嚴小莉 趙亞紅 趙微加 楊宇民

絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管的皮膚致敏實驗

嚴小莉 趙亞紅 趙微加 楊宇民

目的評價本實驗室自制的絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管對皮膚潛在的致敏性。方法以ISO 10993-10:1995標(biāo)準(zhǔn)，采用最大劑量法，將白化豚鼠分為SF-NGC組、陽性對照(甲醛溶液)、陰性對照(生理鹽水)3組，先進行預(yù)試驗確定主試驗各階段的濃度，然后進行主試驗。在激發(fā)階段的敷貼物去除后24 h、48 h、72 h，觀察記錄各組動物激發(fā)部位的皮膚情況，按標(biāo)準(zhǔn)進行評分，并算出致敏率。結(jié)果絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管的皮膚反應(yīng)記分為0，致敏率為0。結(jié)論在試驗條件下絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管無潛在的皮膚致敏性。

絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管生物相容性皮膚致敏試驗

蠶絲，是最早被利用的動物蛋白質(zhì)之一。由于具有良好的力學(xué)性能，其作為生物材料的應(yīng)用也具有悠久歷史，尤其是來自Bombyx mori蠶屬的蠶絲早在100多年前就被編織成手術(shù)縫線[1]。最近，蠶絲的核心蛋白——絲素，在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用正在被不斷開發(fā)，尤其是近年來廣泛地應(yīng)用于組織工程學(xué)方面的研究[2-3]。本實驗室成功自制了絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管，并對其生物相容性及其對大鼠坐骨神經(jīng)的修復(fù)功能進行了一系列研究[4-5]。本研究以ISO 10993-10:1995標(biāo)準(zhǔn)，對本實驗室自制的絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管的潛在致敏作用進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

弗氏完全佐劑（Sigma公司）；十二烷基硫酸鈉（AR，上海生化試劑有限公司）；多聚甲醛（AR，國藥集團試劑有限公司）；絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管（本實驗室自制）。

1.1.2 實驗動物

健康的初成年白化豚鼠，體重為300～500 g，雌雄不限，雌鼠為未產(chǎn)并無孕（南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場）。總數(shù)量為80只，其中14只用于確定皮內(nèi)誘導(dǎo)的濃度，21只用于確定局部誘導(dǎo)和局部激發(fā)的濃度，45只用于主試驗。

1.1.3 實驗分組

共3組，分別是SF-NGC(絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管)組、陽性對照組、陰性對照組。規(guī)格為：內(nèi)徑1.8 mm，外徑4 mm。陽性對照為甲醛溶液，陰性對照為生理鹽水。

1.1.4 材料浸提液的制備

絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管經(jīng)過121℃高壓滅菌20 min，將材料分別以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的標(biāo)準(zhǔn)浸入生理鹽水，在培養(yǎng)箱中(37±1)℃條件下靜置(72±0.5)h，制成高、中、低3種劑量的浸提液，并于12 h內(nèi)用于試驗。陽性對照：甲醛配制成濃度為6%、5%、4%（w/v）的水溶液。

1.2 方法

1.2.1 確定主試驗皮內(nèi)誘導(dǎo)階段的濃度

將SF-NGC以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的標(biāo)準(zhǔn)制浸提液，每種濃度的浸提液在動物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)成對進行皮內(nèi)注射，每點注射0.1 mL。每種濃度用2只豚鼠。6%、5%、4%（w/v）的甲醛水溶液3種濃度同法進行試驗。觀察各動物的局部及全身情況。主試驗皮內(nèi)誘導(dǎo)階段所選擇的最高濃度，以不導(dǎo)致皮膚大面積損傷及對動物產(chǎn)生其它有害作用為標(biāo)準(zhǔn)。2只動物皮內(nèi)注射生理鹽水作陰性對照。

1.2.2 確定主試驗局部誘導(dǎo)階段和局部激發(fā)階段的濃度

將SF-NGC以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的標(biāo)準(zhǔn)制浸提液，分別浸透濾紙片后貼敷于動物去毛的腹側(cè)部，用封閉式包扎帶包扎固定。每種濃度用3只豚鼠。24 h后除去包扎帶和濾紙片。6%、5%、4%（w/v）的甲醛水溶液3種濃度同法進行試驗。3只動物用生理鹽水同法進行試驗作為陰性對照。在可能的情況下，以可導(dǎo)致動物輕度紅斑，但不對動物產(chǎn)生其他有害作用的濃度為主試驗局部誘導(dǎo)階段的濃度。選擇不產(chǎn)生紅斑反應(yīng)的濃度為主試驗局部激發(fā)階段的濃度（表1）。

