于曉明，侯立婷，張元鵬，王義偉，喬緒穩(wěn)，鄭其升*，陳 瑾*， 侯繼波

(1.國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所，江蘇南京210014；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009)

口蹄疫(Foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是一類動物傳染病，主要侵害偶蹄動物。該病傳播速度快、傳染性強、危害嚴(yán)重，是我國強制免疫的動物疫病之一，疫苗免疫是控制和預(yù)防該病的主要手段[1]。但研究顯示當(dāng)前豬FMD 疫苗免疫30 d 后，抗體合格率僅26 %～60 %[2]，免疫后3 個月抗體水平顯著下降；另外，對不同廠家的O 型FMD 疫苗進行免疫后的抗體水平監(jiān)測，結(jié)果免疫后3 個月抗體基本下降到免疫保護臨界值，表明疫苗免疫后實際抗體水平及保護期遠達不到產(chǎn)品說明書標(biāo)示的6 個月保護期[3-4]。如何提高疫苗免疫后的抗體水平，進而提升現(xiàn)有疫苗的免疫效力，已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。

現(xiàn)代疫苗免疫理論認(rèn)為，高效疫苗必須包括3種成份：抗原、免疫增強劑和運送系統(tǒng)。免疫增強劑包括多肽、脂質(zhì)、核酸、多糖、糖脂、脂多肽和糖多肽等。其免疫增強機制主要包括兩條途徑，一是免疫增強劑與抗原遞呈細胞(DC)受體結(jié)合，激活先天性固有免疫系統(tǒng)，進而提高獲得性免疫反應(yīng)的強度和質(zhì)量；二是免疫增強劑與T 淋巴細胞結(jié)合，能夠直接提高特異性免疫反應(yīng)的強度和質(zhì)量[5]。本研究中的CVC1302 是經(jīng)過大量體內(nèi)、體外試驗篩選獲得的，含有單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰二肽、β- 葡聚糖的復(fù)方免疫增強劑，將其用于豬FMD 疫苗，全面評價其免疫增強效果，為提高現(xiàn)有FMD 疫苗的免疫效力提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 單磷酰脂質(zhì)A 購自北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司；胞壁酰二肽購自上海瀚鴻科技有限公司；β- 葡聚糖購自河北科隆多生物科技有限公司；豬O 型口蹄疫病毒(FMDV)MY98 株滅活抗原，由內(nèi)蒙古金宇集團提供，完整的FMDV 粒子(146S)含量為8.7 μg/mL；ISA 206 佐劑購自法國SEPPIC 公司；50 日齡健康仔豬[液相阻斷ELISA (LPB-ELISA)抗體滴度≤1:8]，由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心實驗豬場提供；O 型FMD 商品化滅活疫苗(批號：H160505J)、O/A/Asia-1 三價商品化滅活疫苗(批號：20160409)、FMD 合成肽商品疫苗(批號：2016090297522)由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心提供；O 型FMD LPB-ELISA 抗體檢測試劑盒(批號：20160811101-3)、A 型FMD LPB-ELISA 抗體檢測試劑盒(批號：20160812102-1)、Asia I 型FMD LPB-ELISA 抗體檢測試劑盒(批號：20160801101-2)購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；FMDV VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 試劑盒購自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司(批號：201608012)。

1.2 口蹄疫疫苗的配制 配制含不同劑量CVC1302的FMD 疫苗，CVC1302 高中低劑量見表1，對應(yīng)制備的疫苗簡稱為FMD-CVC1302-H、FMD-CVC1302-M、FMD-CVC1302-L，不含CVC1302 的疫苗稱為FMD (下同)。配制方法：將CVC1302 添加到FMD MY98 株抗原中混勻，制備成水相，再與ISA 206按照體積比46∶54 充分乳化，最終每頭份(2 mL)含有3 μg 146S。

表1 每頭份FMDV 中CVC1302 組分表Table 1 CVC1302 components per dose FMDV

1.3 免疫增強劑最佳免疫劑量的篩選 將40 頭50日齡健康仔豬隨機分為4 組，10 頭/ 組，分別采用頸部肌肉注射免疫疫苗FMD-CVC1302-H、FMDCVC1302-M、FMD-CVC1302-L、FMD。免疫后28 d采血，分離血清，采用LPB-ELISA 試劑盒檢測FMD抗體水平，分析數(shù)據(jù)，篩選免疫增強劑的最佳劑量(后續(xù)試驗均采用篩選的最佳劑量作為佐劑免疫動物)。

