肖仲久 李小霞 張素勤 蔣選利

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽，550025；2.遵義師范學(xué)院生物系）

抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）在辣椒抗病基因研究中的應(yīng)用

肖仲久1李小霞2張素勤1蔣選利1

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽，550025；2.遵義師范學(xué)院生物系）

基于抑制性PCR及差減雜交技術(shù)建立的抑制性消減雜交技術(shù)，因其假陽性率低、敏感性高、效率高等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于植物基因差異表達研究。對該技術(shù)的原理、主要優(yōu)缺點及其在辣椒植物抗病性機制研究中的應(yīng)用進行了綜述。

抑制性消減雜交技術(shù) 植物抗病性 辣椒

眾多研究表明，植物的生長、發(fā)育、衰老和死亡，組織和細胞的分化、凋亡及變異都與基因的選擇性差異表達有關(guān)[1]。因此，分離并克隆差異表達基因被廣泛應(yīng)用于植物的改良、抗逆、抗病等研究中。目前，基因克隆主要從3個不同的水平上進行研究，即：基因組水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)組水平。由于真核基因組中只有15%的基因得到表達，從轉(zhuǎn)錄水平進行基因的尋找和分離將會簡化分析背景，使目標(biāo)序列相對富集，便于克隆和分析[2]。因此，從轉(zhuǎn)錄水平尋找和分離植物基因是最常用的方法。基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，涌現(xiàn)了許多分離有差別表達基因的方法，比如，mRNA差異顯示技術(shù)（mRNA differential display reverse transcription PCR或DD）、代表性差異分析技術(shù)（representational difference analysis或RDA）等。但這些技術(shù)存在著諸如：假陽性率高、差異基因豐度差別大、步驟繁瑣、工作量大等問題。

而抑制性消減雜交 （suppression subtractive hybridization，SSH）是基于抑制PCR和差減雜交技術(shù)建立起來的簡單有效的方法[3]，因其操作簡單、篩選效率高、假陽性率低等優(yōu)點被廣泛用于生命科學(xué)各個領(lǐng)域[4]。

在辣椒生產(chǎn)上，各產(chǎn)區(qū)的辣椒生產(chǎn)從播種到收獲均受到不同程度的病害為害。主要有猝倒病、立枯病、灰霉病、白粉病、青枯病、枯萎病、病毒病、晚疫病、炭疽病、瘡痂病及線蟲病等[5]。因此，積極開展病害病因診斷、治療和抗病基因功能與機制的研究是當(dāng)務(wù)之急。目前，從分子水平規(guī)模篩選與辣椒病害基因的發(fā)生發(fā)展機制以及抗病基因的抗病機制密切相關(guān)的基因已成為研究熱點。

故本文就SSH技術(shù)的基本原理、主要過程及該技術(shù)的優(yōu)缺點等進行簡要介紹，并對其在辣椒抗病基因研究中的應(yīng)用進展作一綜述。

1 抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)的主要原理和基本過程

抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）運用了雜交二級動力學(xué)原理，是一種以抑制性PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，將標(biāo)準(zhǔn)化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術(shù)。在一個循環(huán)過程中完成單鏈cDNA豐度的均等化及目標(biāo)群體和對照群體中相同cDNA序列的去除，從而富集差異表達的基因。整個過程既利用了差減雜交技術(shù)的差減富集，又利用了抑制PCR技術(shù)的高效動力學(xué)富集。

抑制性差減雜交（SSH）經(jīng)過了兩次差減雜交，兩次抑制性PCR過程。①第一次差減雜交：將含有要分離的差異表達的組織（細胞）作為Tester，對照組織（細胞）作為Driver，分別提取2種不同細胞總RNA，并分離出 mRNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，分別用限制酶消化cDNA，以產(chǎn)生cDNA片段；將Tester cDNA分成均等的兩份，分別接上接頭1和接頭2，然后分別與過量的Driver cDNA變性后退火雜交，第一次雜交后每個樣本中有4種產(chǎn)物：單鏈的Tester cDNA，自身退火的Tester cDNA雙鏈，Tester和Driver的異源雙鏈，自身退火的Driver cDNA。②第二次差減雜交：合并兩份雜交產(chǎn)物，再加上新的變性的Driver單鏈，再次退火雜交，并產(chǎn)生一種新的雙鏈分子，它的兩個5'端有兩個不同的接頭，使其在以后的PCR中被有效地擴增。③第一次PCR：先用DNA聚合酶將cDNA鏈上的接頭上的粘性末端補齊，進行PCR擴增，這時只有兩端分別為接頭1和接頭2的差別表達的序列片段才能以指數(shù)形式擴增。④第二次PCR：取第一次PCR擴增產(chǎn)物稀釋后，進行巢式PCR，進一步擴增具有差別表達的序列。最后完成抑制性差文庫的構(gòu)建。