表1 各組在主試驗各階段的濃度

1.2.3 主試驗

第1天，提取白化豚鼠45只，分成3組，每組15只，開始適應(yīng)環(huán)境。第7天，在胸廓的背前區(qū)備皮4 cm×6 cm。

第8天，在每只動物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位成對皮內(nèi)注射0.1 mL。其中靠近頭部的2點注射弗氏完全佐劑與生理鹽水的等體積混合液；中間2點注射預(yù)試驗時表l確定的濃度的浸提液，陰性對照組則注射生理鹽水；靠近尾部的2點注射前2種注射液的等體積混合物。

局部誘導(dǎo)階段7 d的觀察發(fā)現(xiàn)，除陽性對照組外，其余各組均未產(chǎn)生刺激反應(yīng)。遂在局部誘導(dǎo)斑貼前(24±2)h(即第14天)，在未產(chǎn)生刺激反應(yīng)的豚鼠的試驗區(qū)用10%十二烷基硫酸鈉石蠟液預(yù)處理，按摩導(dǎo)入皮膚。第15天，各組分別用表1選定的濃度，將20 mm×40 mm濾紙浸透后貼敷于每只動物的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位誘導(dǎo)注射點。封閉式包扎帶包扎固定。(48±2)h后去除包扎帶和濾紙片。對照組動物使用溶劑同法操作。

第28天，動物的單側(cè)腹部用電動剃刀剃刮毛發(fā)4 cm×6 cm范圍。第29天，用表l選定的激發(fā)階段的濃度，浸透濾紙片，貼敷于每只豚鼠的單側(cè)腹部。封閉式包扎帶包扎固定。(24±2)h后去除包扎帶和濾紙片。

除去敷貼后24 h、48 h、72 h觀察試驗組和對照組動物激發(fā)部位的皮膚情況。按如下評分標(biāo)準(zhǔn)評價紅斑和水腫反應(yīng)程度：無紅斑：0分；極輕微紅斑：1分；紅斑清晰：2分；中度紅斑：3分；重度紅斑至輕微焦痂形成：4分。無水腫：0分；極輕微水腫：1分；水腫清晰：2分；中度水腫：3分；重度水腫：4分。

2 實驗結(jié)果

2.1 動物活體觀察

各組動物活動正常，飲食正常，敷料包扎固定良好，無移位。

SF-NGC組：各動物在去除敷料后24 h、48 h、72 h的觀察結(jié)果都是無紅斑、無水腫。

陽性對照組：各動物在去除敷料后24 h均為中度紅斑至輕度結(jié)痂形成，中度水腫；48 h為中度紅斑至輕度結(jié)痂形成，水腫清晰；72 h為中度紅斑至輕度結(jié)痂形成，極輕微水腫。

陰性對照組：各動物在去除敷料后24 h、48 h、72 h的觀察結(jié)果都是無紅斑、無水腫。

2.2 各組皮膚反應(yīng)記分結(jié)果

按ISO 10993—10:1995的皮膚反應(yīng)分類系統(tǒng)對各組皮膚反應(yīng)記分結(jié)果見表2。結(jié)果顯示陽性對照甲醛溶液的致敏率為100%，皮膚反應(yīng)平均記分為6，表明它具有致敏性。

SF-NGC組與陰性對照組的皮膚致敏反應(yīng)平均記分均為0，致敏率為0，表明本實驗室自制的絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管在試驗條件下對皮膚無潛在致敏性。

表2 各組皮膚致敏率和皮膚反應(yīng)記分

3 討論

當(dāng)外周神經(jīng)受到長距離損傷時，必須要有合適的橋接物連接兩斷端。從而使近端神經(jīng)沿著正確的方向生長，選擇合適的橋接物成為目前神經(jīng)科學(xué)及材料科學(xué)共同關(guān)注的焦點[6]。過去曾研究以自體或異體的組織作為橋接物，但存在很多困難，如供體缺乏、免疫排斥反應(yīng)等[7]。因此，尋找一種合適的人工組織材料作為橋接物成為目前神經(jīng)再生研究的關(guān)鍵之一。

