馬宇潔　楊興易　林兆奮　張　雷　潘曙明

【摘要】目的建立一種新型簡便的心跳驟停后腦復(fù)蘇研究的動物模型。方法選用清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠40只，采用窒息合并冰氯化鉀停跳液致大鼠心跳驟停，5 min后開始心肺復(fù)蘇。記錄基本生命體征變化、發(fā)生循環(huán)停止時間(T_CA)、自主循環(huán)恢復(fù)時間(T_ROSC)、72 h存活率，復(fù)蘇后不同時間點(diǎn)(3、6、12、24、48、72 h)神經(jīng)功能評分(NDS)，觀察復(fù)蘇后3 h和72 h透射電鏡下皮層超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果造模后大鼠迅速發(fā)生循環(huán)停止，R。和TR0s。分別為(137．3±10.2)s，(64.4±9.3)s，復(fù)蘇成功率87.5％，72 h存活率為80％。NDS在復(fù)蘇后3 h時最低，以后NDS漸趨好轉(zhuǎn)。血漿丙二醛(MDA)水平顯著升高，在72 h略有回降，但仍高于造模前(P＜0.01)。電鏡顯示復(fù)蘇后3 h腦損害最嚴(yán)重，72 h逐漸減輕。結(jié)論這一模型操作簡單且結(jié)果穩(wěn)定。

【關(guān)鍵詞】心跳驟停；心肺復(fù)蘇；腦復(fù)蘇；動物模型；大鼠

simon等報道25％～50％心搏驟停患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)心肺復(fù)蘇能夠恢復(fù)自主循環(huán)，但出院率仍徘徊在2％～14％的低水平，造成這一差異的原因主要是頑固性神經(jīng)細(xì)胞損傷。心搏驟停后腦復(fù)蘇研究動物模型的建立對研究復(fù)蘇后機(jī)體病理生理變化、觀察藥物療效、改善腦復(fù)蘇效果等具有重要意義。一種理想的腦復(fù)蘇動物模型應(yīng)該具備與臨床情況相類似、可重復(fù)性好、副反應(yīng)少且容易操作等特點(diǎn)。在越短的時間內(nèi)達(dá)到心跳呼吸停止的目的就越接近臨床狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性越高。為此筆者設(shè)計(jì)采用了大鼠窒息合并冰氯化鉀停跳液致心搏驟停的模型。

1材料與方法

1．1動物準(zhǔn)備

雄性清潔級Sprague Dawley大鼠40只，體重(302.5±5.6)g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SKXK(軍)2002－011。飼養(yǎng)室通風(fēng)、恒溫25℃，標(biāo)準(zhǔn)鼠料飼養(yǎng)。稱重，氯氨酮10 mg／100 g腹腔注射麻醉，將動物固定于手術(shù)臺。在右側(cè)腹股溝中點(diǎn)沿下肢縱軸股部切開約1cm切口，分離股動靜脈，從股靜脈置入20 G套管針連接微量輸液泵以2 ml／h的速度輸生理鹽水，從股動脈置入22 G套管針連接壓力轉(zhuǎn)換器，使用西門子Siredoc 220監(jiān)護(hù)儀(德國)監(jiān)測有創(chuàng)動脈血壓并記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切口，分離氣管并插入18 G靜脈穿刺導(dǎo)管。左下腹皮膚表面接體表體溫探頭記錄體表溫度；肛門插入內(nèi)置式溫度探頭記錄直腸溫度。

1．2模型的建立

手術(shù)操作完成并穩(wěn)定10 min后，經(jīng)右側(cè)股靜脈彈丸式注射氯化琥珀膽堿注射液0.15 mg／100 g和0.5 mol冰氯化鉀(4℃)0.12 ml／100 g致呼吸心跳停止，待收縮壓(SBP)降至25 nunHg，持續(xù)5 min后連接動物呼吸機(jī)(江灣I型呼吸機(jī)，上海第二軍醫(yī)大學(xué))行機(jī)械通氣，呼吸頻率80次／min，潮氣量5 ml／min，F(xiàn)iO₂100％，同時快速進(jìn)行人工胸外按壓，按壓頻率200次／min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1／3，按壓5～10 s后經(jīng)右側(cè)股靜脈快速注射腎上腺素(0.01 mg／kg)并分別記錄血壓、心電圖和體溫等參數(shù)。出現(xiàn)自主心律、脈搏波且SBP達(dá)到60 mmHg時判定為自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)并停止按壓；如按壓3 min仍未恢復(fù)自主循環(huán)則放棄搶救，視為死亡。復(fù)蘇成功者繼續(xù)呼吸機(jī)支持60 min，若自主呼吸恢復(fù)滿意即可拔除氣管導(dǎo)管，結(jié)扎股動靜脈并縫合頸部及右股部皮膚，每6 h腹壁皮下注射5％GNS 5 m1，直至動物能自主飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)記錄及指標(biāo)參照Utstein模式。

