郭志強　劉紅耀　張華屏　邢　濤

[摘要] 目的 觀察姜黃素對膀胱腫瘤T24細胞中胰島素樣生長因子-1（IGF-1）表達的影響。方法 用不同濃度的姜黃素作用于膀胱腫瘤細胞株T24，用MTT法測定細胞抑制率，用流式細胞儀測定細胞凋亡結果，用RT-PCR測定不同姜黃素濃度對腫瘤細胞株胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R）mRNA表達量的影響。結果 姜黃素對膀胱腫瘤細胞株的作用具有時間和劑量依從性，姜黃素能夠誘導膀胱腫瘤細胞株凋亡，姜黃素可使腫瘤細胞株的IGF-1 mRNA表達量降低。結論 姜黃素可能會通過胰島素樣生長因子-1（IGF-1）通路抑制膀胱腫瘤T24細胞的生長，促進其凋亡。

[關鍵詞] 膀胱腫瘤； 姜黃素； 胰島素樣生長因子-1（IGF-1）

[中圖分類號] R737.14 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2009）13-36-02

The Effect of Curcumin on Insulin-like Growth Factor-1 Action in T24 Human Bladder Tumor Cells

GUO Zhiqiang1 LIU Hongyao1 ZHANG Huaping2 XING Tao1

1.The First Hospital of Shanxi Medical University；2.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001

[Abstract] ObjectiveTo observe the effect of curcumin on insulin-like growth factor-1 action in T24 human bladder tumor cells. MethodsThe bladder tumor cell lines were administered differ concentration of curcumin. The rate of cell inhibition，the rate of apoptosis and express of IGF-1and IGF-1R mRNA were determined with MTT，flow cytometer and RT-PCR，respectively. ResultsEither the rate of cell inhibition or the rates of apoptosis depend on the curcumin dose and the action time of curcumin. The quantity IGF-1 mRNA was reduced when the curcumin doses increased. ConclusionThe curcumin can depress the growth and enhance the apoptosis on insulin-like growth factor-1 action in T24 human bladder tumor cells.

[Key Words]Bladder neoplasm； Curcumin； Insulin-like growth factor-1

胰島素樣生長因子家族（Insulin-like Growth Factor，IGFs）是一類具有促進細胞增殖、分化以及血管形成等多種生物活性的多肽生長因子，IGF-1及其IGF-1R是該家族的重要成員，兩者與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。姜黃素（Curcumin）是從姜科植物中提取的一種酚性色素，在其他腫瘤治療性研究中表明，與以往化學治療藥物較單一的作用途徑相比，它具有抗氧化、抗突變、抗促癌和抗炎癥等多方面的作用。但有關姜黃素的機制方面，特別是對膀胱腫瘤IGF-1通路影響的研究鮮有報道。本文初步探討了姜黃素在膀胱腫瘤中對IGF-1通路的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 膀胱癌細胞株T24人膀胱移形細胞癌細胞，購自中國科學院上海細胞生化所。

1.1.2 實驗設備及儀器 超凈工作臺，蘇州市漢達工業(yè)自動化有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，Asheville NC USA；倒置顯微鏡，奧特光學；酶標定量儀，BIO-RAD NOVAPATH MICROPLATE READER；流式細胞儀，BD FACSCalibur；低速離心機，北京市醫(yī)用離心機廠；培養(yǎng)板（96孔，24孔，6孔），Costar公司。

1.1.3 藥物 小牛血清、RPMI 1640液，Gibco公司；噻唑藍，上?；瘜W試劑廠；二甲基亞楓（DMSO），上?；瘜W試劑廠；姜黃素，Sigma公司；重組人IGF-1，Peprotech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) T24細胞置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%Co₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液一次。細胞傳代時，先棄去培養(yǎng)液，PBS洗兩次，加入適量的0.25%胰蛋白酶消化并制成單細胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶中，并加入適量培養(yǎng)液。均取對數(shù)生長期中狀態(tài)良好的細胞用于試驗。

1.2.2 MTT比色法分析細胞活力 取對數(shù)生長期中狀態(tài)良好的T24細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，調整細胞濃度為5×104/mL，以每孔100μl（5000個/孔）接種于96孔板，培養(yǎng)24h貼壁后加入含有不同濃度的姜黃素和IGF-1的培養(yǎng)液。IGF-1的濃度依次為50、40、20、10、5、2ng/mL，姜黃素的濃度依次取80、40、20μM。規(guī)定時間繼續(xù)培養(yǎng)后，每孔加入0.5mg/mLMTT，37℃培養(yǎng)3～4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl二甲基亞砜（DMSO），用酶標儀在波長為595nm下測定光密度值，參考波長為655nm。每組試驗做3次重復，每個處理做4個平行樣。實驗結果按公式計算：細胞存活率=（OD實驗組-OD空白組/OD對照組-OD空白組）×100%。

1.2.3 Annexin V-PI雙染檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞，以4×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基加入40μM的姜黃素和（或）50ng/mL的IGF-1的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6h后，0.25%胰酶消化細胞后，用PBS液洗脫細胞，移至離心管，離心后去上清，用PBS液將細胞濃度調整為適宜的濃度后，按Annexin V-PI的說明操作，測定細胞凋亡情況。

