王 磊 李曉林

卵巢切除對(duì)大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)骨折后軟骨愈合的影響

王 磊 李曉林

目的探討骨質(zhì)疏松對(duì)大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)骨折后軟骨愈合的影響。方法16只4.5月齡的雌性SD大鼠分為兩組，實(shí)驗(yàn)組行雙側(cè)卵巢切除，對(duì)照組施行假手術(shù)。10周后，經(jīng)手術(shù)制造右脛骨平臺(tái)內(nèi)髁劈裂骨折，克氏針交叉內(nèi)固定。術(shù)后大鼠自由活動(dòng)，6周后全部處死，標(biāo)本行大體和組織學(xué)觀察。結(jié)果所有標(biāo)本骨折均愈合。實(shí)驗(yàn)組脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨多不平整伴輕度塌陷，軟骨裂隙依稀可辨，色澤稍暗；對(duì)照組內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨多平整光滑，軟骨裂隙消失。HE染色光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨裂隙處可見(jiàn)較多纖維組織，透明樣軟骨呈島狀散在分布于關(guān)節(jié)表面；對(duì)照組多為透明樣軟骨，細(xì)胞排列較規(guī)則，但未見(jiàn)明顯分層及潮線。結(jié)論卵巢切除導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)疏松，延緩了關(guān)節(jié)內(nèi)骨折后軟骨愈合的進(jìn)程，且軟骨愈合質(zhì)量較差。

骨質(zhì)疏松骨軟骨骨折卵巢切除術(shù)

隨著社會(huì)人口的日趨老齡化，臨床上合并骨質(zhì)疏松的關(guān)節(jié)內(nèi)骨折病例也日益增多，其治療較為棘手。近年來(lái)的研究提示，絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平低下，在發(fā)生骨質(zhì)疏松的同時(shí)，其關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨易發(fā)生退變。然而，對(duì)于骨質(zhì)疏松同時(shí)伴發(fā)關(guān)節(jié)內(nèi)骨折的愈合過(guò)程，相關(guān)研究報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)將大鼠雙側(cè)卵巢切除后，建立脛骨平臺(tái)骨折模型，初步探討骨質(zhì)疏松癥對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)骨折后軟骨愈合過(guò)程的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

選用4.5月齡，體重280～310 g雌性SD大鼠共16只（上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），其中實(shí)驗(yàn)組（8只）行雙側(cè)卵巢切除，10周后經(jīng)雙能X線骨密度儀（HOLOGIC，QDR－4000）測(cè)量，證實(shí)實(shí)驗(yàn)組已發(fā)生骨質(zhì)疏松。此時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均行右膝下髕旁內(nèi)側(cè)切口，并顯露脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)髁，于其內(nèi)外1/2處的關(guān)節(jié)軟骨下方1 cm范圍用直徑0.6 mm克氏針作郵票打孔，鉆透前后骨皮質(zhì)，11號(hào)尖刀片銳性切割軟骨面并貫通軟骨下孔洞，造成外側(cè)皮質(zhì)連續(xù)的脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)髁垂直劈裂骨折，骨折間隙約1～2 mm，隨后在距關(guān)節(jié)面下0.5 mm處用兩根直徑0.8 mm克氏針由內(nèi)向外作平行關(guān)節(jié)面的交叉內(nèi)固定，尾端折彎埋于皮下（圖1）。大鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)，術(shù)前30 min起，肌注青霉素鈉鹽（每公斤體重注射15萬(wàn)單位），連續(xù)3 d，術(shù)后自由活動(dòng)。

1.2 觀察指標(biāo)

所有大鼠于造模6周后腹腔過(guò)量注射氯氨酮致死，將右脛骨平臺(tái)取出后行大體觀察。小心取出克氏針，標(biāo)本用4%的多聚甲醛溶液（pH 7.4）固定24 h，10%EDTA溶液脫鈣2～3周，石蠟包埋，冠狀面切片，HE染色觀察。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

所有大鼠均未出現(xiàn)傷口感染，6周后順利取材。膝關(guān)節(jié)離斷時(shí)觀察到關(guān)節(jié)內(nèi)有不同程度粘連，標(biāo)本取出后發(fā)現(xiàn)脛骨平臺(tái)軟骨及軟骨下骨骨折均已愈合。

實(shí)驗(yàn)組脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨輕度塌陷，關(guān)節(jié)面呈彈格子路樣坑坑洼洼，多不平整且色澤蒼白，軟骨裂隙依稀可辨（圖2）；相比之下，對(duì)照組關(guān)節(jié)面多平整光滑無(wú)塌陷，色澤較光亮，軟骨裂隙消失（圖3）。

