郭朝猛， 袁 鵬， 聶夢良

循環(huán)腫瘤細(xì)胞是乳腺癌患者一種重要不良預(yù)后因素，因?yàn)樵缙诘哪[瘤細(xì)胞播散是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的主要原因之一[1-2]，如果能在亞臨床階段檢測到微小轉(zhuǎn)移灶，則對臨床判斷疾病預(yù)后和指導(dǎo)治療有重要意義。近年來，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)(RT-PCR)法檢測技術(shù)以其高靈敏性被廣泛應(yīng)用于各種實(shí)體惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測。本研究利用RT-PCR法，以CEA mRN為標(biāo)志物,檢測乳腺癌患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞,并初步探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院乳腺癌防治中心收治的46例女性乳腺癌患者外周血標(biāo)本，以上患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，年齡27～77歲，中位年齡49.7歲。組織學(xué)類型按WHO乳腺腫瘤組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分類：浸潤性導(dǎo)管癌43例，單純癌2例，黏液癌1例。TNM分期按國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期11例，Ⅱ期17例，Ⅲ期11例，Ⅳ期7例。所有患者取血前均未進(jìn)行手術(shù)、化療或放療。收集乳腺纖維瘤患者(17例)及健康志愿者(11例)的血標(biāo)本作為對照組。

1.2 試劑和引物設(shè)計(jì) RNA提取及RT-PCR試劑盒購自Promega公司，DNA Marker購自Sangon公司。CEA mRNA引物及內(nèi)參照參考文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，購自GIBICO公司。CEA mRNA上游引物序列為：5′-GAGCGAACCTCAACCTCTCCTGCCACT-3′，CEA mRNA下游引物序列為：5′-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3′，擴(kuò)增目的片段長度為366bp。PBGD上游引物序列為：5′-GAC TGG AGG AGT CTG GAG TC-3′，下游引物序列為：5′-AAT CCC TGG AAG GCT TGA AC-3′，擴(kuò)增目的片段長度為186bp。

1.3 標(biāo)本的收集與總RNA的抽提 抽取5 mL外周血，EDTA抗凝，采用淋巴細(xì)胞分離液，按密度梯度離心法，提取單個(gè)核細(xì)胞層(PMNC)。根據(jù)Total RNA Isolation System 試劑盒說明提取總RNA。

1.4 RT-PCR擴(kuò)增 按照Promega公司Access RT-PCR System 試劑盒說明進(jìn)行。RT-PCR總反應(yīng)體系為50 μL，其中AMV/Tf1 5×buffer 10 μL，dNTPs 1 μL，上游和下游引物各5 μL， 25mM MgSO42 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，Tf1 DNA聚合酶1 μL，RNA樣品3 μL，無核酶水22 μL。具體反應(yīng)條件如下：反轉(zhuǎn)錄48℃，45 min；反轉(zhuǎn)錄酶變性94℃，2 min。接以35次循環(huán)擴(kuò)增，末次延伸72℃，10 min。

1.5 PCR產(chǎn)物分析 取擴(kuò)增反應(yīng)液CEA mRNA與PBGD各7 μL，加上樣緩沖液混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外檢測儀下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 分類變量的檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEA mRNA的檢測結(jié)果 46例乳腺癌患者外周血中有15例CEA mRNA呈陽性，陽性率為32.6%(見圖1)。17例乳腺良性疾病患者和11例健康志愿者外周血中CEA mRNA表達(dá)均為陰性。乳腺癌組與對照組比較CEA mRNA陽性表達(dá)有極顯著差異(P<0.01)。

2.2 乳腺癌患者外周血中CEA mRNA的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 由表1可見CEA mRNA的陽性表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、TNM分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與患者的年齡、原發(fā)腫瘤大小、病理類型以及激素受體狀況等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 CEA mRNA檢測結(jié)果 M：DNA分子量標(biāo)志，1～5例為乳腺癌患者外周血中均出現(xiàn)186bp的內(nèi)參照PBGD陽性條帶，其中2、3泳道出現(xiàn)366bp的CEA mRNA 陽性條帶。

臨床病理參數(shù)例數(shù)CEAmRNA陽性(n，%)陽性陰性P值年齡(歲)>0．05 ≤49．7258(32．0)17(68．0) >49．7217(33．3)14(66．7)腫瘤大小(cm)>0．05 ≤2101(10．0)9(90．0) >23616(44．4)20(55．6)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移<0．05 有2112(57．1)9(42．9) 無253(12．0)22(88．0)TNM分期<0．05 Ⅰ112(18．2)9(81．8) Ⅱ173(17．6)14(72．4) Ⅲ114(36．4)7(63．6) Ⅳ76(83．3)1(16．7)病理類型>0．05 浸潤性導(dǎo)管癌4314(32．6)29(67．4) 其他31(33．3)2(66．7)ER>0．05 陰性258(32．0)17(68．0) 陽性217((33．3)14(66．7)PR 陰性288(28．6)20(71．4) 陽性187(38．9)11(61．1)>0．05

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，腫瘤的轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因，大約有30%的局限性乳腺癌患者最終發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這主要由于經(jīng)血流播種的腫瘤細(xì)胞引起[2]。如依靠腫瘤擴(kuò)散的臨床表現(xiàn)或者圖像分析技術(shù)來診斷腫瘤轉(zhuǎn)移，往往為時(shí)已晚。例如常規(guī)的影像學(xué)方法只能發(fā)現(xiàn)直徑≥1 cm 的結(jié)節(jié)(約1 g)，相當(dāng)于109個(gè)腫瘤細(xì)胞,這時(shí)常常已出現(xiàn)其他系統(tǒng)或器官的轉(zhuǎn)移；而血漿中大分子腫瘤標(biāo)志物濃度的改變常發(fā)生在疾病進(jìn)展的晚期。RT-PCR方法靈敏性高,可在106～107個(gè)WBC中檢測到1個(gè)癌細(xì)胞，且所需樣品量少[4-5]，被認(rèn)為是目前最適于發(fā)現(xiàn)腫瘤早期轉(zhuǎn)移的方法。

CEA mRNA屬于上皮組織特異性標(biāo)志基因，在正常人的間葉組織不表達(dá)；CEA在絕大多數(shù)導(dǎo)管浸潤性乳腺癌組織中呈陽性，而在原位癌、小葉癌中的陽性率僅為30%，在乳腺良性疾病中多呈陰性，這為檢測外周血中微轉(zhuǎn)移提供了可能[6]。本組46例乳腺癌患者外周血中有15例CEA mRNA陽性，陽性率為32.6%，而對照組中CEA mRNA表達(dá)均為陰性，表明CEA mRNA檢測乳腺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有較高的特異性。通過分析CEA mRNA的表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系顯示，乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、TNM分期與CEA mRNA的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在腫瘤大小、病理類型等方面CEA mRNA的檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示一旦在乳腺癌患者的外周血液中檢出CEA mRNA表達(dá)，表明患者可能已存在腫瘤微轉(zhuǎn)移，且隨分期的增加，CEA mRNA表達(dá)的陽性率亦增高。

血循環(huán)中檢測出腫瘤細(xì)胞，在一定程度上表明腫瘤具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移傾向，可幫助解釋臨床上一些早期無任何轉(zhuǎn)移征象的腫瘤患者在手術(shù)完整切除后仍然在短期內(nèi)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，這無疑也有助于臨床腫瘤的分期、治療方案的選擇和預(yù)后的判斷。本研究只在術(shù)前檢測了患者外周血中CEA mRNA的表達(dá)情況，關(guān)于CEA mRNA的陽性表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系還有待于對患者進(jìn)一步的隨訪、觀察。

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