1．3觀察指標(biāo)

1．3．1記錄循環(huán)停止時間(time of cadiac arrest，T_CA)從開始用藥到SBP降至25 mmHg的時間；自主循環(huán)恢復(fù)時間(time of restoration of spontaneouscirculation，rrRosc)：從開始進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)心肺復(fù)蘇至出現(xiàn)自主心律、SBP升至60 mmHg的時間。

1．3．2計(jì)算復(fù)蘇成功率及72 h累計(jì)存活率出現(xiàn)自主心律、脈搏波且SBP在60 mmHg時判定為自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)。

1．3．3神經(jīng)功能評分(neural deficit scores，NDS)參照Geocadin的神經(jīng)功能評分方法并加以改良，對大鼠造模前和ROSC后各時間點(diǎn)(3、6、12、24、48、72 h)大鼠從意識、基本反射、運(yùn)動、感覺、行為學(xué)等方面對存活大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評定，評分范圍為0～80分，0分為腦死亡，80分為完全正常，評分請課題組以外對本課題不了解的人員來完成。

1．3．4血漿MDA含量測定分別對造模前、ROSC后各時間點(diǎn)(3、6、12、24、48、72 h)大鼠抽血測定血漿丙二醛(MDA)含量。按MDA試劑盒要求測定MDA含量。MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1．3．5腦皮質(zhì)電鏡標(biāo)本檢查分別隨機(jī)選取復(fù)蘇后3 h和72 h各一只大鼠斷頭后迅速取出腦組織，以4％多聚甲醛液滴至大腦皮層表面，用銳利刀片切取0.1 cm³(三塊0.1 cm³)放人4％多聚甲醛液中冷藏固定。經(jīng)漂洗、再固定、脫水、包埋、切片、染色后在日立HE-800透射電鏡下觀察。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，采用SPSS 11.5 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件分析。差異比較用ANOVA過程單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1血漿MDA含量變化

3 h血漿MDA含量迅速升高并達(dá)到頂點(diǎn)，以后逐漸降低，至72 h仍顯著高于造模前(P＜0.05)，

2．2腦皮質(zhì)電鏡標(biāo)本檢查

造模前大鼠神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)高爾基體、線粒體均正常；復(fù)蘇后3 h組神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)部分凝聚，線粒體腫脹、嵴缺失，高爾基體囊泡明顯擴(kuò)張，基質(zhì)變淡；復(fù)蘇后72 h神經(jīng)細(xì)胞周圍仍可見水腫帶，線粒體腫脹，線粒體電子密度增高。

2．3T_CA和TROSC的變化

模型組大鼠均迅速發(fā)生循環(huán)停止，T_CA為(137.3±10.2)s。待收縮壓降至25 mmHg持續(xù)5 min后開始標(biāo)準(zhǔn)心肺復(fù)蘇，T_ROSC(64.4±9.3)s。

2．4神經(jīng)功能評分和累計(jì)存活率

造模前大鼠NDS均為80分，復(fù)蘇后3 h NDS最低，以后逐漸升高，至72 h已恢復(fù)至70分以上。

5只大鼠復(fù)蘇失敗，復(fù)蘇成功率87.5％，ROSC后于2、3、5 h各死亡1只。累計(jì)存活率80％。

3討論

3．1實(shí)驗(yàn)動物的選擇

目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究的腦復(fù)蘇動物模型多以豬、狗、羊、猴等大動物為研究對象，存在操作較復(fù)雜、費(fèi)用高、周期長，多學(xué)科協(xié)作等問題。筆者采用的是雄性SD大鼠，因其易于飼養(yǎng)、價格低廉、來源充足，方便操作，且不受生理周期的影響。筆者的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，只要熟練掌握插管技術(shù)，其操作比建立大動物模型要簡單，不需要麻醉師、體外循環(huán)醫(yī)師、心臟外科醫(yī)師和其他相關(guān)人員。購買實(shí)驗(yàn)動物的費(fèi)用和相應(yīng)的儀器設(shè)備等方面節(jié)省了大量的科研經(jīng)費(fèi)，可以進(jìn)行大樣本的動物模型研究。Von Planta等的研究表明，大鼠在心搏停驟和心肺復(fù)蘇期間，其血流動力學(xué)、酸堿平衡及代謝與大動物甚至與臨床患者心肺復(fù)蘇期間的變化基本一致。目前大鼠被廣泛地用做腦損傷和腦保護(hù)機(jī)制的動物模型，使筆者的研究更具有可比性。

