王建寧， 周榮平， 苗瑩瑩

胃癌主要擴(kuò)散形式是淋巴轉(zhuǎn)移，淋巴轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素。血管內(nèi)皮生長因子C (vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)是誘導(dǎo)淋巴管生成的生長因子，其受體3 (VEGFR-3)是成熟淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，VEGF-C/VEGFR-3調(diào)控系統(tǒng)可能參與腫瘤間質(zhì)淋巴管生成及淋巴道轉(zhuǎn)移過程[1]。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR法和Western Blot法檢測VEGFR-3的表達(dá)情況，探討其與胃癌各項(xiàng)臨床病理特征的關(guān)系，為研究胃癌的發(fā)生發(fā)展和淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗淋巴轉(zhuǎn)移治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 收集南京江寧醫(yī)院普外科2009年3月至2009年7月手術(shù)切除的32例胃癌組織及其癌旁組織(距離腫瘤組織5 cm以上)。男23例，女9例；年齡42～72歲，平均59歲。術(shù)前均未放化療。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為腺癌，相應(yīng)癌旁組織均未見癌累及。腫瘤≥5 cm 14例，<5 cm 18例；中低分化20例，高分化12例；穿透漿膜6例，未穿透漿膜26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移27例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期10例。于腫瘤切除后立即在無菌條件下切取腫瘤及距腫瘤5 cm以上的相應(yīng)癌旁組織分別放入2個(gè)無核酶凍存管中，做好標(biāo)記放置于液氮中保存。

1.2 主要試劑 兔抗人VEGFR-3(Flt4)多克隆抗體購自福州邁新公司，堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司，氯化硝基四氮唑/對甲苯胺藍(lán)(NBT/BCIP)為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 方法 剪取少量組織塊，每份加入0.5 mL勻漿液進(jìn)行勻漿。離心取上清,通過 Lowry法( Folin酚法)測定蛋白質(zhì)含量，每次均取50 μg總蛋白樣品 40 μL上樣量在 7.5% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。然后用5%脫脂奶粉室溫封閉5 h，棄溶液，加入用 5%脫脂奶粉稀釋的兔抗人VEGFR-3抗體(1∶2 000稀釋)，室溫輕搖過夜。三羥甲基氨基甲烷堿緩沖液(TBST)洗膜3次，加入用5%脫脂奶粉稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500稀釋)，室溫輕搖2 h，TBST液洗膜3次后，NBT/BCIP顯色。Image J軟件分析目的蛋白條帶與β-actin的灰度比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

Western Blot結(jié)果顯示胃癌組織中，VEGFR-3蛋白在胃癌組織中的表達(dá)量為2.34±4.96，在癌旁組織中的表達(dá)量為0.40±0.08，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。VEGFR-3蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與TNM分期有關(guān)，分期越晚，表達(dá)量越高(P<0.05)；且腫瘤浸潤越深，表達(dá)量越高(P<0.05)；并且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組表達(dá)量顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；但是VEGFR-3蛋白的表達(dá)與腫瘤大小、分化程度無關(guān)(P>0.05)(表1)。

圖1 VEGFR-3蛋白在胃癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)

臨床病理特征例數(shù)(n)VEGFR?3蛋白相對表達(dá)量P值腫瘤大小0．57 <5cm180．71±0．07 ≥5cm140．70±0．08分化程度0．11 高分化120．66±0．06 中低分化200．69±0．06穿透漿膜0．01 無260．69±0．07 有60．86±0．12淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0．02 無170．68±0．07 有150．79±0．09遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0．02 無270．69±0．07 有50．77±0．08TNM分期0．03 Ⅰ、Ⅱ220．68±0．06 Ⅲ、Ⅳ100．74±0．08

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程，而淋巴管的生成是其中的重要階段。VEGFR-3是血管內(nèi)皮生長因子家族的第三個(gè)受體酪氨酸激酶，廣泛表達(dá)于胚胎發(fā)育期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在成人組織中僅限表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，是淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志。VEGFR-3在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，VEGFR-3與VEGF-C、VEGF-D結(jié)合后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變，誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙，誘導(dǎo)淋巴管新生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[1-4]。VEGFR-3誘導(dǎo)生成的淋巴管結(jié)構(gòu)不同，由一層極薄的沒有基底膜的內(nèi)皮細(xì)胞排列而成，通透性極高，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生粘附、穿入并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)VEGFR-3與其配體還可以相互作用，調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，促進(jìn)增殖、抑制凋亡，從而具有更高的增殖活性及浸潤性[5]。Sun等[6]對82例非小細(xì)胞肺癌的研究結(jié)果顯示VEGFR-3陽性表達(dá)的病例具有較高的lymphatic vessel density (LVD)，且與病例的病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及預(yù)后有關(guān)。Roberts等[7]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示VEGFR-3可以介導(dǎo)乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移，而通過對其抑制可以降低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)從基因和蛋白的水平分別揭示了VEGFR-3在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等因素有關(guān)。

綜上，VEGFR-3的陽性表達(dá)可作為預(yù)測胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，抗VEGFR-3抗體有可能抑制胃癌新生淋巴管形成，阻止胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，針對VEGFR-3的基因治療亦會(huì)成為胃癌治療中的重要方法。

[1] Zeng Y, Opeskin K, Baldwin ME, et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptor-3 by lymphatic endothelial cells is associated with lymph node metastasis in prostate cancer [J]. Clin Cancer Res, 2004, 10 (15): 5137-5144.

[2] 陳珊,金偉, 閔平,等.血管內(nèi)皮生長因子家族及其受體與腫瘤血管生成研究進(jìn)展[J].生命科學(xué), 2004, 16(1): 118.

[3] Ferrara N. The Role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis[J]. EXS, 2005, 94 (6): 209-231.

[4] Ribatti D. The crucial role of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor in angiogenesis:a historical review[J]. Br J Haematol, 2005, 128(3): 303-309.

[5] Shawber CJ, Funahashi Y, Francisco E, et al. Notch alters VEGF responsiveness in human and murine endothelial cells by direct regulation of VEGFR-3 expression[J]. J Clin Invest, 2007, 117(11): 3369-3382.

[6] Sun JG, Wang Y, Chen ZT, et al. Detection of lymphangiogenesis in non-small cell lung cancer and its prognostic value[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2009, 28:21.

[7] Roberts N, Kloos B, Cassella M, et al. Inhibition of VEGFR-3 activation with the antagonistic antibody more potently suppresses lymph node and distant metastases than inactivation of VEGFR-2[J]. Cancer Res, 2006, 66(5): 2650-2657.