鄭江紅 鄧辰亮 丁 志 茅廣宇 楊松林

轉(zhuǎn)染NF-1基因?qū)θ嗽錾择：鄢衫w維細(xì)胞膠原表達(dá)的影響

鄭江紅 鄧辰亮 丁 志 茅廣宇 楊松林

目的探討重組NF1基因轉(zhuǎn)染人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的可行性，以及轉(zhuǎn)染NF1基因?qū)?xì)胞增殖速率和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的影響。方法體外重組NF1基因，借助真核表達(dá)載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察報(bào)告基因表達(dá)，并確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用Real time PCR法比較轉(zhuǎn)染前后NF1 mRNA及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)；采用CCK-8比色法，比較轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖狀況。結(jié)果基因轉(zhuǎn)染后，約50%的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)綠色熒光；NF1 mRNA在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)分別為：7.27±1.16，2.01±0.38，1.87±0.29，轉(zhuǎn)染組NF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組明顯增高（P＜0.01，n＝5）；Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)分別為：3.01±0.48和2.05±0.25，0.89±0.18和0.94±0.16，0.99±0.11和0.92±0.19；轉(zhuǎn)染組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組均明顯增高（P＜0.01，n＝5）。結(jié)論瘢痕成纖維細(xì)胞可作為NF1轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，NF1基因可能是導(dǎo)致瘢痕異常增生的重要基因。

細(xì)胞核因子1轉(zhuǎn)染增生性瘢痕成纖維細(xì)胞

增生性瘢痕的病理表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及長(zhǎng)時(shí)間的膠原過(guò)量合成。細(xì)胞核因子1（Nuclear factor-1，NF1）作為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控增生性瘢痕細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的過(guò)程中扮演著關(guān)鍵的角色[1-2]。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕組織中NF1的表達(dá)明顯高于正常真皮成纖維細(xì)胞[3]。為進(jìn)一步研究NF1基因在增生性瘢痕細(xì)胞中的作用，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)轉(zhuǎn)染NF1基因進(jìn)入人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，探討NF1轉(zhuǎn)染瘢痕成纖維細(xì)胞的可行性和轉(zhuǎn)染NF1基因?qū)?xì)胞增殖速率以及Ⅰ、Ⅲ型膠原合成造成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Top 10，高效真核表達(dá)載體pcDNA 3.0（Invitrogen公司，美國(guó)）；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司，美國(guó))；胎牛血清(Hyclone公司，美國(guó))；膠原酶NB 4(Serva公司，德國(guó))；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國(guó))；PCR引物由上海生物工程公司合成；TRIzol RNA抽提試劑盒(GibcoBRL)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒、SYBPremix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)；GeneRulerTM1 kb DNA Ladder(Fermentas，立陶宛)；激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國(guó))；ABI 7300 Real time PCR擴(kuò)增儀(ABI，美國(guó))；GIS 22800型凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 NF1真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

目的基因NF1 cDNA片段由RT-PCR方法獲取。PCR擴(kuò)增引物Full length-F:5′AGCAGGCAGCAGAGTGTGG3′，F(xiàn)ull length-R:5′TGGAAGGGAAAGCCGGAAC3′；PCR條件為：模板2 μL，PCR緩沖液5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，dNT 4 μL，H2O 36 μL。94℃(4 min)經(jīng)94℃(30 s)68℃(2.5 min)35個(gè)循環(huán)后，68℃延伸10 min。產(chǎn)物長(zhǎng)度為3 123 bp。PCR純化產(chǎn)物裝入克隆載體PMD 18-T，大腸桿菌Top 10在LB固體培養(yǎng)皿上涂片培養(yǎng)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑取單個(gè)白色菌落在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增。用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切TA載體回收目的片段，表達(dá)載體pcDNA 3.0用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切回收線性載體，兩者用T4連接酶連接構(gòu)建pcDNA-NF1，經(jīng)酶切電泳鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

增生性瘢痕標(biāo)本來(lái)源于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院門診患者。無(wú)菌條件下切取標(biāo)本，以0.5%氯霉素沖洗標(biāo)本并浸泡10 min，將標(biāo)本剪碎至1～2 mm3大小，0.3%NB 4復(fù)合膠原酶，37°C搖床消化3 h，150目濾網(wǎng)收集過(guò)濾液，1 500 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，按2×104cells/cm2接種于培養(yǎng)皿，24 h后首次換液。準(zhǔn)備傳代，轉(zhuǎn)染。分組：未轉(zhuǎn)染正常組、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA 3.0組和pcDNA 3.0-NF1轉(zhuǎn)染組。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h，按2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至30%～45%融合時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。方法：取無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液240 μL與10 μL Lipofectamine 2000混勻，另取240 μL DMEM培養(yǎng)液與10 μL（100 pmol）質(zhì)?；靹颍? min后分別合并脂質(zhì)體和質(zhì)粒兩液，室溫下放置20 min。吸掉培養(yǎng)液，以每孔1.5 mL添加純DMEM培養(yǎng)基，再加入脂質(zhì)體質(zhì)粒液，37℃培養(yǎng)5 h后，棄轉(zhuǎn)染液，換10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.4 Real time PCR檢測(cè)

