陳海英 羅天寬 張小玲 唐征 劉慶

（溫州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)系，浙江溫州，325006）

花椰菜最適ISSR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

陳海英 羅天寬 張小玲 唐征 劉慶

（溫州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)系，浙江溫州，325006）

以花椰菜9901A×9908雜交種為材料，用高鹽低pH值法提取的基因組DNA為模板，對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系中的鎂離子濃度、dNTP濃度、Taq DNA聚合酶量、引物用量以及最適退火溫度等影響因子進(jìn)行了優(yōu)化和篩選，建立了適合花椰菜的ISSR反應(yīng)體系：20 μL PCR反應(yīng)體系，含10×PCR反應(yīng)緩沖液2 μL，2.0 mmol/L MgCl2，4×dNTP混合物0.2 mmol/L，引物0.5 μmol/L，Taq酶1.5 U，基因組DNA約30 ng，最適退火溫度為52.8℃。

花椰菜 ISSR 反應(yīng)體系 優(yōu)化

花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytisL.）別名花菜、菜花，屬于十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種，屬一、二年生草本植物，起源中心為地中海東部沿岸，19世紀(jì)中葉傳入中國南方，是重要的蔬菜作物?；ㄒ藸I養(yǎng)豐富，據(jù)日本癌癥預(yù)防研究所對(duì)20種蔬菜食品的抗癌成分及抑癌試驗(yàn)結(jié)果分析，花椰菜含有多種吲哚衍生物，具有明顯的抗癌作用[1]?；ㄒ耸怯梢吧仕{(lán)進(jìn)化而來，由于生長習(xí)性的演變和階段性的變異，經(jīng)不同環(huán)境條件和不同目標(biāo)的選擇和培育而形成的變種，是生物學(xué)研究的很好試材；加之其營養(yǎng)豐富，適應(yīng)性廣，在我國分布地區(qū)很廣，因而也成為育種者和消費(fèi)者都十分喜愛的蔬菜[2～3]。

ISSR標(biāo)記是一項(xiàng)以SSR區(qū)域?yàn)橐锝Y(jié)合區(qū)，以SSR間區(qū)為擴(kuò)增區(qū)的分子標(biāo)記技術(shù)，其多態(tài)性是來源于擴(kuò)增區(qū)的DNA片段長度多態(tài)性。ISSR不象SSR具有物種特異性，其引物為隨機(jī)引物，故可以像RAPD一樣用于各種植物的研究。ISSR標(biāo)記結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，具有模板需要量少，多態(tài)性豐富，無需試劑盒，試驗(yàn)成本低，操作簡單，試驗(yàn)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[4]。ISSR技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于大麥、小麥、水稻、馬鈴薯等農(nóng)作物的研究[4～6]。本研究應(yīng)用ISSR分析方法，以花椰菜基因組DNA為材料，探討ISSR-PCR反應(yīng)體系中各種因素對(duì)其擴(kuò)增的影響，通過單因素試驗(yàn)確定Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶和引物在花椰菜ISSR-PCR反應(yīng)體系中的最適宜濃度，獲得花椰菜ISSR反應(yīng)的最佳體系，旨在為花椰菜種質(zhì)資源的科學(xué)利用和分子標(biāo)記輔助育種等方面提供技術(shù)支持。

表1 ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化設(shè)計(jì)

圖1 退火溫度對(duì)花椰菜ISSR擴(kuò)增的影響

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為花椰菜9901A×9908雜交種處于旺盛營養(yǎng)生長期的葉片，采樣后將葉片裝于紙袋中，置于-70℃低溫冰箱保存，用于DNA提取。

1.2 試驗(yàn)方法

①基因組DNA的提取和純化 花椰菜基因組DNA的提取，采用改進(jìn)的高鹽低pH值法[7]。取低溫保存的葉片約0.2 g，于1.5 mL離心管中，加入液氮迅速研磨成粉末，立即加入800 μL 65℃預(yù)熱的高鹽低pH值提取緩沖液，充分混勻，65℃保溫30～60 min，不時(shí)搖晃混勻。加入300 μL的5 mol/L NaAc（pH值5.2）溶液，于-20℃放置20 min后，12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)至另一管中，加入0.6倍體積的異丙醇，小心混勻，靜置5 min。12 000 r/min離心10 min，傾去上清液得DNA沉淀。沉淀用70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于500 μL無菌水中，再加入15 μL RNase A（2.5 mg/mL），于37℃保溫30 min，加入1/5體積的3 mol/L NaAc（pH值5.2）和0.6倍體積的異丙醇，12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于150 μL無菌水中，-20℃冰箱保存。

