趙建華， 唐金海

目前腫瘤的藥物治療仍主要依據(jù)各種用藥指南和醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)。同樣病癥的不同患者使用相同的藥物后常表現(xiàn)出明顯的療效差異，副作用亦千差萬(wàn)別，這一直是困擾臨床用藥并影響腫瘤治愈率的重大問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和人類(lèi)基因組研究的飛速發(fā)展，人們期望藥物基因組學(xué)的應(yīng)用能真正崛起解決這一難題。

藥物基因組學(xué)(pharmacogenomics)是在藥物遺傳學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，主要研究遺傳因素對(duì)藥物代謝和反應(yīng)的影響，確定藥物作用的靶點(diǎn)，研究從表型到基因型的藥物反應(yīng)的個(gè)體多樣性。他的實(shí)施有賴(lài)于遺傳差異的快速鑒定及其廣泛、高效的檢測(cè)分析[1]。目前，基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)給鑒定遺傳變異對(duì)藥物作用的影響提供了前提條件；高通量篩選系統(tǒng)及生物信息學(xué)等的發(fā)展，為藥物基因組學(xué)研究提供了高效的思路和手段。本文主要就藥物基因組學(xué)研究策略及其技術(shù)平臺(tái)的發(fā)展進(jìn)行簡(jiǎn)要概述。

1 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其檢測(cè)分析

人類(lèi)是具有遺傳多態(tài)性的群體，其基因組DNA序列中大約90%的變異形式是單核苷酸多態(tài)性。業(yè)已證明，編碼藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、靶蛋白(受體)和信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)因子等的基因都存在SNP現(xiàn)象，其中位于基因編碼區(qū)的SNP通常會(huì)引起蛋白質(zhì)氨基酸的變化，導(dǎo)致其活性或功能改變；位于調(diào)控區(qū)的SNP則可影響基因的表達(dá)和調(diào)控，也會(huì)影響藥物代謝和反應(yīng)[2]。通過(guò)檢測(cè)對(duì)特定藥物具有敏感性或抵抗性的患者群的SNP差異，可以尋找與藥物代謝和反應(yīng)有關(guān)的遺傳標(biāo)記，從遺傳背景預(yù)測(cè)個(gè)體的藥物反應(yīng)，指導(dǎo)臨床用藥。第一個(gè)被闡明具有SNP的代謝酶是細(xì)胞色素P450(CYP450)酶系中的CYP2D6，編碼此酶的基因具有多態(tài)性，導(dǎo)致患者對(duì)藥物呈現(xiàn)快代謝和慢代謝兩種不同的代謝方式，慢代謝型患者體內(nèi)的CYP2D6酶不能很快地分解藥物，使其血液中的活性藥物濃度升高，提示該基因型個(gè)體易產(chǎn)生藥物中毒，治療時(shí)應(yīng)適當(dāng)減少藥物用量[3]。最近，美國(guó)FDA要求在伊立替康的藥物包裝內(nèi)附上尿苷二磷酸葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶(UTG)1A1基因分型信息，推薦以基因型為基礎(chǔ)選擇藥物治療用量；幾項(xiàng)臨床前瞻性研究也證實(shí)預(yù)先基因分型再指導(dǎo)藥物劑量選擇對(duì)減少該藥毒性有重要價(jià)值，從而推動(dòng)了藥物基因組學(xué)向臨床應(yīng)用邁進(jìn)。目前，已陸續(xù)有不少關(guān)鍵通路上的代謝酶或蛋白因子的SNP被鑒定，它們?cè)谒幬锘蚪M研究中正扮演著重要角色[4]，有待于人們的開(kāi)發(fā)與利用。