3．2心搏驟停方法選擇及臨床相關(guān)性

目前各實(shí)驗(yàn)室心肺復(fù)蘇動物模型中停跳方法主要包括電擊(經(jīng)右心室導(dǎo)管誘發(fā)室顫，體外電擊，胸直視電擊)、窒息、心房內(nèi)注射氯化鉀、壓迫心底血管叢、胸部擠壓、主動脈、腔靜脈鉗夾等，尚缺乏即簡單又與臨床情況近似的動物模型。為此筆者設(shè)計(jì)了大鼠窒息合并冰氯化鉀的心肺腦復(fù)蘇模型。通過靜脈彈丸式注射冰氯化鉀停跳液和琥珀膽堿能迅速停止心臟的電機(jī)械活動，使心肌均勻降溫，在心搏驟停期間較好地保護(hù)了心肌，從而能確保心臟復(fù)蘇成功，復(fù)蘇后循環(huán)容易維持穩(wěn)定，因此可滿足不同時間心搏驟停后腦復(fù)蘇研究的需要。琥珀膽堿又名司可林，屬去極化肌松劑，可抑制呼吸，造成動物窒息，但持續(xù)時間短，故易于控制。與冰氯化鉀合用能加快心跳停止的速度，本組實(shí)驗(yàn)T_CA為(137.3±10.2)s。

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在臨床上應(yīng)用的可能性和有效性很大程度上取決于動物模型模擬臨床情況的程度。臨床實(shí)際發(fā)生的心搏驟停是瞬間發(fā)生的狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)中造膜至心跳停止時間越長，則動物持續(xù)低氧時間越長，動物損傷嚴(yán)重，越不易復(fù)蘇成功。該模型縮短了T_CA，動物可以存活下來，有利于后期研究神經(jīng)元的遲發(fā)性損傷以及觀察其神經(jīng)行為學(xué)的改變。此外，動物模型避免了開胸手術(shù)，采用股動靜脈而不是頸動靜脈插管避免了人為對腦血流量和灌流的影響，減少了對實(shí)驗(yàn)動物的創(chuàng)傷，更加符合生理狀態(tài)，適用于腦保護(hù)的研究。

3．3心臟停跳安全時限的選擇

腦是全身對缺氧最敏感的器官，僅能耐受5～8 min的停循環(huán)。各種心搏驟停心肺復(fù)蘇模型中由于采用致心跳驟停的方法不同，設(shè)計(jì)的心跳停止時間也各不相同，為3～15 min。筆者分別進(jìn)行了心搏驟停跳5、6、7 min的預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察72 h，每組各10只，結(jié)果7 min組全部復(fù)蘇失敗，6 min組復(fù)蘇成功3只，分別于3、4、12 h各死亡1只，72 h存活率為20％。5 min組復(fù)蘇成功9只，T_ROSC(64.4±9.3)s，較易于復(fù)蘇，3 h死亡1只，72 h存活率為80％。該模型基本符合臨床心跳驟停的狀態(tài)，且大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)與人類相似，亦包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)兩部分，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們選擇心跳停止5 min的模型，結(jié)果復(fù)蘇成功率87.5％，72 h存活率80％，優(yōu)于國外類似動物模型。

3．4腦損傷程度的判斷

在動物模型制備過程中，如果模型動物損傷太輕則不能完全反映臨床情況，實(shí)驗(yàn)意義不大；損傷太重，則動物死亡率高無法進(jìn)行后續(xù)的研究，同樣會降低實(shí)驗(yàn)價值。筆者選擇了神經(jīng)功能評分、血漿自由基的水平和神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變來判斷腦損傷的程度。以往對缺血缺氧模型多著重觀察形態(tài)學(xué)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等的變化，而對最有臨床意義的神經(jīng)功能描述多采用定性或半定量的方法，其結(jié)果相對主觀和片面，難以準(zhǔn)確反映較微小的功能差別。針對這一問題，筆者參照Geocadin的神經(jīng)功能評分方法并加以改良，從意識、基本反射、運(yùn)動、感覺、行為學(xué)等方面對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評定，以期全面客觀的反映皮層、小腦、腦干、丘腦和海馬等各個部位的損傷情況并便于對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析。MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TCA和TROSC、存活率、神經(jīng)功能評分及神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變有良好的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)過程中筆者還發(fā)現(xiàn)大鼠復(fù)蘇成功后如死亡多發(fā)生在6 h以內(nèi)，與Shu等研究的心肺復(fù)蘇后大鼠腦水腫的過程相一致，此階段腦水腫最嚴(yán)重，與臨床情況類似。