1.4 含免疫增強劑的O 型FMD 疫苗的免疫持續(xù)期監(jiān)測 將120 頭50 日齡左右健康仔豬隨機分為2組，60 頭/ 組，分別經(jīng)頸部肌肉注射免疫疫苗FMD-CVC1302 和FMD 對照組，2 mL/ 頭。分別于免疫后28 d、60 d、90 d、120 d、150 d 與180 d 采血，分離血清，采用LPB-ELISA 試劑盒檢測FMD抗體水平。

1.5 含免疫增強劑的FMD 疫苗對同源病毒的攻毒保護率試驗 將32 頭50 日齡左右健康仔豬，隨機分為3 組：FMD-CVC1302 組(15 頭)、FMD (15 頭)組、PBS (2 頭)組。FMD-CVC1302 組和FMD 組內(nèi)又設(shè)3 個不同免疫劑量組，每組5 頭，分別免疫1 頭份劑量(2 mL/ 頭)，1/3 頭份劑量(0.67 mL/ 頭)，1/9頭份劑量(0.22 mL/ 頭)；PBS 組豬免疫2 mL PBS。免疫后28 d 采血，分離血清，采用LPB-ELISA 方法檢測FMD 抗體水平。免疫后28 d 對所有的豬經(jīng)肌肉注射攻擊1 000 半數(shù)感染量(PID50)O 型FMDV MYA98 株，攻毒后觀察豬的臨床癥狀，采用Karber法計算各組豬的半數(shù)保護量(PD50)，共觀察10 d。

1.6 免疫增強劑對不同商品化疫苗的免疫效力評價

1.6.1 CVC1302 對O 型FMD 滅活疫苗的免疫效力評價將最佳劑量的CVC1302 添加到O 型FMD 滅活疫苗中，充分混勻。將60 頭50 日齡左右健康仔豬，隨機分為3 組，20 頭/ 組，分別采用頸部肌肉注射免疫含CVC1302 的O 型FMD 滅活疫苗、O 型FMD 滅活疫苗和PBS。免疫后28 d 采血，采用O型FMD LPB-ELISA 檢測血清中FMD 抗體水平。

1.6.2 免疫增強劑對O/A/Asia-1 三價滅活疫苗的免疫效力評價將最佳劑量的CVC1302 添加到O/A/Asia-1 三價滅活疫苗中，充分混勻。將100 頭50 日齡左右健康仔豬隨機分為3 組，分別采用頸部肌肉注射免疫含CVC1302 的O/A/Asia-1 三價滅活疫苗(40 頭)、O/A/Asia-1 三價滅活疫苗(40 頭)和PBS(20 頭)。免疫后28 d 采血，分離血清，采用O 型、A 型與Asia-1 型FMD LPB-ELISA 檢測各組豬對應(yīng)亞型的抗體水平。

1.6.3 免疫增強劑對合成肽疫苗的免疫效力評價將最佳劑量的CVC1302 添加到合成肽疫苗中，充分混勻。將60 頭50 日齡左右健康仔豬隨機分為3 組，20 頭/組，分別經(jīng)頸部肌肉注射含CVC1302 的合成肽疫苗、合成肽疫苗和PBS。免疫后28 d 采血，分離血清，分別采用FMD LPB-ELISA 和FMDV VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 試劑盒檢測各組豬的液相阻斷抗體水平和VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體水平。

2 結(jié) 果

2.1 免疫增強劑最佳使用劑量的篩選結(jié)果 含免疫增強劑CVC1302 高中低劑量的FMD 疫苗免疫豬后28 d 采血，采用O 型FMD LPB-ELISA 試劑盒檢測血清抗體水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)MD-CVC1302-M 組豬的平均抗體水平極顯著高于其它兩個組1 個滴度(p＜0.01)，抗體水平離散度??；FMD-CVC1302-H 組和FMD-CVC1302-L 組之間抗體水平無顯著性差異(p＞0.05)(圖1)。但與對照組相比，添加CVC1302的免疫組豬抗體提高約3 個滴度。結(jié)果表明，中間劑量的CVC1302 對提高O 型FMD 疫苗的免疫效果最好，且考慮實際應(yīng)用的生產(chǎn)成本，確定CVC1302-M 為最佳劑量，后續(xù)試驗選用該劑量免疫。