關(guān)于SNP的檢測(cè)，目前大多仍以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)識(shí)別SNP原理的不同主要分為4種類(lèi)型：(1)PCR-酶切電泳技術(shù)：傳統(tǒng)方法有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)，該技術(shù)雖有利于未知位點(diǎn)的篩查，但因需要PCR后酶切電泳分析，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且難以自動(dòng)化。近年來(lái)隨著引物入侵分析技術(shù)以及PCR擴(kuò)增-雙重引物入侵分析等方法的引進(jìn)，SNP檢測(cè)效率及通量有了明顯提高。(2)等位基因特異性雜交技術(shù)：包括TaqMan探針、分子信標(biāo)、動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交以及芯片技術(shù)等，其突出的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確可靠地探測(cè)特異等位基因序列，方便快捷且可實(shí)時(shí)監(jiān)控；如采用多色熒光標(biāo)記或利用芯片，則可明顯提高檢測(cè)通量；但要確保準(zhǔn)確分型，探針的設(shè)計(jì)非常關(guān)鍵。(3)引物延伸技術(shù)：包括基于堿基序列測(cè)定的單重或多重測(cè)序法以及基于引物3’端堿基互補(bǔ)性的等位基因特異性延伸法。后者的關(guān)鍵問(wèn)題是引物的非特異性延伸，后經(jīng)Ahmadian等[5]通過(guò)引入三磷酸酰苷雙磷酸酶在錯(cuò)配堿基發(fā)生延伸反應(yīng)前將其降解的方法以及Zhou等[6]采用的引入人工突變堿基的方法，得到了較好的解決?；蛐酒Y(jié)合引物延伸技術(shù)是2000年P(guān)astinen等[7]發(fā)展的一種SNP檢測(cè)新策略，具有通用性強(qiáng)和通量高等優(yōu)勢(shì)。Hirschorn 等[8]利用該方法測(cè)定了100多個(gè)SNPs，獲得5 000 多個(gè)基因型，精確度在99%以上。(4)寡核苷酸連接技術(shù)：是在連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，由耐熱DNA連接酶介導(dǎo)的一種等位基因特異性寡核苷酸探針連接反應(yīng)。利用高溫下兩條探針的特異性雜交以及連接酶反應(yīng)的忠實(shí)性使分型準(zhǔn)確性得以雙重保證，尤其是對(duì)于重復(fù)序列區(qū)域多態(tài)性的特異檢測(cè)是其獨(dú)到的優(yōu)點(diǎn)[9]。如將該技術(shù)與通用芯片技術(shù)或色譜技術(shù)等相結(jié)合，可在保證分型準(zhǔn)確性的同時(shí)將其檢測(cè)通量由幾個(gè)或十幾個(gè)提高到成百上千個(gè)[10]。

2 連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析

連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析的原理和假說(shuō)基本相似，兩者均以相鄰近的DNA變異共分離為基礎(chǔ)。連鎖分析是通過(guò)鑒定經(jīng)多代傳遞仍完整的單倍型為基礎(chǔ)的，檢測(cè)在一個(gè)家系中等位基因與疾病的傳遞是否相關(guān)。而關(guān)聯(lián)分析則是在一個(gè)群體中或在不相關(guān)人群中尋找與性狀(疾病或藥物反應(yīng))相關(guān)的染色體區(qū)域。在常見(jiàn)的復(fù)雜性疾病如腫瘤中，由于每個(gè)效應(yīng)基因的貢獻(xiàn)度較小，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析往往比連鎖分析更有效[11]。

1999年Evans等[12]認(rèn)為藥物治療的綜合藥理效應(yīng)是典型的非單基因特性，更確切地說(shuō)應(yīng)是幾種基因編碼蛋白質(zhì)包括藥物代謝、分布及效應(yīng)的多種途徑的相互作用。2000年Rosos[13]提出選擇一些與藥效及普通不良反應(yīng)表型相關(guān)聯(lián)的SNP鏈鎖非均衡的小部位就有可能實(shí)現(xiàn)快速和廉價(jià)地篩分患者對(duì)藥物療效和副作用的反應(yīng)。通常，一個(gè)染色體區(qū)域可以有很多SNP位點(diǎn)，但只用少數(shù)幾個(gè)標(biāo)簽SNPs,就能夠提供該區(qū)域內(nèi)大多數(shù)的遺傳多態(tài)模式，這樣將大大減少用于基因型與疾病關(guān)聯(lián)分析中的SNPs[13]。目前，基于SNP的連鎖圖譜已經(jīng)開(kāi)始構(gòu)建，人們可利用它作為工具對(duì)藥物體內(nèi)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中多個(gè)相關(guān)基因及其SNPs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，且已有一些研究證實(shí)，單倍型分析(共同遺傳的多態(tài)性組合)比單個(gè)多態(tài)性分析具有更好的表型相關(guān)性[9,12]。如Drysdale等[14]利用SNP關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行哮喘病藥物基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)β2-腎上腺素受體(β2-AR)基因上13個(gè)SNPs所形成的不同單倍型與β2-AR激動(dòng)劑的治療反應(yīng)顯著相關(guān)，而個(gè)體SNPs的影響作用很小。