絲素蛋白具有良好的生物力學(xué)性能；有一定的可降解性，且降解產(chǎn)物主要為游離氨基酸等[8]；與背根神經(jīng)節(jié)[9]及海馬神經(jīng)元[10]都有較好的生物相容性。因而，本實驗室構(gòu)建了絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管，用于神經(jīng)損傷修復(fù)的研究。

依據(jù)醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)，醫(yī)用材料需進行生物學(xué)評價，根據(jù)不同的臨床應(yīng)用，選擇不同的生物相容性試驗。皮膚致敏試驗是絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管必須要進行的生物學(xué)評價之一。采用豚鼠測試皮膚致敏的方法有多種，最常用的兩種方法是最大劑量法（Magnusson&Kligman）和封閉斑貼法（Buehler），只需采用其中一種方法即可。最大劑量法為最敏感和首選的方法。本試驗以ISO 10993-10:1995標(biāo)準(zhǔn)，采用最大劑量法。評估得出：絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管在試驗條件下無潛在致敏性。當(dāng)然，動物實驗對于材料的致敏性檢測只是初步的評價，確切的結(jié)論還需結(jié)合人體的臨床應(yīng)用情況。

[1]Postlethwait RW.Long-term comparative study of nonabsorbable sutures[J].Ann Surg,1970,171:892-898.

[2]Altman GH,Horan RL,Lu HH,et al.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments[J].Biomaterials,2002,23(20):4131-4141.

[3]Altman GH,Diaz F,Jakuba C,et al.Silk-based biomaterials[J]. Biomaterials,2003,24(3):401-416.

[4]Chen X,Yang Y,Wu J,et al.Biocompatibility studies of silk fibroin -based artificial nerve grafts in vitro and in vivo[J].Prog Nat Sci, 2007,17(9):1029-1034.

[5]Yang Y,Ding F,Wu J,et al.Development and evaluation of silk fibroin-based nerve grafts used for peripheral nerve regeneration [J].Biomaterials,2007,28(26):5526-5535.

[6]Ichihara S,Inada Y,Nakamura T.Artificial nerve tubes and their application for repair of peripheral nerve injury:an update of current concepts[J].Injury,2008,4:29-39.

[7]Ciardelli G,Chiono V.Materials for peripheral nerve regeneration [J].Macromol Biosci,2006,6(1):13-26.

[8]Wang Y,Kim HJ,Vunjak-Novakovic G,et.al.Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials[J].Biomaterials,2006,27 (36):6064-6082.

[9]陳雪梅,楊宇民,王鴻逵,等.絲素纖維與背根神經(jīng)節(jié)體外生物相容性初步研究[J].交通醫(yī)學(xué),2006,20(5):489-491.

[10]湯欣,楊宇民,丁斐,等.絲素纖維與海馬神經(jīng)元的生物相容性細胞培養(yǎng)研究[J].交通醫(yī)學(xué),2006,20(5):491-493.

Skin Sensitization Test of Silk Fibroin-based Nerve Guidance Conduit

YAN Xiaoli,ZHAO Yahong,ZHAO Weijia, YANG Yumin.
Jiangsu Key Laboratory of neuroregeneration,Nantong University,Nangtong 226001,China.

ObjectiveTo study the sensitization of silk fibroin-based nerve guidance conduits（SF-NGCs）in vitro. MethodsAccording to ISO 10993－10:1995 standard,maximization test was conducted in guinea pig.The skin sensitization reactions,including erythema and oedema,induced by SF-NGCs,normal saline and formalin solution were observed and scored respectively at 24,48 and 72 h exposure of the infusion of the materials.The allergenic rates and mean response score were calculated.ResultsThe allergenic rates and score of skin reaction of SF-NGC was 0/15 and 0,those of norm al saline 0/15 and 0.The group of normal saline was 0/15 and 0,but the group of formalin solution was 15/15 and 5. ConclusionSF-NGC is safe without skin sensitization.

Silk Fibroin-based Nerve Guidance Conduit;Biocompatibility;Skin Sensitization Test

R392-33

A

1673－0364（2009）－01－0029－03

2008年11月30日；

2009年2月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.008

國家自然科學(xué)基金（30770585），國家教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持”項目（NCET-07-0466），江蘇省高校自然科學(xué)重大基礎(chǔ)研究項目（07KJA31025）。

226001江蘇省南通市南通大學(xué)神經(jīng)再生重點實驗室。

楊宇民。