胡 浩， 趙榮飛， 曹 葦

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，位居癌癥死因的第二位，是一類多基因疾病，是由于端粒酶激活、凋亡基因失調(diào)、癌基因的激活以及抑癌基因的失活、突變等引發(fā)的多因素、多階段、多基因變異的復雜綜合病變過程。目前研究者們認為抑癌基因的失活在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能起到更加常見、更加重要的作用，WWOX就是近年來發(fā)現(xiàn)的一個與多種腫瘤發(fā)生有關的新型抑癌基因。本文檢測胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織標本中WWOX基因mRNA的表達情況，探討其失活與胃癌發(fā)生的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為蘇州大學附屬第一醫(yī)院2006年10月至2007年5月間52例胃癌患者行根治手術切除的標本，包括胃癌組織及與癌組織相對應的癌旁正常胃黏膜組織(手術切緣距腫瘤邊緣5 cm以外)各52例，所有病例術前均未行化、放療，術后均經(jīng)病理證實。其中男性37例，女性15例，年齡27～80歲，中位年齡62歲。參照1990年WHO推薦的分化分級標準，低分化腺癌31例，中分化腺癌18例，高分化腺癌3例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC，1997)TNM分期法，Ⅰ期4例、Ⅱ期7例、Ⅲ期29例和Ⅳ期12例。上述標本離體后半小時內(nèi)取材，然后迅速置于-196℃液氮冷凍后移至-80℃冰箱保存，用于提取mRNA。

1.2 主要試劑與儀器

總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑 RNAsin、Taq DNA聚合酶購自Promega公司，DNA分子量標準購自MBI公司，PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；PCR儀(PE 2400)為美國Perking Elmer公司產(chǎn)品，紫外透視分析儀Bio-CAPT version99為VLIBER LOURMAT 公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 合成引物 WWOX上游引物為5′-TTTGGAGCGGGAGTGAGT-3′，下游引物為5′-GTGGTGCTGCCGTCGTAT-3′，擴增片段413bp；內(nèi)參照GAPDH 上游引物為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，擴增片段258 bp。

1.3.2 組織總RNA抽取 用TRIzol一步法進行組織內(nèi)總RNA的提取，紫外分光光度儀測定A260、A280吸光值，RNA樣本的A260/A280應在1.8～2.0之間，計算RNA含量，稀釋RNA到0.5 μg/μL，-80℃保存。

1.3.3 RT-PCR反應 RT反應：RNA逆轉成WWOX

cDNA；PCR反應：擴增WWOX cDNA，擴增反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延長1 min，共38個循環(huán)，72℃延長7 min。

1.4 PCR擴增產(chǎn)物的半定量分析

采用UVIDoc軟件，對電泳圖像中的目的基因和內(nèi)對照GAPDH的擴增產(chǎn)物條帶分別進行光密度值分析。通過計算表達指數(shù)(目的基因條帶的光密度值/相應的GAPDH條帶的光密度值)，對目的基因的表達進行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常胃黏膜組織中WWOX mRNA的表達

WWOX mRNA在胃癌組織、相應癌旁正常胃黏膜組織中均有表達(圖1)，WWOX mRNA在胃癌組織中的表達水平低于癌旁正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 WWOX mRNA的表達：RT-PCR產(chǎn)物(413bp)電泳條帶注：N 癌旁正常胃黏膜組織；T 胃癌組織；Mark為ladder標記

標本例數(shù)WWOXmRNA表達指數(shù)(x±s)Z值P值胃癌組織520．3404±0．2800癌旁正常胃黏膜組織520．6139±0．22205．1409P<0．0001

2.2 胃癌組織中WWOX mRNA的表達與臨床病理學指標的關系

胃癌組織中WWOX mRNA的表達與胃癌組織的分化程度、TNM分期以及浸潤深度明顯相關(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤生長部位、腫瘤大小以及淋巴結轉移、遠處轉移等無關(P>0.05)，見表2。

表2 WWOX mRNA在胃癌組織中的表達指數(shù)與 臨床病理學指標的關系

3 討論

全球每年死于胃癌的患者約70萬人，其中42%分布于中國[1]。盡管長期以來進行深入而廣泛的研究，但其病因和發(fā)病機制尚未完全明確。迄今為止，還沒有研究出能夠證明胃癌的發(fā)生是單一因素直接作用的結果。目前，抑癌基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展關系的研究尤為引人關注。WWOX基因是Bednarek等[2]于2000年在16q23.3～24.1區(qū)域克隆出的一個新抑癌基因，體內(nèi)及體外研究和WWOX基因敲除的小鼠模型的建立也均證明了WWOX是一個抑癌基因[3-4]。WWOX基因通過失活或蛋白失去功能啟動腫瘤的發(fā)生或促進腫瘤的進展，其失活的機制尚未完全明確，可能與雜合性丟失(LOH)和純合性丟失、mRNA轉錄缺失或嚴重降低致蛋白表達的缺失或降低、氧化還原酶區(qū)域(SDR)破壞、啟動子CpG島甲基化有關。也有研究者提出了WWOX基因失活的兩次打擊學說，即WWOX基因中某單一基因的缺失，引起基因表達的異常，以后其他突變機制引起WWOX的進一步改變，兩次打擊的發(fā)生導致兩等位基因失活且完全喪失功能。

本研究胃癌組織中WWOX mRNA的表達率為67.3%(35/52)，相應癌旁正常胃黏膜組織中WWOX mRNA的表達率為92.3%(48/52)，統(tǒng)計學分析顯示，胃癌中WWOX mRNA的表達水平低于癌旁正常胃黏膜組織(P<0.05)，說明WWOX基因mRNA的缺失和低表達在胃癌中具有普遍性，證實WWOX基因的缺失與胃癌的發(fā)生密切相關。通過對WWOX基因的表達與胃癌臨床病理學指標關系的進一步分析顯示：胃癌組織中WWOX mRNA的表達與性別、年齡、腫瘤生長部位、腫瘤大小以及淋巴結和遠處轉移無關(P>0.05)，而與胃癌的分化程度、TNM分期以及浸潤深度明顯相關(P<0.05)，且組織學分化程度越低，TNM分期越晚，浸潤程度越深，WWOX mRNA的表達缺失就越高，提示W(wǎng)WOX基因表達缺失或低表達可能是胃癌發(fā)生發(fā)展中的晚期事件，可見WWOX基因的改變與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

[1] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics，2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2):74-108.

[2] Bednarek AK, Laflin KJ, Daniel RL,et al.WWOX, a novel WW domain-containing protein mapping to human chromosome 16q23.3-24.1,a region frequently affected in breast cancer[J].Cancer Res, 2000,60(8):2140-2145.

[3] Fabbri M, Iliopoulos D, Trapasso F, et al. WWOX gene restoration prevents lung cancer growth in vitro and in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(43): 15611-15616.

[4] Aqeilan RI, Trapasso F, Hussain S, et al. Targeted deletion of Wwox reveals a tumor suppressor function [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007, 104(10):3949-3954.