2 SSH技術(shù)在植物抗病基因研究中的應(yīng)用及其主要優(yōu)、缺點

2.1 SSH技術(shù)在植物抗病基因研究中的應(yīng)用

早些時候，SSH技術(shù)主要集中應(yīng)用在動物和人的研究上。盡管該方法在植物抗病基因上的研究起步較晚，但自1999年首次應(yīng)用該方法以來，也已有多篇有關(guān)該方法在植物抗病基因研究上應(yīng)用的報道[6～13]。如近2 a來，黃雪玲等以成株期抗條銹小麥品種興資9104為材料，依照CLONTECH公司PCR-SelectTM cDNASubtraction Kit方法構(gòu)建了小麥成株期條銹菌誘導(dǎo)的抑制差減雜交cDNA文庫。對文庫中隨機挑取的96個陽性克隆進行測序，對已知序列進行Blastx分析表明，所得基因主要涉及植物的信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、能量與代謝、蛋白質(zhì)合成與代謝、膜轉(zhuǎn)運、細胞生長分化等[14]。于秀梅等利用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建了條銹菌誘導(dǎo)的小麥葉片cDNA文庫。通過分析抗病相關(guān)基因，初步推測HR和SAR可能為小麥抗條銹病過程中的2種抗性形式。最后利用RT-PCR對4條基因進行分析，明確其在抗病過程中的表達模式[15]。張淑珍等研究利用抑制性消減雜交技術(shù)成功構(gòu)建了疫霉菌誘導(dǎo)的大豆抗病品種綏農(nóng)10差異表達的cDNA消減文庫，從文庫中共篩選到2 067個陽性克隆，利用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列相似性比對，獲得有功能的EST 375個，分析表明這些EST功能涉及大豆的抑制病原菌生長、細胞自身保護、信號傳導(dǎo)、系統(tǒng)獲得抗性、蛋白質(zhì)合成、呼吸作用等方面[16]。吳金華等通過小麥種質(zhì)N9436構(gòu)建了白粉菌接種初期小麥抗性種質(zhì)N9436的抑制性消減雜交文庫，得到94條EST，有49條EST與已知功能蛋白同源性較高，主要涉及抗病與防御（包括生物及非生物脅迫）、能量代謝、細胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)合成及加工、轉(zhuǎn)運及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程的相關(guān)蛋白[17]。

2.2 SSH技術(shù)的主要優(yōu)缺點

眾多的研究表明，該方法最大的優(yōu)點是降低了假陽性率。其次是具有高度敏感性、速度快、效率高等優(yōu)點。主要缺點首先是需要較多的原始材料，因為后續(xù)研究所需的起始mRNA量較大（一般為幾微克）。消減庫中的cDNA經(jīng)過RsaI等限制酶消化后，不再是全長cDNA，要想獲得全長序列就要用這些基因片段作為探針從cDNA文庫中篩選出全長基因；但SSH技術(shù)不能同時對數(shù)個材料之間進行比較，材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能有效被檢測。此外，對植物組織而言，應(yīng)盡量選擇幼嫩的組織作為研究對象，RNA的分離較動物組織困難，尤其是一些老的植物組織更不易分離出高質(zhì)量的mRNA。