分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的未轉(zhuǎn)染正常組細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA 3.0和NF1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量后，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）：取總RNA 1 μg，oligo dT 1 μL（0.5 μg），補(bǔ)足DEPC處理的ddH2O至13 μL，65℃變性5 min，立即置冰浴，再加RNase抑制劑20 U，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，5倍逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U 2μL，總體積20 μL。反應(yīng)程序：25℃反應(yīng)15 min，37℃反應(yīng)1 h，95℃反應(yīng)5 min，終止反應(yīng)后，RT產(chǎn)物行Real time PCR法檢測(cè)NOS、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)。根據(jù)人NF1基因、Ⅰ、Ⅲ型膠原基因序列，設(shè)計(jì)上、下游引物序列為：NF1-F 5′TTCACAGACTGGCGTGGTCT 3′，NF1-R 5′GAGGT-GTACCCTGTCATGAT 3′；Collagen I-F 5′GAACGCG-TGTCATCCCTTGT 3′，Collagen I-R 5′GAACGAG-GTAGTCTTTCAGCAACA 3′；CollagenⅢ-F 5′AA-CACGCAAGGCTGTGAGACT 3′，CollagenⅢ-R 5′GCCAACGTCCACACCAAATT 3′。RT產(chǎn)物稀釋10倍后取1 μL作為模板，加入2倍SYBPremix Ex TaqTM12.5 μL，上游引物、下游引物(10 pmol)各1 μL，ddH2O補(bǔ)足體積到25 μL。反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃變性15 min后，95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 細(xì)胞增殖檢測(cè)

以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為例，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，收集、接種于96孔板中（2 000個(gè)/孔），加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，酶標(biāo)儀測(cè)A450吸光度，每組重復(fù)3次，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 NF1基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

利用RT-PCR成功擴(kuò)增了NF1基因全長(zhǎng)，約3.1 kb(圖1)。載體在2%瓊脂糖凝膠中可見(jiàn)約8.5 kb DNA帶，與預(yù)期質(zhì)粒大小結(jié)果相一致，用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切電泳，在同一泳道中出現(xiàn)2條DNA帶，1條為5.4 kb，與空質(zhì)粒DNA鏈長(zhǎng)度一致，確定為質(zhì)粒DNA帶；另1條約3.1 kb，與NF1 cDNA片段大小一致（圖1）?；驕y(cè)序后，證實(shí)所合成基因序列與基因庫(kù)中一致率為99.95%。

圖1 NF1克隆基因PCR產(chǎn)物及重組pcDNA 3.0-NF1質(zhì)粒酶切電泳分析

2.2 瘢痕細(xì)胞NF1轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白報(bào)告基因的觀察

瘢痕細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，在細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)，瘢痕細(xì)胞被轉(zhuǎn)染48 h后，約50%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（圖2）。

圖2 綠色熒光蛋白報(bào)告基因的觀察示瘢痕細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，在細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)

圖3 NF1 mRNA在各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 Real time PCR檢測(cè)NF1 mRNA表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h后，Real time PCR檢測(cè)到NF1 mRNA在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)分別為：7.27±0.93、2.01±0.22和1.87±0.21，轉(zhuǎn)染組NF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組明顯增高（P＜0.01，n＝5）而未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，n＝5，圖3）。

2.4 NF1轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞增殖的影響

NF1基因轉(zhuǎn)染后，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖與未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

2.5 NF1轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響

Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)分別為：3.01±0.37和2.05±0.28，0.89±0.17和0.94±0.18，0.99±0.14和0.92±0.16。轉(zhuǎn)染組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組均明顯增高（P＜0.01，n＝5，圖5）。