3 基因表達(dá)譜的研究與檢測(cè)分析

腫瘤的治療效果不僅與患者本身的遺傳背景相關(guān)，而且與惡性腫瘤組織的遺傳學(xué)改變密切相關(guān)。腫瘤組織基因表達(dá)譜的研究，可以探尋與疾病有關(guān)的基因和闡明藥物的作用機(jī)理，同時(shí)還可以確定某差異表達(dá)基因是否能夠成為藥物靶點(diǎn)或直接作為治療藥物(基因藥物或蛋白質(zhì)藥物)，如Herceptin(用于治療乳腺癌)、Erbitux(用于治療直腸癌)以及Gleevec(imatinib，用于腫瘤治療)等藥品，都是成功的針對(duì)患者中某特定基因或蛋白過(guò)表達(dá)的個(gè)體所開(kāi)發(fā)的藥物。

基因的表達(dá)差異也是藥物療效的基礎(chǔ)。如5-氟尿嘧啶(5-FU)的治療反應(yīng)除了受二氫嘧啶脫氫酶、胸苷酸合成酶和胸苷酸磷酸化酶等基因的多態(tài)性影響外，腫瘤組織異常表達(dá)的基因同樣也影響其療效；研究人員通過(guò)分析在乳腺癌細(xì)胞株中5-FU誘導(dǎo)的基因表達(dá)，已經(jīng)確定了與耐藥和療效有關(guān)的基因[15,16]；Szoke等[17]通過(guò)分析文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)5-FU耐藥的胃癌和結(jié)直腸癌的全基因組基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胃癌和結(jié)直腸癌中與5-FU 耐藥相關(guān)的表達(dá)譜是一致的，提示不同腫瘤對(duì)5-FU可能具有相同的耐藥機(jī)制。另外，常見(jiàn)的成人或兒童急性白血病的微陣列基因表達(dá)分析可以鑒定與特殊染色體易位或刪除有關(guān)的分子圖表類(lèi)型，用以指導(dǎo)臨床進(jìn)行不同治療方案的選擇[18]。

4 基因組學(xué)研究與基因芯片的檢測(cè)分析

選擇與藥物起效、活化、排泄等過(guò)程相關(guān)的候選基因并鑒定其基因序列的變異是藥物基因組學(xué)研究的首要策略[1]。雖然人類(lèi)基因組序列圖譜對(duì)辨認(rèn)基因起了關(guān)鍵作用，但是人類(lèi)基因圖譜還沒(méi)有完全弄清遺傳方面的差異，而這種差異即SNP與疾病、臨床診斷和藥物反應(yīng)差異等密切相關(guān)。為了能尋找出個(gè)體差異的內(nèi)因，科學(xué)家制訂了一項(xiàng)繪制新型基因圖譜，從生命本源追溯人與人之間的差異，探索疾病之源的計(jì)劃——人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃(Hap Map)[2]。隨著Hap Map計(jì)劃的完成，引起諸如癌癥、心臟病、糖尿病和精神分裂癥等疾病的基因?qū)?huì)被確認(rèn)和研究，利用這些信息或知識(shí)藥物基因組學(xué)研究可以發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)以及闡明測(cè)定特定藥物治療的藥效和毒性的基因群集。