圖1 大鼠脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)骨折的動(dòng)物模型

圖2 實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)面高低不平，蒼白有裂隙

圖3 對(duì)照組關(guān)節(jié)面平整光滑，且光亮

2.2 組織學(xué)觀察

石蠟切片HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨裂隙處可見(jiàn)數(shù)個(gè)團(tuán)簇狀軟骨樣組織充填，與周?chē)＼浌墙M織不連接，其中軟骨細(xì)胞數(shù)量少且呈不規(guī)則聚集排列，其間有少量纖維組織間隔，關(guān)節(jié)表面多見(jiàn)軟骨剝脫，軟骨下骨板構(gòu)建延緩（圖4）。對(duì)照組多見(jiàn)透明樣軟骨形成，平整移行于軟骨裂隙邊緣，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多且排列較規(guī)則，但未出現(xiàn)明顯分層，潮線消失，關(guān)節(jié)表面未見(jiàn)軟骨剝脫，軟骨下原始骨小梁形成較多（圖5）。

圖4 實(shí)驗(yàn)組軟骨樣組織團(tuán)簇樣排列，軟骨細(xì)胞少（HE，100×）

圖5 對(duì)照組透明樣軟骨形成，軟骨細(xì)胞多且排列規(guī)則（HE，40×）

3 討論

3.1 雌激素缺乏影響關(guān)節(jié)內(nèi)骨折修復(fù)的動(dòng)物模型的建立

臨床常見(jiàn)的關(guān)節(jié)內(nèi)骨折多累及軟骨下骨，即骨軟骨骨折，其修復(fù)過(guò)程和局限于關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的單純軟骨損傷修復(fù)截然不同。由于骨折穿透軟骨下骨，導(dǎo)致出血，纖維蛋白凝塊充填骨折端，局部產(chǎn)生的炎性反應(yīng)使骨髓中的間充質(zhì)細(xì)胞趨化聚集，并在周?chē)鞣N生長(zhǎng)因子和局部微環(huán)境的作用下，特定地向成骨或成軟骨分化，最終形成骨和軟骨組織。而影響該過(guò)程的因素較多，包括骨折個(gè)體本身的年齡大小、損傷過(guò)程的機(jī)械刺激和修復(fù)的應(yīng)力環(huán)境、損傷區(qū)域的范圍和大小及內(nèi)固定的穩(wěn)定性等。

成年大鼠雙側(cè)卵巢切除已被作為經(jīng)典的雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，脛骨近端更是研究骨質(zhì)疏松的代表部位，而位于脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)中點(diǎn)的關(guān)節(jié)內(nèi)骨折能較好地模擬臨床骨折修復(fù)的應(yīng)力刺激。Shapiro等[1]在兔的股骨關(guān)節(jié)面上鉆孔，深達(dá)軟骨下骨，認(rèn)為直徑3 mm的鉆孔，可以被新生透明軟骨修復(fù)，而大于此直徑的則不能自然修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用郵票打洞后手術(shù)刀片銳性切割造模，骨折間隙小于3 mm，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，6周后也可觀察到新生的透明樣軟骨形成。

Mitchell等[2]在成年兔股骨內(nèi)髁制造關(guān)節(jié)內(nèi)骨折，分別用拉力螺釘給予骨折塊間不同的加壓固定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)軟骨間隙在加壓穩(wěn)定的條件下，修復(fù)組織為透明軟骨，未加壓則導(dǎo)致纖維軟骨的形成。Plaga等[3]在兔的股骨內(nèi)髁前方制造關(guān)節(jié)內(nèi)剪切樣骨折，采用克氏針交叉固定后6周，發(fā)現(xiàn)骨折塊固定穩(wěn)定，骨折愈合，移位均小于1 mm。本實(shí)驗(yàn)在制作脛骨平臺(tái)骨折時(shí)，骨折塊之間尚留有完好的內(nèi)側(cè)皮質(zhì)連接支撐，兼用交叉克氏針做內(nèi)固定，提供了較好的內(nèi)固定穩(wěn)定性，因此能在對(duì)照組觀察到了正常的軟骨修復(fù)過(guò)程。

綜合考慮上述各因素，本課題組認(rèn)為，大鼠雙側(cè)卵巢切除后的脛骨平臺(tái)骨折操作簡(jiǎn)便，骨軟骨修復(fù)過(guò)程穩(wěn)定可靠，可以用來(lái)研究雌激素缺乏對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)骨折愈合過(guò)程的影響。