3 SSH在辣椒抗病基因研究中的應(yīng)用

較之其他植物，辣椒這方面的研究較少。僅茆振川等以含N基因的辣椒為試驗材料，接種南方根結(jié)線蟲 12，24，36 h的根尖材料作為測驗方（Tester），相應(yīng)的未接種根尖材料作為驅(qū)動方（Driver），構(gòu)建了一個南方根結(jié)線蟲誘導(dǎo)N基因表達早期的正向抑制消減雜交cDNA文庫，并結(jié)合文庫高密度點陣膜雜交差異篩選，獲得了237條表達序列標(biāo)簽 （EST）。得到148條功能已知的EST序列，獲得已知的上調(diào)抗性相關(guān)EST 68個。分離出了具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)的抗線蟲蛋白和類LRR抗性蛋白的基因，防御作用相關(guān)的類萌芽素（GLP）、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因，抗性相關(guān)的WRKY、ERFBP等轉(zhuǎn)錄因子基因，以及G蛋白、14-3-3蛋白等多種信號蛋白基因[18]。以辣椒雙單倍體HDA149為試驗材料，構(gòu)建一個南方根結(jié)線蟲誘導(dǎo)Me3基因表達早期的抑制消減雜交cDNA文庫，通過高密度點陣膜雜交差異篩選，獲得了309條表達序列標(biāo)簽（EST）。通過測序，在Gen-Bank上進行BLAST分析，30個EST片段未發(fā)現(xiàn)同源性基因，229個為具有同源性的已知基因，其中71個為功能未知的基因[19]。

另外，本課題組正在利用抑制性消減雜交技術(shù)進行辣椒對白粉病抗性相關(guān)基因的篩選和鑒定研究。通過對供試材料進行接菌、不接菌對照處理，利用抑制性消減雜交技術(shù)研究辣椒在白粉菌脅迫下抗性相關(guān)基因的差異表達，結(jié)合生物信息學(xué)手段確定抗性候選基因，并對其進行分離、克隆和功能性研究，進一步闡述辣椒對白粉病的抗性機制，為培育抗辣椒白粉病新品種奠定基礎(chǔ)。

本課題組正在利用抑制性消減雜交技術(shù)進行辣椒對白粉病抗性相關(guān)基因進行篩選和鑒定，擬構(gòu)建辣椒在白粉菌脅迫下抑制性消減雜交文庫，研究辣椒在白粉菌脅迫下抗性相關(guān)基因的差異表達。

4 展望

辣椒因其營養(yǎng)豐富、味道鮮美而在世界各地廣泛種植，在我國各地均有栽培，并已成為農(nóng)民致富的重要經(jīng)濟作物之一。我國辣椒種植面積廣，但由于各地環(huán)境條件相差比較大，辣椒病害種類多且為害嚴重，已成為我國辣椒生產(chǎn)的主要障礙。長期以來，主要依賴化學(xué)藥劑和種植抗性品種來控制病害。但化學(xué)農(nóng)藥的濫用不僅加大了生產(chǎn)成本、給環(huán)境帶來污染，同時也加速了病原菌毒力的變化。而常規(guī)育種通常所需的時間很長及新育成的品種由于病原菌的群體毒性變化而喪失抗性。因此，嘗試結(jié)合功能基因組和生物信息學(xué)研究的方法和技術(shù)進行抗病相關(guān)基因的研究，深入研究植物的抗病性、病原菌的致病性以及植物與病原菌的相互關(guān)系，并探索其他可能的抗病途徑，才能從根本上解決植物病害問題，同時為抗病育種研究帶來新的啟示[20]。SSH技術(shù)正廣泛應(yīng)用于該領(lǐng)域，SSH技術(shù)的進一步改進和提高，將有助于該技術(shù)在植物基因的分離、克隆及抗病相關(guān)基因的表達調(diào)控等方面發(fā)揮更顯著的作用。

[1]田連福，郭新紅，姜孝成，等.抑制消減雜交技術(shù)（SSH）及其在植物基因克隆上的應(yīng)用[J].生物學(xué)雜志，2002，19（4）：29-30.

[2]李廣存，金黎平，謝開云，等.抑制差減雜交（SSH）技術(shù)及其在植物基因分離上的應(yīng)用[J].中國生物工程雜志，2004，24（9）：26-31.

[3]Diatchenko L,Lau Y F,Campbell A P,et al.Suppression subtractive hybridization:A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Acad Sci,1996,93:6 025-6 030.

[4]朱龍付.棉花遺傳多樣性研究及抗黃萎病相關(guān)基因的克隆與分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[5]王洪斌，王廣軍.辣椒主要病害的危害及防治措施[J].北方園藝，2006（6）：165-166.

[6]駱蒙，孔秀英，霍納新，等.小麥抗白粉侵染初期的表達序列標(biāo)簽分析[J].遺傳學(xué)報，2002，29（6）：525-530.

