，該模型與transwell系統(tǒng)結(jié)合，以促進(jìn)宿主-微生物相互作用及腸道屏障的功能研究[58-59]。此外，還有研究在腸道類器官中使用離體尤斯室對(duì)腸道屏障進(jìn)行了深入的研究[60-61]。腸道類器官是研究腸道和腸道屏障功能的一個(gè)新模型，它在一定程度上代表了體內(nèi)上皮細(xì)胞的復(fù)雜性和患者之間的異質(zhì)性[62]。腸道類器官在技術(shù)操作上比細(xì)胞系要求更高，目前研究相對(duì)較少，其研究技術(shù)還有待進(jìn)一步深入發(fā)展。

4 結(jié)語與展望

腸道屏障構(gòu)成機(jī)體外部環(huán)境和內(nèi)部環(huán)境之間的界面，對(duì)機(jī)體健康至關(guān)重要。腸道屏障功能損傷可使腸道內(nèi)菌群移位、內(nèi)毒素吸收，導(dǎo)致多種慢性病癥[2]的發(fā)生，其損傷程度的輕重往往與疾病的病情和預(yù)后密切相關(guān)。腸道通透性是腸道屏障的一種功能特征，其增高是腸道屏障功能受損的標(biāo)志，因此，監(jiān)測(cè)腸道屏障功能損傷情況對(duì)于疾病的診斷和治療具有重要意義。目前，用于檢測(cè)腸道通透性的方法較多，本研究對(duì)其具體運(yùn)用及未來研究方向進(jìn)行了如下探討。

分子探針類檢測(cè)方法都是非侵入性的，耗時(shí)較長(zhǎng)，可允許動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)。然而，因其檢測(cè)樣本為尿液，實(shí)驗(yàn)中需要專門的設(shè)備（如代謝籠）來精確收集動(dòng)物的尿液。雖然使用不同的探針可以明確屏障損傷（即小腸與大腸）的總體位置，但很難確定其確切位置。值得注意的是，胃腸道運(yùn)動(dòng)、血流量、腎功能、微生物組成等會(huì)影響探針的吸收和藥代動(dòng)力學(xué)，并影響體內(nèi)檢測(cè)結(jié)果。因此，特別是在基礎(chǔ)動(dòng)物研究中，不建議單獨(dú)使用這些檢測(cè)方法，可以結(jié)合其他可能的體外或離體方法。此外，由于沒有標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方案，研究之間存在巨大差異，很難進(jìn)行比較研究。在今后的研究中，研究者可以將使用的探針、測(cè)試持續(xù)時(shí)間和禁食時(shí)間都保持一致，盡量減少一些混雜因素，這樣可以幫助減少研究間的差異。

生物標(biāo)志物的檢測(cè)因其不需要事先給藥，相對(duì)來說更節(jié)省時(shí)間。大多數(shù)生物標(biāo)志物檢測(cè)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，可使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)。然而，這些生物標(biāo)志物與慢性疾病中大分子的功能通透性之間的相關(guān)性尚未得到很好的驗(yàn)證，這可能是未來研究的一個(gè)主要領(lǐng)域。迄今為止，大部分生物標(biāo)志物的評(píng)估僅限于檢測(cè)急性腸道損傷，而這些方法是否可以作為慢性疾病中腸通透性增加的可靠標(biāo)志物，或作為屏障靶向治療的臨床終點(diǎn)，還有待檢驗(yàn)。組織學(xué)檢查需要取腸道活組織，有一定的侵入性，臨床上需結(jié)合內(nèi)鏡檢查，在一定程度上限制了其應(yīng)用，目前更多用于基礎(chǔ)研究。新的成像技術(shù)，如CLE可實(shí)現(xiàn)腸道黏膜變化的可視化，為在體評(píng)估腸道上皮屏障變化提供了可能[46]，甚至還可以預(yù)測(cè)內(nèi)鏡檢查結(jié)果正常的炎癥性腸病患者的復(fù)發(fā)[63-64]。

與體內(nèi)方法相比，體外技術(shù)為研究人體腸道屏障和個(gè)體細(xì)胞的機(jī)械過程提供了可能性。傳統(tǒng)的細(xì)胞單層系統(tǒng)通常用于跨腸腔的藥物滲透性的高通量評(píng)估，然而，因其缺乏藥物代謝酶，這限制了它們的應(yīng)用。尤斯室系統(tǒng)利用新鮮分離的人類腸道組織片段，有效地維持藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和功能，從而能夠更全面地評(píng)估腸道吸收。然而，該系統(tǒng)仍有一些局限性，如切除組織的生存能力相對(duì)較弱，并且需要多個(gè)供體樣本來解釋個(gè)體間和實(shí)驗(yàn)間的差異，這限制了其在常規(guī)藥物篩選中的應(yīng)用。與Caco-2細(xì)胞等傳統(tǒng)模型相比，腸道類器官以更接近體內(nèi)條件的方式更好地復(fù)制器官功能，更好地模擬了人體腸道中藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)因子的表達(dá)和功能。該系統(tǒng)克服了尤斯室系統(tǒng)的主要局限性，為常規(guī)藥物篩選和候選藥物選擇方面提供了巨大的前景[65]。然而，腸道類器官維護(hù)的成本較高和技術(shù)也較為復(fù)雜，目前研究相對(duì)較少，缺乏全面的研究數(shù)據(jù)，未來需要進(jìn)一步的研究來評(píng)估該系統(tǒng)運(yùn)輸/代謝活性的內(nèi)在個(gè)體間變化的能力。此外，該系統(tǒng)有望成為研究腸道藥物吸收物種差異的有價(jià)值工具，需要在這方面進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

目前，許多研究通常單獨(dú)采用一種方法來測(cè)量腸道通透性。雖然在臨床實(shí)踐中可能存在一定的困難，但仍建議多種方法聯(lián)合使用，如功能成像方法與生物標(biāo)志物分析相結(jié)合。在基礎(chǔ)研究中，用體外方法或形態(tài)學(xué)分析補(bǔ)充體內(nèi)功能檢測(cè)結(jié)果，可以加強(qiáng)數(shù)據(jù)的可靠性并為機(jī)制研究提供線索。當(dāng)使用和解釋得當(dāng)，腸通透性檢測(cè)可以為研究人員提供有關(guān)腸道屏障完整性狀態(tài)及靶向治療的依據(jù)。未來的研究還可以從以下幾方面著手：①努力使臨床檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化，混雜因素最小化；②驗(yàn)證通透性生物標(biāo)志物與慢性疾病中大分子的功能通透性之間的相關(guān)性，并將其與體內(nèi)大分子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，可能開發(fā)疾病治療的靶點(diǎn)；③對(duì)腸道通透性檢測(cè)與預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)方面進(jìn)行相關(guān)性研究，可能為疾病防治提供一定依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：曾 玲）

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