②ISSR擴(kuò)增反應(yīng)單因素篩選 ISSR擴(kuò)增反應(yīng)采用20 μL反應(yīng)體系，其中25 mmol/L Mg2＋1.8 μL，10mmol/L dNTP 0.4 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，10 ng/μL引物1 μL，模板約30 ng，滅菌水12.5 μL。試驗(yàn)初始反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，然 后 進(jìn) 入 循 環(huán) ：94℃ 1 min，50℃ 復(fù) 性1 min，72℃延伸1.5 min，經(jīng)40個(gè)循環(huán)，再經(jīng)72℃延伸10 min后，于5℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中分離，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)（Electrophoresis Image Analysis System，F(xiàn)R-980）中拍照并保存。

圖2 引物濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

③ISSR PCR中退火溫度的確定和反應(yīng)體系的優(yōu)化 進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)采用梯度PCR儀（eppendorf），根據(jù)引物的Tm值在45～55℃自動(dòng)設(shè)置12個(gè)溫度梯度。PCR反應(yīng)參考劉沖等[8]的方法進(jìn)行，20 μL反應(yīng)體系中，反應(yīng)因素dNTP，Taq酶、Mg2＋以及引物的濃度等幾個(gè)關(guān)鍵因子的變化進(jìn)行條件優(yōu)化，各參數(shù)分別設(shè)置5～7個(gè)濃度水平（表1），采用篩選的引物ISSR17（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化。試驗(yàn)中，對(duì)ISSR擴(kuò)增反應(yīng)某一成分設(shè)置梯度進(jìn)行篩選時(shí)，保持其他成分不變，調(diào)整雙蒸水用量使其總體積保持不變。

④數(shù)據(jù)處理與分析 應(yīng)用復(fù)日Smart View TM生物電泳圖像分析軟件對(duì)凝膠圖譜片段進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 退火溫度的確定

在進(jìn)行ISSR擴(kuò)增優(yōu)化之前確定引物的退火溫度非常重要，退火溫度不僅與引物序列有關(guān)，還與物種DNA的序列有密切關(guān)系。先參照李鈞敏等[9]的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行引物的初篩，選擇能看到清晰條帶的引物ISSR17進(jìn)行退火溫度的確定。結(jié)果表明，退火溫度對(duì)ISSR-PCR的影響非常明顯：在45～49.7℃范圍內(nèi)，擴(kuò)增條帶數(shù)較少，模糊；在50.4～55℃范圍內(nèi)，擴(kuò)增條帶增多，條帶清晰，亮度較大（圖1）。引物ISSR17根據(jù)公式Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T）計(jì)算的退火溫度為50℃，而本研究中，最適的退火溫度為52.8～54.5℃，我們選擇靠近Tm的52.8℃為花椰菜的最適溫度。

圖3 Mg2＋濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

圖4 dNTPs濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

2.2 引物濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

本研究設(shè)定了5個(gè)引物濃度梯度（圖2），當(dāng)加入引物量為0.4～0.6 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增的帶型比較穩(wěn)定一致，但從穩(wěn)定性和擴(kuò)增條帶的強(qiáng)度來看濃度為0.5 μmol/L時(shí)，能擴(kuò)增出比其他更清晰穩(wěn)定的條帶，因此把它作為最佳濃度。而當(dāng)濃度增大到0.7 μmol/L時(shí)，主帶減弱，條帶變得模糊，背景加深（圖2）。

2.3 Mg2＋濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

Mg2＋離子濃度是影響PCR結(jié)果的一個(gè)主要變化因素，它不僅影響Taq酶活性，還能與反應(yīng)液中的dNTPs、模板DNA及引物結(jié)合影響引物與模板的結(jié)合效率[7]。本研究設(shè)置了7個(gè)Mg2＋濃度梯度，Mg2＋濃度對(duì)擴(kuò)增的條帶有明顯的影響，當(dāng) Mg2＋濃度在 1.5～2.0 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶比較清晰、亮度較大，而且背景明顯；但當(dāng)濃度在2.25～3.0 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶呈彌散趨勢，圖象顯得不清晰。故取2.0 mmol/L為最適濃度（圖3）。

2.4 dNTPs濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

dNTPs是PCR反應(yīng)的原料，濃度過高會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤滲入，濃度太低導(dǎo)致產(chǎn)率太低，通常dNTPs濃度在0.02～0.20 mmol/L[10]。本試驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)dNTPs濃度梯度（圖4），當(dāng)dNTPs為0.2 mmol/L和0.25 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定，且重復(fù)性高，本研究采用dNTPs的最適濃度為0.2 mmol/L。

圖5 TaqDNA聚合酶對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

2.5 Taq DNA聚合酶對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

Taq酶的使用量也是影響PCR的一個(gè)重要因素，高濃度的Taq酶不僅成本較高，而且容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，Taq酶濃度過低則會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的合成效率下降[11]。本試驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)Taq酶濃度梯度（圖5），結(jié)果在20 μL的反應(yīng)體系中，Taq酶用量為0.5 U時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)條帶少；Taq酶用量為1.0～1.5 U時(shí)Taq酶擴(kuò)增的條帶清晰，且隨濃度的升高，條帶亮度略有增加；Taq酶用量為2.0～2.5 U時(shí)，擴(kuò)增條帶呈彌散趨勢。因此，本研究選用1.5 U的Taq酶為最佳用量。

