樊海珍　何志敏

摘要：目的 探討葡萄多酚對(duì)大鼠骨骼肌自由基代謝、運(yùn)動(dòng)能力的影響。方法：建立力竭模型，測(cè)定各組小鼠的SOD，MDA，GSH-PX，TAC以及力竭時(shí)間。結(jié)果：運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)多酚組大鼠骨骼肌中SOD活性都高于對(duì)照組，MDA含量都低于對(duì)照組，力竭游泳時(shí)間都明顯延長(zhǎng)。結(jié)論：葡萄多酚能夠增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力。

關(guān)鍵詞：葡萄多酚；抗氧化能力；運(yùn)動(dòng)能力；自由基；力竭大鼠

中圖分類號(hào)：G804.12文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3612(2008)03-0348-03

近幾年來(lái)，植物來(lái)源的天然抗氧化物質(zhì)的研究開(kāi)發(fā)已成為國(guó)際熱門焦點(diǎn)，此類物質(zhì)有多糖類、維生素類、天然黃酮類以及多酚類等，其中多酚是最突出的一類。葡萄多酚也稱原花青素，是兒茶素和表兒茶素的聚合物，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道葡萄多酚具有抗氧化、抗衰老、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗癌等多種生物功能［1］。本文作者在對(duì)其進(jìn)行抗氧化作用研究的基礎(chǔ)上，選擇運(yùn)動(dòng)力竭大鼠骨骼肌為材料，評(píng)價(jià)其抗氧化、抗衰老作用，旨在闡釋葡萄多酚消除骨骼肌自由基的機(jī)制，并為其應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。同時(shí)也為葡萄多酚資源的綜合開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1研究對(duì)象與方法

1.1葡萄多酚的制備根據(jù)文獻(xiàn)取葡萄漿果。粉碎研磨，加75％ 甲醇(按料液比1：15)，45℃ 浸提90 min，抽濾。濾渣再進(jìn)行第2次提取。合并2次濾液，真空濃縮。用AB-8大孔吸附樹(shù)脂層析法提純。以梯度濃度甲醇洗脫，收集40％ 甲醇洗脫液，真空濃縮并干燥，得野生山葡萄多酚提取物粉末。按Folin-Ciocalten法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得提取物中多酚含量為84.6％［2］。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取10周齡雄性wistar 大鼠36 只，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，隨機(jī)分為3組:C 組 即對(duì)照組(安靜飲水組) 、S組(運(yùn)動(dòng)飲水組) 、G組(運(yùn)動(dòng)多酚組) ，每組12只，各組基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，C、S 兩組，飲用純凈水，G組飲用葡萄多酚飲料。動(dòng)物房?jī)?nèi)室溫18～27℃，濕度35%。晝夜節(jié)律變化光照(表1)。

C、S兩組的補(bǔ)水量為10 mL/kg/d，G組的飲料量的葡萄多酚補(bǔ)充劑量為200 mg/kg/d，按一定比例與純凈水配制而成葡萄多酚飲料，每日灌胃。運(yùn)動(dòng)方式為游泳。S組，T組于飼養(yǎng)第15 d開(kāi)始進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，游泳時(shí)間由10 min/d 開(kāi)始，每日遞增5 min 至第20 d。C組則從第19 d，直接進(jìn)行游泳。

運(yùn)動(dòng)力竭模型：在50 cm×60 cm×70 cm的水槽中注入自來(lái)水，水深30 cm，水溫22℃，將大鼠尾根部負(fù)載自身體重3％的鐵片，放入水槽強(qiáng)迫游泳至力竭，力竭判斷標(biāo)準(zhǔn):大鼠沉入水底10 s 不浮起，無(wú)法完成翻正反射，將大鼠立即撈出進(jìn)行取材。

1.2.2取材取材方法在大鼠立即撈出后用戊巴比妥鈉(2％)注射麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，迅速取出大鼠腓腸肌和肝臟。取組織塊(0．8 g左右)在4℃ 的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入10 mL的小燒杯內(nèi)。冰浴下用研磨器充分研碎，使組織勻漿化。將制備好的10％勻漿用普通離心機(jī)3 000 轉(zhuǎn)／min左右離心15 min，離心好的勻漿留上清棄下面沉淀。上清液用于各種指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3測(cè)試方法丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)，總抗氧化能力（TAC）的測(cè)試采用比色法，試劑盒由北京中生北控公司提供。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理用Sigmaplot Scientific Graphing System軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s) 表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，以P<0.05為顯著性水平。

2結(jié)果

2.1葡萄多酚對(duì)大鼠力竭游泳時(shí)間的影響從表2可以看出各組大鼠力竭游泳時(shí)間，運(yùn)動(dòng)飲水組和運(yùn)動(dòng)多酚組明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)，組力竭游泳時(shí)間極明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.001) 和明顯長(zhǎng)于運(yùn)動(dòng)飲水組(P<0.05) 運(yùn)動(dòng)多酚。