圖1 CVC1302 最佳免疫劑量的篩選結(jié)果Fig.1 Screening for optimum immue dose of CVC1302

2.2 含免疫增強劑的O 型FMD 疫苗的免疫持續(xù)期監(jiān)測 將FMD-CVC1302、FMD 疫苗分別免疫60 頭仔豬，于免疫后28 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d 采血，監(jiān)測抗體效價。結(jié)果顯示，疫苗單次免疫后28 d，F(xiàn)MD-CVC1302 組豬的平均LPB-ELISA抗體效價為28，極顯著高于FMD 組(p＜0.01)，免疫后180 d 豬的LPB-ELISA 抗體效價的平均值為27.7，合格抗體(LPB-ELISA 抗體效價≥26)持續(xù)期≥180 d(6 個月)，免疫后6 個月豬LPB-ELISA 抗體合格率高于90 %；而FMD 組豬在免疫后28 d 的平均LPB-ELISA 抗體效價為25，隨著免疫時間的延長，抗體水平一直處于下降的趨勢，免疫后6 個月已經(jīng)檢測不到LPB-ELISA 抗體[(當(dāng)LPB-ELISA 抗體滴度小于1∶8 (即23)，為陰性)](圖2)。表明含免疫增強劑CVC1302 的豬O 型FMD 疫苗單次免疫就可以顯著提高該疫苗的免疫效力。

圖2 O 型口蹄疫疫苗免后抗體持續(xù)期的檢測結(jié)果Fig.2 Duration of immunity by O type FMDV vaccine of O type

2.3 含免疫增強劑的FMD 疫苗對同源病毒的攻毒保護率結(jié)果 50 日齡健康仔豬免疫不同F(xiàn)MD 及不同劑量FMD 疫苗后28 d 用O 型FMDV 攻毒，攻毒后10 d，F(xiàn)MD-CVC1302 所有免疫劑量組均無FMD臨床癥狀的發(fā)生，能夠達到100 %保護。免疫FMD 1 頭份組豬攻毒后無臨床癥狀，能夠達到100 %保護；免疫1/3 頭份組豬攻毒后1 頭右蹄有水泡，攻毒保護率80 %；免疫1/9 頭份組豬攻毒后第6 d、10 d 有3 頭出現(xiàn)體溫升高，蹄部出現(xiàn)水泡，跛行，攻毒保護率為40 %；對照組2 頭豬在攻毒后第3 d出現(xiàn)明顯的臨床癥狀(表2)。表明免疫增強劑能夠提高O 型FMD 疫苗對同源病毒的攻毒保護率。

表2 仔豬免疫各FMD 疫苗后的攻毒保護率Table 2 Protection ratio of FMDV challenge post FMD vaccination in piglets

2.4 免疫增強劑對不同商品化疫苗的免疫效力評價

2.4.1 CVC1302 對O 型口蹄疫滅活疫苗的免疫效力評價將不同的O 型FMD 滅活疫苗及PBS 分別免疫仔豬后，采用O 型FMD LPB-ELISA 抗體檢測試劑盒檢測其免疫效力。結(jié)果顯示，F(xiàn)MD-CVC1302 組豬的平均LPB-ELISA 抗體效價為28.65，與FMD 組豬的平均LPB-ELISA 抗體效價25.15 相比，差異極顯著(p＜0.01)，PBS 組豬的抗體水平均為陰性(LPB-ELISA 抗體滴度≤23)，添加CVC1302 后豬的抗體合格率由60 % (12/20)升至100 % (20/20)(圖3)。表明免疫增強劑能夠顯著提高商品化O 型FMD疫苗的免疫效力。