基因芯片(gene chip)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用可以加快這一進(jìn)程，即加速與疾病或藥物相關(guān)基因或信號(hào)傳遞路徑的發(fā)現(xiàn)和鑒定。以前，藥物基因組研究多局限于某一個(gè)或幾個(gè)基因及其多態(tài)性與藥物反應(yīng)的關(guān)系，無(wú)法全面認(rèn)識(shí)藥物作用過(guò)程中各相關(guān)基因所承擔(dān)的作用和復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系；而基因芯片技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)幾千，甚至幾萬(wàn)個(gè)基因的變異或差異表達(dá)狀態(tài)，并分析它們之間的相互作用關(guān)系，為藥物基因組學(xué)研究提供了重要工具[19]。隨著技術(shù)的成熟，基因芯片在藥物基因組學(xué)研究中的應(yīng)用也逐步深入，歸納起來(lái)包括：(1)他可以為DNA序列變異體建立“標(biāo)簽”，利用這些標(biāo)簽可根據(jù)疾病易感性和藥物反應(yīng)的遺傳學(xué)亞型將患者分類(lèi)，優(yōu)化臨床藥物治療。(2)他可以用來(lái)篩選藥物作用的靶基因。選擇合適的藥物作用的靶細(xì)胞，以不同的藥物劑量和不同的藥物作用時(shí)間，確定藥物作用于靶細(xì)胞后與基因表達(dá)水平改變之間的量效和時(shí)效關(guān)系，然后獲取藥物在一定濃度、一定時(shí)間條件下作用的細(xì)胞和未經(jīng)處理的細(xì)胞，于同樣條件下進(jìn)行表達(dá)譜基因芯片的檢測(cè)，最終確定藥物所作用的基因靶點(diǎn)，促進(jìn)新藥的開(kāi)發(fā)和利用。(3)基因芯片還可以高通量檢測(cè)基因的表達(dá)，確定患者基因組中出現(xiàn)的多態(tài)性和腫瘤組織的遺傳學(xué)變異；如果利用基因芯片分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)的差異，還能從基因水平解釋藥物的作用機(jī)制[19]。

基因芯片技術(shù)的發(fā)展很快，已由十年前的固定式寡核苷酸探針“線(xiàn)性陣列”發(fā)展為高密度寡核苷酸微陣列技術(shù)，密度現(xiàn)已可達(dá)到40萬(wàn)種探針/芯片，如與多元PCR反應(yīng)結(jié)合，還能同步檢測(cè)在單一等位基因特異雜交反應(yīng)中是否存在SNPs、插入和敲除、基因轉(zhuǎn)換、完整基因刪除與基因復(fù)制事件。目前，阻礙基因芯片在臨床常規(guī)應(yīng)用的原因，除了技術(shù)難度較高和成本昂貴以外，最重要的問(wèn)題是如何實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化。在基因芯片領(lǐng)域已存在多種微陣列技術(shù)平臺(tái)如基于雜交、引物延伸或連接反應(yīng)等的芯片，使用不同系列的基因以及不同的雜交信號(hào)和檢測(cè)方法，以致于為同一目的進(jìn)行的研究常常會(huì)得到不同的結(jié)果，無(wú)法進(jìn)行最終判斷?；蛐酒瑱z測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化已迫在眉睫。

5 蛋白組學(xué)研究與蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)分析

如何準(zhǔn)確地定義臨床藥物效應(yīng)的表型并將其與基因型關(guān)聯(lián)起來(lái)用于指導(dǎo)藥物治療，是藥物基因組學(xué)研究的主要策略[1]。由于蛋白表達(dá)與基因的關(guān)系為非線(xiàn)性關(guān)系以及藥物作用大多是在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行的，因此從基因和蛋白質(zhì)水平互補(bǔ)地闡明遺傳多態(tài)性與藥物療效、毒副作用之間的相互關(guān)系非常必要。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的互補(bǔ)價(jià)值主要體現(xiàn)在：(1)有些基因的突變?yōu)槌聊蛔?，與基因產(chǎn)物的功能無(wú)關(guān)；(2)在相當(dāng)情況下某一基因的SNPs數(shù)量太多，相比較分析每一種遺傳變異而言，對(duì)基因功能產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)行分析更為便捷；(3)從基因-mRNA-蛋白質(zhì)所構(gòu)成的遺傳信息傳遞的流程圖來(lái)看，什么情況下有什么樣的蛋白質(zhì)不僅取決于基因，還與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)能力、機(jī)體所處的周?chē)h(huán)境及機(jī)體本身的生理狀況有關(guān)；(4)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮和相互作用亦存在類(lèi)似于mRNA分子內(nèi)的剪切、拼接等自身特有的規(guī)律，這種自主性不能從基因的編碼序列中預(yù)測(cè)，只能通過(guò)對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)行分析[20]。因此，以蛋白質(zhì)組學(xué)為平臺(tái)的藥物效應(yīng)評(píng)估也應(yīng)該同樣被重視。