2.2葡萄多酚對(duì)大鼠骨骼肌各指標(biāo)的影響表3可以看到，力竭運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)多酚組的大鼠的骨骼肌MDA含量明顯低于對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)飲水組(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)多酚組的大鼠SOD活性明顯高于運(yùn)動(dòng)飲水組(P<0.05)，非常明顯的高于對(duì)照組(P<0.001)，運(yùn)動(dòng)飲水組的大鼠SOD活性明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示三組大鼠骨骼肌的GSH-PX活性沒(méi)有顯著性差異(P>0.05) ?？偪寡趸芰Γ\(yùn)動(dòng)多酚組明顯升高，而對(duì)照組與運(yùn)動(dòng)飲水組無(wú)明顯差別。

2.3葡萄多酚對(duì)大鼠肝臟各指標(biāo)的影響

表4顯示，力竭運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)多酚組的大鼠的肝臟MDA含量明顯低于對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)飲水組(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)多酚組的大鼠肝臟SOD活性明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而大鼠的肝臟GSH-PX活性，與骨骼肌相比要高得多，運(yùn)動(dòng)飲水組的大鼠的GSH-PX活性明顯高于對(duì)照組(P<0.05)?？偪寡趸芰?，運(yùn)動(dòng)多酚組明顯高于對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)飲水組(P<0.05)。

3討論

運(yùn)動(dòng)疲勞的機(jī)理是運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在運(yùn)動(dòng)疲勞的過(guò)程中，“氧自由基－脂質(zhì)過(guò)氧化增加"對(duì)細(xì)胞的損傷是重要原因之一。為此，抗氧化物質(zhì)或抗氧化劑的補(bǔ)充也越來(lái)越多地受到人們的重視。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)性內(nèi)源自由基產(chǎn)生，一般認(rèn)為有兩個(gè)機(jī)制:線粒體機(jī)制和黃嘌呤氧化酶機(jī)制。近年來(lái)又有學(xué)者提出了中性粒細(xì)胞機(jī)制、前列腺素機(jī)制和鈣機(jī)制［3、4］。

大量研究也證實(shí)，適度的運(yùn)動(dòng)可引起組織超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性增強(qiáng)以及谷胱甘肽濃度增高，所以適度的運(yùn)動(dòng)是有利于健康。我們的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)飲水組的骨骼肌SOD活性明顯高于安靜飲水組，也證明了這一點(diǎn)。 研究發(fā)現(xiàn)適度的有氧運(yùn)動(dòng)可以逐步地提高機(jī)體的自身抗氧化系統(tǒng)?？梢允箼C(jī)體對(duì)自由基損傷產(chǎn)生一定的適應(yīng)能力，誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化酶的增加、削弱自由基對(duì)機(jī)體的氧化損傷，其機(jī)理可能是由于長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)使心、肺功能增強(qiáng)，攝入氧氣、血液運(yùn)輸氧氣能力和細(xì)胞利用氧氣的能力增強(qiáng)，特別是抗氧化酶的活性產(chǎn)生適應(yīng)性的變化使機(jī)體內(nèi)自由基防御體系加強(qiáng)。

研究認(rèn)為葡萄多酚屬酚類化合物，是含有兩個(gè)以上互為鄰位的輕基多元酚，苯環(huán)上的酸性羥基具有很強(qiáng)的供氫能力。其抗氧化機(jī)制與其他酚類抗氧化劑相同，即自身作為優(yōu)良的氫供體，形成的自由基可通過(guò)共振雜化成穩(wěn)定的自由基。從而使自由基失活，切斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而延緩油脂中不飽和脂肪酸自動(dòng)氧化成氫過(guò)氧化物的連鎖反應(yīng)，起到抗氧化的作用［5］。近年來(lái)國(guó)外對(duì)GPC的理化特性，生物學(xué)功效和開(kāi)發(fā)利用進(jìn)行了量研究并取得突破性進(jìn)度。

對(duì)于自由基的生成，在內(nèi)源性干預(yù)方面，人體可通過(guò)某種方法增加體內(nèi)用于對(duì)抗過(guò)量自由基的物質(zhì)，如GPX、過(guò)氧化氫酶、SOD、GR等蛋白質(zhì)的分泌，或增強(qiáng)這些蛋白質(zhì)之間的協(xié)同作戰(zhàn)能力，這主要是通過(guò)增強(qiáng)身體鍛煉來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但這種內(nèi)源性干預(yù)很容易受限，如人們無(wú)法堅(jiān)持足夠的鍛煉等，而且隨著年齡增長(zhǎng)和機(jī)體老化，自體自由基的產(chǎn)生在數(shù)量上急劇升高，而自身分泌的抗氧化應(yīng)激物質(zhì)有限，協(xié)同能力也大幅下降。這就促使我們需要尋找更好的外源性抗氧化劑。