3.2 雌激素缺乏對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)骨折軟骨愈合的影響

Genesan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)卵巢切除大鼠使用雌激素后，可以有效緩解關(guān)節(jié)軟骨的膠原降解。高峰等[5]分別對(duì)卵巢切除大鼠使用雌激素及雌激素受體調(diào)節(jié)劑，也發(fā)現(xiàn)尿中CTX-Ⅱ的代謝峰顯著降低，同時(shí)關(guān)節(jié)軟骨面的病損程度明顯好轉(zhuǎn)。上述研究均表明，雌激素水平影響著關(guān)節(jié)軟骨的代謝。Oshima等[6]對(duì)不同周齡、性別以及去勢(shì)大鼠的髖關(guān)節(jié)軟骨做免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)雌激素受體（Estrogen receptor，ER）表達(dá)于成年大鼠關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨中，且均分布在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的胞漿和胞核中，提示了雌激素可以直接通過(guò)其受體介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的代謝。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，雄性幼年及老齡大鼠的ER表達(dá)水平無(wú)明顯差異，但卵巢切除大鼠ER兩種亞型（ER-α和ER-β）表達(dá)以及老年雌性大鼠的ER-α表達(dá)水平均有下降，提示了雌激素水平的降低也會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中ER數(shù)量和功能的改變，從而進(jìn)一步影響軟骨的代謝。

關(guān)節(jié)軟骨全層骨折的修復(fù)過(guò)程主要由骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在局部募集，通過(guò)各種因子誘導(dǎo)分化最終形成軟骨細(xì)胞而完成。這些因子包括離子，低分子量復(fù)合物如類(lèi)固醇激素，多肽激素，以及蛋白等，其中部分是由軟骨外組織傳遞（旁分泌作用），但許多是由軟骨細(xì)胞自分泌并起介導(dǎo)作用。Wang等[7]取成年雌性大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞做體外培養(yǎng)，運(yùn)用免疫組花和RT-PCR觀察ER-α的數(shù)量和分布，發(fā)現(xiàn)在胞核內(nèi)出現(xiàn)一過(guò)性的波峰樣表達(dá)，認(rèn)為雌激素可能在調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化階段起一定的介導(dǎo)作用。此外，Takeuchi等[8]在軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中，檢測(cè)到作為性類(lèi)固醇激素前體的mRNA表達(dá)，提示了軟骨細(xì)胞還可能通過(guò)自分泌介導(dǎo)激素類(lèi)因子的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，卵巢切除大鼠的關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨愈合延緩，提示了雌激素缺乏延緩了關(guān)節(jié)內(nèi)骨折愈合過(guò)程，而形成的軟骨樣組織外觀高低不平且色澤蒼白，鏡下顯示軟骨細(xì)胞無(wú)規(guī)則排列，軟骨外基質(zhì)雜亂，提示了關(guān)節(jié)內(nèi)骨折的愈合質(zhì)量明顯降低，其內(nèi)在的調(diào)控機(jī)理尚有待進(jìn)一步深入探討。

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Histological Observation on the Healing of Osteochondral Fracture in Ovariectomized Rats

WANG Lei,LI Xiaoling.
Department of Orthopaedic Surgery,Shanghai Sixth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200233,China.

ObjectiveTo explore the healing process of osteochondral fracture in ovariectomized rats.MethodsSixteen female SD rats with a mean age of 4.5 months were involved in the study,eight of which underwent bilateral ovariectomy (OVX),while the others underwent sham operation(SHAM).Ten weeks later when the osteoporosis was confirmed,all the rats were suffered tibial plateau fracture(SchatzkerⅣ)in right hind limb and fixed with two Kirschner wires in the same time. The rats were sacrificed on 6 weeks after fracture,and the fractured tibial plateaus were taken for gross and histological observation.ResultsAll the fractures healed completely.The cartilage in medial side of tibial plateau in OVX rats was uneven and collapsed,and fracture line was obscure.On histological observation,there were fibrous tissue with scattered hyaline-like cartilage inside.In SHAM rats,the cartilage was congruity and smoothly,fracture line was almost disappeared. There was hyaline-like cartilage instead,with chondrocytes aligned regularly but no tidemark appeared.ConclusionIn ovariectomized rats,the process of the osteochondral fracture healing was delayed because of osteoporosis.

Osteoporosis;Osteochondral fracture;Ovariectomy

R711.75

A

1673－0364（2009）－01－0035－03

2008年12月25日；

2009年1月21日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.010

200233上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院骨科。