[7]田振東，柳俊，謝從華.利用抑制差減雜交技術(shù)分離馬鈴薯晚疫病抗性相關(guān)基因[J].遺傳學(xué)報，2003，30（7）：597-605.

[8]Tian Z D,Liu J,Xie C H,et al.Cloning of Photo POTHR-1 Gene and Its Expression in response to Infection by Phytophthora infestans and Other Abiotic Stimuli[J].Acta Botanica sinica,2003,45(8):959-965.

[9]劉春燕，王偉權(quán)，陳慶山，等.大豆花葉病毒誘導(dǎo)的消減文庫構(gòu)建及初步分析[J].生物工程學(xué)報，2005，21（2）：320-322.

[10]王力華，戴小楓，方宣均，等.大麗輪枝菌毒素誘導(dǎo)表達陸地棉cDNA序列的克隆與定位[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（10）：1 474-1 480.

[11]趙小蘭，蘇曉華，田傳衛(wèi)，等.根癌農(nóng)桿菌脅迫下多花薔薇（Rosa multiflora‘Inermis 4’）的基因表達分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（7）：1 425-1 430.

[12]Joseph A,Verica S N,Maximova M D,et al.Isolation of ESTs from cacao(Theobroma cacaoL.)leaves treated with inducers of the defense response[J].Plant Cell Rep,2004, 23:404-413.

[13]Hiroyuki T,Kazuhiro T,Gento T,et al.Identification of genes expressed during spore germination ofMycosphaerella pinodes[J].J Gen Plant Pathol,2005,71:190-195.

[14]黃雪玲，喻修道，屈志鵬，等.小麥成株抗條銹性抑制差減雜交文庫構(gòu)建及表達序列標(biāo)簽分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007，15（6）：976-981.

[15]于秀梅，喻修道，屈志鵬，等.條銹菌誘導(dǎo)的小麥抑制差減雜交文庫構(gòu)建及其表達序列標(biāo)簽研究[J].植物病理學(xué)報，2007，37（1）：50-55.

[16]張淑珍，徐鵬飛，吳俊江，等.大豆疫霉根腐病菌誘導(dǎo)下SSH文庫構(gòu)建及初步分析[J].大豆科學(xué)，2008，27（3）：543-545.

[17]吳金華，胡銀崗，張宏，等.小麥種質(zhì)N9436抗白粉病的特異基因表達譜分析[J].作物學(xué)報，2008，34（7）：1 143-1 152.

[18]茆振川，謝丙炎，楊宇紅，等.辣椒N基因介導(dǎo)抗根結(jié)線蟲作用早期表達基因的抑制性消減雜交SSH分析[J].園藝學(xué)報，2007，34（3）：629-636.

[19]茆振川，謝丙炎，楊宇紅，等.辣椒Me3基因介導(dǎo)抗根結(jié)線蟲相關(guān)基因的SSH分析[J].園藝學(xué)報，2007，34（6）：1 453-1 458.

[20]張志明，趙茂俊，馬永毅，等.抑制性消減雜交技術(shù)及其在玉米抗病基因研究中的應(yīng)用[J].玉米科學(xué)，2006，14（3）：42-48.

Application of SSH to Disease-resistance Gene Expression of Pepper

XIAO Zhongjiu1,LI Xiaoxia2,ZHANG Suqin1,JIANG Xuanli1
(1.Academy of Agriculture,Guizhou University,Guizhou 550025;2.Department of Biology,Zunyi Normal College)

The suppression subtractive hybridization (SSH)based on suppression PCR and subtractive technique,with the advantage of low false positives,high sensibility,high efficiency,and so on is widely used in the differential expression of plant gene.The principle,relative merits and demerits of SSH were reviewed.The application to the research of pepper disease-resistance mechanism was summarized.

Suppression subtractive hybridization(SSH);Plant disease-resistance;Pepper

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.12.001

貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合J字[2009]2104號）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合J字（2006）2052號）；遵義市科技計劃基金項目（遵市科合社字[2009]22號）；貴州大學(xué)人才科研基金：辣椒抗白粉病的分子細胞學(xué)研究

肖仲久（1980-），男，講師，在讀博士，主要從事植物免疫學(xué)及分子病理學(xué)研究，電話：13765047925。E-mail：xzj198099@163.com

蔣選利，通信作者。電話：13985471856

2008-12-24