趙勁松， 廖克龍， 楊 康

近年來我國食管癌的發(fā)病率有明顯上升的趨勢，40歲以上人群是食管癌的高發(fā)群體，我國的食管癌以鱗狀細(xì)胞癌為主，發(fā)現(xiàn)病變的時(shí)間一般都偏晚，總的5年生存率不到30%[1]。細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子P21WAF-1是一種CDK抑制蛋白(CDKIs)，他通過與cyclin/CDK復(fù)合物的結(jié)合抑制其生物活性，阻止細(xì)胞通過G1/S的調(diào)節(jié)位點(diǎn),對細(xì)胞周期起著負(fù)調(diào)控的作用,是一種抑癌基因。本實(shí)驗(yàn)通過檢測P21和cyclinD1蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況,評價(jià)其與食管鱗癌臨床、病理的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本收集和處理

80例食管鱗癌組織及80例正常食管組織取自第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院胸心外科2005年3月到2006年4月食管鱗癌接受手術(shù)治療的患者，年齡40～68歲。術(shù)前均未接受放療或化療。臨床病理特征見表1，每例標(biāo)本取癌組織和距離癌塊邊緣4 cm的正常食管組織各2塊，經(jīng)10%福爾馬林浸泡24 h固定，石蠟包埋，連續(xù)切片4張，厚度為4 μm，分別貼于涂有防脫片劑(10%多聚賴胺酸)的玻片上，進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。

1.2 免疫組化染色

1.2.1 主要試劑 鼠抗人cyclinD1單抗購于Santa-Cruz公司。鼠抗人P21單抗、SP9000試劑盒和DAB顯色盒均購自北京中山金橋公司。

1.2.2 基本步驟 采用SP三步法，染色步驟按SP9000試劑盒的說明書進(jìn)行。組織切片用PBS液(pH 7.4)沖洗，在滴加3%的過氧化氫溶液前使用微波爐抗原熱修復(fù)，加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至95℃左右，放入組織芯片加熱20 min；常規(guī)DAB顯色，顯微鏡下觀察，在背景顏色過深前終止反應(yīng)。P21抗體的工作濃度為1∶40,cyclinD1抗體的工作濃度為1∶200。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判別 P21陽性細(xì)胞的顯色部位在細(xì)胞核，為棕黃色，cyclinD1的陽性細(xì)胞多數(shù)在細(xì)胞核,少數(shù)在胞漿,圖像分析采用image pro plus5.0圖像分析軟件，陽性細(xì)胞<5%為(-)，5%～25%為(+)，26%～50%為(++)，51%～75%為(+++)，76%～100%為(++++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)，列聯(lián)表分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)觀察

80例癌組織標(biāo)本均經(jīng)病理科進(jìn)行HE染色確診(見圖a、b)，并按分化程度分級(見表1)。

圖a和圖b為食管鱗癌組織的HE染色，圖c為正常食管黏膜上皮，圖d為分化程度2級的P21染色，圖e為分化程度1級的P21染色，圖f為P21陰性的免疫組化染色，圖g和圖h為食管鱗癌組織的cyclinD1蛋白免疫組化染色。

2.2 P21和cyclinD1的陽性表達(dá)及分布特點(diǎn)

(1)正常的食管黏膜組織：在正常的食管黏膜組織上皮細(xì)胞中，P21的表達(dá)主要集中在生長分裂旺盛的基底層細(xì)胞，在成熟的上皮細(xì)胞中則基本上不表達(dá)(見圖c),而cyclinD1在正常食管組織中基本上不表達(dá)。(2)食管鱗癌組織：P21廣泛高水平表達(dá)于癌細(xì)胞中，呈灶狀或者彌漫性分布，部位主要在細(xì)胞核(見圖d、e)，cyclinD1同樣高水平表達(dá)于細(xì)胞核,少數(shù)胞漿也有表達(dá)(見圖g、h)。

表1 P21的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

注：食管癌TNM分期采用的是國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1987年的分期標(biāo)準(zhǔn)

2.3 P21和cyclinD1的表達(dá)特點(diǎn)

從正常的食管黏膜到癌組織P21呈現(xiàn)表達(dá)增加的趨勢，同時(shí)在P21強(qiáng)陽性的切片中cyclinD1均有高水平的表達(dá)(見表2)。P21和cyclinD1在正常食管組織和癌組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 P21與cyclinD1蛋白在食管鱗癌中表達(dá)的關(guān)系

2.4 P21的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

食管鱗癌患者的臨床病理特征和P21表達(dá)的相關(guān)性見表1，采用列聯(lián)表分析的方法，P21的表達(dá)與患者性別、年齡、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無直接相關(guān)性，但與患者有無吸煙史、腫瘤分化程度及腫瘤TNM分期密切相關(guān)，在P21高表達(dá)的患者中食管癌細(xì)胞的分化程度一般較低，預(yù)后較差。