3 小結(jié)與討論

隨著分子生物學(xué)的應(yīng)用和發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)（RAPD，ISSR，SSR，RFLP，AFLP，SRAP等）已成為作物品種改良的先導(dǎo)技術(shù)。分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，已開始廣泛應(yīng)用于蔬菜作物品種鑒定與純度檢測中[11～12]。

ISSR是基于PCR擴(kuò)增反應(yīng)篩選DNA多態(tài)性的一種分子標(biāo)記技術(shù)，因而影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的各種因素（如模板DNA、Taq酶、dNTP、Mg2＋以及引物等）同樣影響ISSR的擴(kuò)增效果[13]。因此，在研究時(shí)都應(yīng)先建立起合適的反應(yīng)體系并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，以獲得重復(fù)性和可靠性較高的ISSR譜帶。本研究結(jié)果確定了適合花椰菜9901A×9908雜交種的最適ISSR-PCR反應(yīng)體系為：20 μL反應(yīng)體積，含10×PCR反應(yīng)緩沖液2 μL，2.0 mmol/L MgCl2，4×dNTP混合物0.2 mmol/L，引物0.5 μmol/L，Taq酶1.5 U，基因組DNA約30 ng。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)：94℃ 1 min，52.8℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，經(jīng)40個(gè)循環(huán)，再經(jīng)72℃延伸10 min后，于5℃保溫，建立了穩(wěn)定的花椰菜ISSR反應(yīng)體系。

[1]李梅，趙前程，孫德嶺，等.花椰菜葉色突變的RAPD分析[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2004，10（4）：10-12.

[2]張凱，徐艷輝.花椰菜的分子遺傳與育種研究進(jìn)展概述[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（1）：31-34.

[3]宋麗娜，張賽群，張麗芳，等.花椰菜自交不親和性的分子標(biāo)記研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，44（增刊）：140-143.

[4]Qian W,Ge S,Hong D Y.Genetic variation within and among populations of a wild rice Oryza granulata from China detected by RAPD and ISSR markers [J].Theor Appl Genet,2001,102:440-449.

[5]Fernandez M,Figueiras A,Benito C.The use of ISSR and RAPD markers for detecting DNA polymorphism,genotype identification and genetic diversity among barley cultivars with known origin [J].Theor Appl Genet,2002,104:845-851.

[6]Prevost A,Wilkinson M J.A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars [J].Theor Appl Genet,1999,98:107-112.

[7]王培訓(xùn)，黃豐，周聯(lián)，等.植物中藥材總DNA提取方法的比較[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10（1）：18-20.

[8]劉沖，葛才林，任云英，等.SRAP、ISSR技術(shù)的優(yōu)化及在甘藍(lán)類植物種子鑒別中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2006，22（4）：657-661.

[9]李鈞敏，金則新.適合西蘭花的ISSR反應(yīng)體系的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（1）：79-81.

[10]郭軍，壽森炎，盧鋼，等.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在品種鑒定和純度分析上的應(yīng)用[J].種子科技，2000（4）：217-219.

[11]古瑜，孫德嶺，宋文芹.生物技術(shù)在花椰菜遺傳育種中的應(yīng)用[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，13（2）：14-19.

[12]柳李旺，侯喜林，龔義勤，等.分子標(biāo)記技術(shù)在蔬菜作物品種鑒定與純度檢測中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2004，2（4）：563-568.

[13]馬金駿，冒維維，朱玉英，等.不結(jié)球白菜ISSR反應(yīng)條件的優(yōu)化[J].分子植物育種，2007，5（11），207-212.

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Establishment and Optimization of ISSR Reaction System in Cauliflower

CHEN Haiying,LUO Tiankuan,ZHANG Xiaoling,TANG Zheng,LIU Qing
(Department of Agriculture and Biotechnology,Wenzhou Vocational College of Science and Technology,Wenzhou 325006）

The effect of Mg2+,dNTP,primer,Taq DNA polymerase and annealing temperature on ISSR-PCR amplification reaction were studied using the genomic DNA as template,extracted with low pH,high-salt method in cauliflower.The results showed that the conditions suitable for ISSR-PCR were as follows:2 μL 10×Taq buffer,2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,0.5 μmol/L primers,1.5 U Taq DNA polymerase and 30 ng template DNA in total 20 μL reaction volume,and the optimum annealing temperature was 52.8℃.

Cauliflower;ISSR;Reaction system;Optimization

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.12.005

浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助，浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2008C22094）資助

陳海英（1979-），女，博士，講師，從事微生物及分子生物學(xué)研究。E-mail：chy2201@163.com

2008-11-21