根據(jù)生化指標(biāo)的測(cè)試及力竭時(shí)間的綜合分析，葡萄多酚能明顯延緩小鼠游泳至力竭時(shí)間，延緩率為28.34%，主要是由于蘆薈含有黃酮類、原花青素等抗氧化劑，這些有效成份能有效地清除運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，保護(hù)膜系統(tǒng)的完整性，防止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等。進(jìn)一步達(dá)到提高運(yùn)動(dòng)能力的作用。

MDA是機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用而產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物［6］，它可能引起細(xì)胞代謝及功能障礙甚至死亡，故MDA的含量?？砷g接反映出機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)表明，力竭運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)多酚組的大鼠的骨骼肌和肝臟MDA含量明顯低于對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)飲水組。表明葡萄多酚對(duì)大鼠的骨骼肌和肝臟既有一定的保護(hù)作用，與對(duì)照組相比，差異有顯著性，提示葡萄多酚具有降低機(jī)體骨骼肌和肝臟MDA水平，減輕細(xì)胞損傷的作用。

SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基（O2-）保護(hù)細(xì)胞免受損傷。其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，并與衰老、腫瘤、炎癥、自身免疫病、輻射、藥物作用等有著密切的關(guān)系，但隨年齡增長(zhǎng)，體內(nèi)SOD活性逐漸降低［7］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)多酚組的大鼠SOD活性明顯高于運(yùn)動(dòng)飲水組(P<0.05)，非常明顯的高于對(duì)照組(P<0.01)，提示，葡萄多酚的抗運(yùn)動(dòng)疲勞機(jī)理與提高SOD活性有關(guān)。

值得注意的是，運(yùn)動(dòng)多酚組力竭游泳時(shí)間極明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.01) 和明顯長(zhǎng)于運(yùn)動(dòng)飲水組(P<0.05) ，也提示，葡萄多酚通過(guò)增加大鼠清除自由基能力使大鼠力竭游泳時(shí)間延長(zhǎng)，達(dá)到了提高運(yùn)動(dòng)能力的目的，這種新型抗氧化劑需要我們進(jìn)一步在人體身上驗(yàn)證其作用。

GSH-PX 是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中的一個(gè)重要的酶，主要作用是清除H₂O₂和脂質(zhì)過(guò)氧化物［8］，它特異地催化氧化型谷胱甘肽(GSSG) 還原為還原型谷胱甘肽(GSH) 起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整的作用。由于肝臟具有解毒處理代謝廢物等作用，肝臟中的GSH-PX活性明顯高于骨骼肌。而所有的三個(gè)組中骨骼肌GSH-PX無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0．05)，而運(yùn)動(dòng)多酚組的肝臟GSH-PX活性高于對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)飲水組，可能與用藥時(shí)間較短等因素有關(guān)。

葡萄多酚的抗氧化效果也被大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，因此、是否可以將適度運(yùn)動(dòng)與葡萄多酚的補(bǔ)充這兩者的抗氧化產(chǎn)生疊加效應(yīng)，也是本篇論文關(guān)注的重點(diǎn)之一。通過(guò)本次試驗(yàn)分析，在骨骼肌中，運(yùn)動(dòng)飲水組的SOD活性明顯高于對(duì)照組(P<0．05），而運(yùn)動(dòng)多酚組的SOD活性明顯高于對(duì)照組(P<0．01)和運(yùn)動(dòng)飲水組(P<0.05），我們分析考慮，認(rèn)為可能是適度強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)與葡萄多酚的補(bǔ)充這兩者的抗氧化是可以產(chǎn)生疊加效應(yīng)的，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在肝臟的疊加效應(yīng)方面，效果不如骨骼肌明顯，相關(guān)的機(jī)制需要進(jìn)一步研究探討。

4結(jié)論

1） 葡萄多酚能夠并能協(xié)同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練延長(zhǎng)大鼠力竭游泳時(shí)間，提高運(yùn)動(dòng)能力，延緩疲勞的產(chǎn)生。2） 葡萄多酚能夠降低大鼠骨骼肌和肝臟中MDA含量，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，能有效地清除自由基。3） 葡萄多酚能夠提高大鼠骨骼肌和肝臟中SOD活性，提高機(jī)體的總抗氧化能力（TAC）。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們一方面了解了運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌和肝臟抗氧化能力的影響，提示我們應(yīng)重視訓(xùn)練中自由基的產(chǎn)生及抗氧化劑的補(bǔ)充問(wèn)題；另一方面，證實(shí)了葡萄多酚(OPC)作為天然抗氧化劑的良好效果，可有效降低力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌和肝臟MDA水平，提高SOD活性，機(jī)體的總抗氧化能力，對(duì)消除大量自由基對(duì)機(jī)體的影響，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力，延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的產(chǎn)生具有良好的作用。

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