2.4.2 CVC1302 對O/A/Asia-1 三價滅活疫苗的免疫效力評價將不同的三價滅活疫苗及PBS 分別分別免疫仔豬，利用3 種亞型FMD LPB-ELISA 抗體檢測試劑盒檢測其免疫效力。結(jié)果顯示，含CVC1302的三價滅活疫苗組豬的O 型、A 型、Asia-1 型的抗體水平均極顯著高于不含佐劑組(p＜0.01)，PBS 組豬的抗體水平均為陰性，添加CVC1302 后，豬O 型抗體的合格率由55 % (11/20)提高至82.5 % (33/40)，A 型抗體合格率由40%(8/20)提高至97.5%(39/40)，Asia I 型抗體合格率由20%(4/20)提高至60%(24/40)(圖4)。表明免疫增強劑能極顯著提高商品化O/A/Asia I 三價滅活疫苗的免疫效力。

圖3 免疫豬O 型LPB-ELSA 抗體檢測結(jié)果Fig.3 O type LPB-ELISA antibody titers of immunizatied piglets

2.4.3 CVC1302 對合成肽疫苗的免疫效力評價將不同的合成肽疫苗及PBS 分別免疫仔豬，分別利用O 型FMD LPB-ELISA 抗體檢測試劑盒、FMDV VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 試劑盒檢測其免疫效力。結(jié)果顯示，合成肽-CVC1302 組豬的結(jié)構(gòu)蛋白VP1 抗體水平(圖5A)和LPB 抗體水平(圖5B)均極顯著高于合成肽疫苗組(p＜0.01)，VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體合格率由50 % (10/20)提高到100 % (20/20)，LPB 抗體合格率由25 % (5/20)提高到70 % (14/20)。表明免疫增強劑能夠極顯著提高商品化合成肽疫苗的免疫效力。

圖4 免疫豬O、A、Asia 型LPB-ELISA 抗體檢測結(jié)果Fig.4 Antibody tests of O/A/Asia immunizatied pigslets by LPB-ELISA

圖5 免疫豬合成肽VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體水平(A)和LPB-ELISA 抗體水平(B)的檢測結(jié)果Fig.5 Synthetic peptide VP1 induced antibody level (A)and LPB-ELISA antibody titers (B)of immunizatied piglets

3 討 論

免疫增強劑有的先于疫苗免疫、有的與疫苗同時使用，能夠增強機體對抗原物質(zhì)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力，越來越多的應(yīng)用在疫苗免疫中[6]。常見的免疫增強劑有CpG、干擾素、多糖、細胞因子、細菌的鞭毛蛋白等[7-9]，并且有大量商品化的免疫增強型的佐劑上市。免疫增強劑使用方便，研發(fā)周期短，效果確實，且不改變疫苗的現(xiàn)有生產(chǎn)工藝，是提高疫苗免疫效力的有效手段。

CVC1302 的成份含有單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰二肽、β-葡聚糖，這些成份是動物相關(guān)模式識別受體結(jié)合的配體，是天然的免疫受體激動劑[10-12]。在前期研究中，將單一組分添加到FMD 疫苗中抗體效價提升效果不明顯，后續(xù)試驗發(fā)現(xiàn)將其聯(lián)合使用具有協(xié)同增效的作用。本實驗在此基礎(chǔ)上篩選CVC1302 的最佳使用劑量，檢測結(jié)果表明其可以顯著提高疫苗免疫后的抗體水平和延長其抗體持續(xù)期，增強疫苗的免疫效果。

Zhang Liu 等通過對免疫豬抗體水平監(jiān)測，研究其體液免疫、細胞免疫水平與攻毒保護之間的關(guān)系。結(jié)果表明免疫豬的LPB-ELISA 抗體水平與攻毒保護率相關(guān)，抗體滴度越高，保護率越高，特別是在LPB-ELISA 抗體水平達到26后與攻毒保護率成正相關(guān)[13]。本研究中添加增強劑CVC1302 免疫組豬的LPB-ELISA 抗體效價均極顯著高于不添加組。攻毒試驗結(jié)果表明CVC1302 可以提高FMDV 免疫后的攻毒保護效力，與上述研究結(jié)果一致[13]。將CVC1302 添加到現(xiàn)有各類商品化FMD 疫苗中，均可以極顯著提高各組豬免疫后的LPB-ELISA 抗體水平，表明CVC1302 具有良好的適用性，可以廣泛應(yīng)用于現(xiàn)有的疫苗生產(chǎn)中。

綜上所述，CVC1302 能夠顯著提高現(xiàn)有FMD疫苗的免疫效力和攻毒保護率，具有較好的應(yīng)用前景，對豬群FMD 的防控具有重要的臨床意義。