圖4 CCK-8比色法測(cè)生長(zhǎng)曲線

圖5 Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

目前關(guān)于增生性瘢痕的病因及發(fā)病機(jī)制，尚未被完全闡明。已有研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕組織中的膠原及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的代謝異常，是增生性瘢痕形成的重要原因之一，并且NF1在其中起重要作用[4-5]。NF1是保持組織特異性基因正確表達(dá)的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，其特異結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)GC盒，激活增殖、凋亡、分化等有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[6－7]。在增生性瘢痕的局部組織中，NF1合成量增多，這提示NF1可能與瘢痕組織中ECM過(guò)量沉積有關(guān)[7]。因此，我們?cè)谘芯恐兄苯右择：鄢衫w維細(xì)胞為研究對(duì)象。為了進(jìn)一步研究了解NF1在導(dǎo)致病理性瘢痕組織中細(xì)胞外基質(zhì)增多中的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了先構(gòu)建NF1基因再進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的研究方案，并采用廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)載體，該方法保證了研究結(jié)果的可靠性。

重組的NF1基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染的NF1轉(zhuǎn)錄因子是否在成纖維細(xì)胞中有效表達(dá)，是判斷NF1基因轉(zhuǎn)染成功與否的關(guān)鍵。我們采用激光共聚焦顯微鏡觀察和相對(duì)精確的Real time PCR方法相結(jié)合[8－9]，發(fā)現(xiàn)了部分瘢痕成纖維細(xì)胞表達(dá)綠色熒光報(bào)告基因，而且轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞NF1 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照細(xì)胞。這些結(jié)果提示，NF1基因已被成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)并且開(kāi)始表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞被導(dǎo)入NF1基因后，細(xì)胞內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA合成增加。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成份，在增生性瘢痕組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，Ⅰ型膠原纖維占主要構(gòu)成，由2條α1鏈和1條α2鏈按比例構(gòu)成。Zhang等[10]在研究中發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕組織內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA比正常組織表達(dá)增強(qiáng)，表達(dá)增強(qiáng)的部位主要存在于真皮淺層的纖維結(jié)節(jié)。通過(guò)我們的結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)染NF1基因后，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞比未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)瘢痕特征更加強(qiáng)烈，表明NF1表達(dá)增強(qiáng)可導(dǎo)致瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)加強(qiáng)，進(jìn)而提示我們，控制NF1的過(guò)度表達(dá)有可能控制瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)，進(jìn)而控制瘢痕組織中ECM過(guò)量沉積。

綜上所述，我們已經(jīng)證實(shí)瘢痕成纖維細(xì)胞可作為NF1轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞。但是，通過(guò)抑制NF1基因來(lái)治療瘢痕異常增生的臨床應(yīng)用，還有待進(jìn)一步研究。

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Effects on Recombinant NF1 Gene on Collagen Expression of Hypertrophic Scar ifbroblasts In Vitro

ZHENG Jianghong,DENG Chenliang,DING Zhi,MAO Guangyu.YANG Songlin.
Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.Corresponding author:YANG Songlin.

ObjectiveTo explore the feasibility of transfecting recombinant NF1 into hypertrophic scar fibroblasts and investigate the proliferation and collagenⅠ,Ⅲsynthesis of transfected cells.MethodsRecombinant human NF1 gene was transfected into hypertrophic scar fibroblasts with the karyocyte expressive vector.The expression of NF1 gene,collagenⅠ,ⅢmRNA was quantified by real time PCR.The changes of cell proliferation were observed with CCK-8 colorimeter.Results Transfected hypertrophic scar fibroblasts showed positive green fluorescence nearly in 50%.The relative expression of NF1 mRNA in transfected cells,empty-vector cell and untransfected cells group are 7.27±1.16,2.01±0.38 and 1.87±0.29 respectively.Expression of NF1 mRNA increased significantly in transfected cells compared compared with either untransfected and empty-vector group(P＜0.01,n＝5).Expression of collagenⅠ,ⅢmRNA in transfected cells,empty-vector cell or untransfected cells group are 3.01±0.48,2.05±0.25;0.89±0.18,0.94±0.16;0.99±0.11,0.92±0.19 respectively, Expression of collagenⅠ,ⅢmRNA both increased significantly in transfected cells compared with either untransfected or empty-vector group(P＜0.01,n＝5).ConclusionThe hypertrophic scar fibroblasts seems to be the target cells of NF1 gene transfer.NF1 gene may be a critical factor,which caused abnormal collagen metabolism in hypertrophic scar.

Nuclear factor-1(NF1);Transfection;Hypertrphic scar;Fibroblast

Q753

A

1673－0364（2009）－01－0021－04

2008年11月19日；

2009年1月6日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.006

國(guó)家自然科學(xué)基金（30571929）；上海市衛(wèi)生局資助課題（2006055）。

200233上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院整形外科。

楊松林。