3 討論

P21基因定位于6p21.2，其DNA長度為85kb，由3個(gè)外顯子組成，因編碼分子量為21KD的蛋白質(zhì)而得名。目前的研究表明腫瘤的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞周期素蛋白(cyclins)、依賴周期素蛋白激酶(CDKs)以及CDK抑制蛋白(CDKIs)的調(diào)節(jié)失控密切相關(guān)[2]，P21作為CDKIs的重要一族主要在兩個(gè)方面對細(xì)胞增殖發(fā)揮負(fù)性的調(diào)控作用。一是P21的N端有顯著的序列同源性，包含一個(gè)廣譜的與cyclin-CDKs復(fù)合物作用的位點(diǎn)，P21是細(xì)胞周期中G1/S限制點(diǎn)的“開關(guān)”，通過與cyclin-CDKs復(fù)合物的結(jié)合抑制其活性，使細(xì)胞發(fā)生G1期的停滯。二是其C端可以結(jié)合并抑制PCNA，使DNA全酶復(fù)合物不能在DNA單鏈上滑動(dòng)，從而影響DNA的復(fù)制，抑制了細(xì)胞的分裂增殖。而cyclinD是細(xì)胞周期運(yùn)行的起始因子，其表達(dá)完全依賴于生長因子[3]，自G1早期表達(dá)后其水平持續(xù)整個(gè)生長周期，而其他cyclins的表達(dá)都是后來被促進(jìn)的，cyclins和CDKs形成全酶復(fù)合物是細(xì)胞分裂增殖過程中的必需條件。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在分裂增殖旺盛的正常食管黏膜基底層細(xì)胞中P21有少量的表達(dá)，陽性細(xì)胞總數(shù)<5%，而在食管鱗癌組織中則呈廣泛的高水平表達(dá)。此結(jié)果與P21WAF-1作為抑癌基因的功能不一致，分析其原因可能有：(1)突變學(xué)說：P21在腫瘤細(xì)胞中突變，功能部分喪失，依賴P53激活的途徑是P21作為抑癌基因作用最為廣泛的途徑，但是目前的研究表明體內(nèi)多種惡性腫瘤組織的P21表達(dá)與P53無關(guān)[4]，可能與細(xì)胞損傷修復(fù)機(jī)制有關(guān)，雖然P21數(shù)量增多但是不能有效地抑制細(xì)胞的分裂增殖。(2)反饋學(xué)說：Harper等[5]的研究表明cyclin-CDKs復(fù)合物的活性轉(zhuǎn)變?nèi)Q于結(jié)合P21分子的數(shù)目，在無活性的復(fù)合物上通常結(jié)合了多個(gè)P21，兩者存在數(shù)量上依賴的關(guān)系。在腫瘤細(xì)胞分裂過程中cyclinD1以及cyclin-CDKs復(fù)合物濃度有明顯的提高，這種反饋使P21為了抑制腫瘤細(xì)胞的分裂增殖必須提高其濃度，增加與復(fù)合物的結(jié)合，抑制其生物活性，但是P21對cyclins-CDKs二元復(fù)合物沒有產(chǎn)生明顯的抑制作用。另一方面，Gulbis等[6]的研究發(fā)現(xiàn)P21的C端與PCNA以1∶1或1∶3的比例結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制，在分裂增殖旺盛的食管鱗癌組織，這兩方面的因素都可能增加P21的表達(dá)。(3)P21自身的調(diào)控失常：P21的自身調(diào)控有依賴P53途徑和非依賴P53途徑，還與P21轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控有關(guān)。(4)可能與組織的類型相關(guān)：不同類型來源的組織P21的作用可能不一致。徐建芳等[7]的研究發(fā)現(xiàn)P21在非小細(xì)胞肺癌中呈高水平表達(dá)，而在正常肺組織中基本不表達(dá)。錢小飛等[8]的實(shí)驗(yàn)表明在喉鱗癌組織中也存在P21的高水平表達(dá)，說明P21在不同組織中的作用可能不一致。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)cyclinD1作為細(xì)胞生長分裂所必需的蛋白，在正常食管組織中基本不表達(dá)，在食管鱗癌組織中則呈高水平表達(dá)，而且與P21的表達(dá)水平基本一致，表明在食管鱗癌細(xì)胞的分裂增殖過程中兩者可能存在數(shù)量上的對應(yīng)關(guān)系。

P21在正常食管組織的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于癌組織，并且與患者的吸煙史、腫瘤分化程度以及腫瘤TNM分期密切相關(guān)。食管癌細(xì)胞的分化程度以及食管癌的TNM分期是影響患者預(yù)后的重要因素之一，這表明P21蛋白作為一個(gè)重要的標(biāo)記物，可成為預(yù)測食管癌預(yù)后的潛在指標(biāo)。

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