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(Protein Chip)是繼基因芯片之后發(fā)展起來(lái)的研究蛋白質(zhì)組學(xué)的有力工具。目前主要有二種類(lèi)型：一類(lèi)是蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片，類(lèi)似于較早出現(xiàn)的基因芯片，將成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)如抗原、抗體、受體或酶等在固相載體表面高度密集排列構(gòu)成探針蛋白點(diǎn)陣，然后依據(jù)蛋白質(zhì)分子間或蛋白質(zhì)與核酸間相互作用的原理與樣品雜交，實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)和分析；第二類(lèi)是蛋白質(zhì)功能芯片，其本質(zhì)就是微型化凝膠電泳板，樣品中的待測(cè)蛋白在電場(chǎng)作用下通過(guò)芯片上的微孔道進(jìn)行分離，然后經(jīng)噴射進(jìn)入質(zhì)譜儀中對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析。

6 生物信息學(xué)的研究

生物信息學(xué)(bioinformatics)是隨著基因組計(jì)劃的啟動(dòng)而興起的一門(mén)計(jì)算機(jī)、數(shù)學(xué)、信息技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)交叉結(jié)合的新興學(xué)科，通過(guò)對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、貯存、檢索與分析等，進(jìn)而揭示數(shù)據(jù)所蘊(yùn)涵的生物學(xué)意義。該學(xué)科的初期階段包括核酸序列和蛋白質(zhì)序列的分析和數(shù)據(jù)管理、尋找調(diào)控區(qū)、對(duì)序列結(jié)構(gòu)作出預(yù)測(cè)等。隨著人類(lèi)基因組和模式生物基因組測(cè)序計(jì)劃的實(shí)施，又包括了基因組信息的獲取、處理、分析和解釋?zhuān)瑢?duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能和定位分類(lèi)及相關(guān)軟件的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，以及高通量藥物篩選及其數(shù)據(jù)的信息處理與分析等[20]。

生物信息學(xué)幾乎是所有生物(醫(yī)藥)研究開(kāi)發(fā)所必需的工具；只有根據(jù)生物信息學(xué)對(duì)大量數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析后,才能選擇該領(lǐng)域正確的研發(fā)方向。如在人類(lèi)基因組中，估計(jì)有300萬(wàn)～1 000萬(wàn)個(gè)SNPs。對(duì)于如此巨大的數(shù)目，用生物信息學(xué)手段和計(jì)算機(jī)學(xué)自動(dòng)識(shí)別方法相結(jié)合，并充分利用DNA信息數(shù)據(jù)庫(kù)，才能夠簡(jiǎn)便、有效、價(jià)廉地發(fā)掘出具有應(yīng)用價(jià)值的SNPs，用于藥物基因組學(xué)研究。

總之，藥物基因組學(xué)作為新興的人類(lèi)基因組學(xué)的分支學(xué)科,研究所用的方法和技術(shù)牽涉較廣而且許多技術(shù)屬于人類(lèi)基因組學(xué)的前沿研究課題,如高通量SNPs檢測(cè)、DNA微陣列技術(shù)和蛋白芯片等正在不斷發(fā)展之中。可以預(yù)料,隨著高通量、高靈敏度和特異性的研究方法和技術(shù)平臺(tái)的成熟和標(biāo)準(zhǔn)化，藥物基因組學(xué)將能為特定人群設(shè)計(jì)最為有效的藥物,為每一個(gè)患者設(shè)計(jì)最為理想的用藥方案,不僅可以提高療效,縮短療程,而且可以減少毒副作用，降低醫(yī)藥費(fèi)用，真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。

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