1.2.4 RT-PCR法測定姜黃素對膀胱腫瘤細胞IGF-1及IGF-1R mRNA相對表達量 取對數(shù)生長期細胞，培養(yǎng)24h后，用不同濃度的姜黃素處理，按規(guī)定時間收集懸浮和貼壁細胞，提取培養(yǎng)細胞總的RNA。分別對管家基因（GAPDH）和目的基因（IGF-1基因和IGF-1R基因）制作標準曲線。通過管家基因的校正，檢測樣品中目的基因的相對表達量。特異性引物采用Primer Premier 5.0 software設計。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下：IGF-1R UP：gTTgggAAggggATCATTTT IGF-1R，DOWN：CATgAAAACCATTggCTgTg；IGF-1 UP：ggCTgAC- CAAgCTgAAACTC，DOWN：ATCgCTTAAACCCAggAggT，將含有引物的PCR反應混合液（25μl）放入SmarteyclerⅡ型PCR儀（TaKaRa，USA）進行PCR擴增反應，PCR反應參數(shù)如下：95℃，10s；95℃，5s；60℃，20s，共45個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，組間比較用SNK-q（Student-Newman-Keuls）多重比較檢驗，量效關系用Spearman等級相關檢驗，以α= 0.05為檢驗水準。

2 結果

姜黃素抑制T24細胞生長：使用MTT法分析姜黃素對T24細胞的作用，結果顯示姜黃素可以抑制T24細胞的活性，并呈劑量和時間依賴關系。作用24h后，比較對照組，20、40、80μM的姜黃素對IGF-1（50ng/mL）T24細胞的抑制率分別為（26.7±3.44）%、（45.8±2.79）%和（54.9±5.43）%（P＜0.05）。48h后，20、40、80μM的姜黃素對IGF-1（50ng/mL）T24細胞的抑制率分別為（28.6±2.34）%、（47.8±3.16）%和（58.9±4.73）%（P＜0.05），抑制率隨培養(yǎng)時間的延長呈增長趨勢（P＜0.05）。

姜黃素誘導腫瘤細胞凋亡：40μM姜黃素作用6h，早期凋亡（AV+/PI）的T24細胞達（13.5±1.06）%，明顯高于對照組的（3.4±0.31）%（P＜0.05）。IGF-1（50μg/L）作用組的細胞基本上在第三象限，說明IGF-1具有抗細胞凋亡作用。與姜黃素同時作用后，T24細胞的早期凋亡率分別增至（7.6±1.09）%，與IGF-1（50μg/L）作用組有顯著性差異（P＜0.05）。

姜黃素對T24細胞IGF-1與IGF-1R mRNA表達的影響：姜黃素按80、40、20μM/L濃度給藥后6h測定細胞IGF-1 mRNA相對與對照組表達量分別為（76.67±1.15）%、（58.51±2.47）%、（42.18±1.94）%（P＜0.05）；IGF-1R mRNA相對表達量為（54.6±2.27）%、（40.12±4.20）%、（23.0±6.50）%（P＜0.05），可見IGF-1與IGF-1R的mRNA表達量隨姜黃素的濃度增加而減少（P＜0.05）。

3 討論

IGF-1是一種多功能細胞因子，參與細胞的生長、發(fā)育和分化，具有促進多種細胞生長及增殖的能力。IGF-1在多種組織和細胞中表達，可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關[1]。眾多細胞實驗和動物實驗證實了姜黃素的抗癌活性[2]，大量研究表明姜黃素不僅能夠阻遏細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡、分化，還可通過調節(jié)多種細胞信號途徑抑制細胞生長。夏艷秋等[3]的體外試驗表明，姜黃素減弱了IGF-1對MCF-7細胞生長的刺激作用，并且逆轉了IGF-1介導的抗凋亡作用。Patel等[4]研究表明，在結腸癌細胞中，姜黃素通過調整EGFR和IGF-1R可以增強5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑的作用。但是，姜黃素與生長因子IGF-1及其系統(tǒng)的關系尚未闡明，有關姜黃素能否通過調控IGF-1通路抑制腫瘤細胞生長和誘導凋亡值得深入探討。

本研究以MTT法檢測細胞活力作為衡量腫瘤細胞增殖的指標、以Annexin V-PI雙染色作為衡量細胞凋亡的指標，探討姜黃素對IGF-1通路的影響。IGF-1處理后，不僅可明顯提高細胞活力、促進T24細胞增殖，還可以抑制細胞凋亡。這些結果均證實IGF-1是腫瘤細胞有絲分裂的重要激活劑[5]，是腫瘤發(fā)展的重要刺激因子。更重要的是姜黃素能明顯延緩IGF-1促細胞增殖的速度，并抑制IGF-1的抗凋亡作用。提示姜黃素抑制T24細胞增殖，并誘導凋亡作用可能部分通過抑制IGF-1通路作用而實現(xiàn)[6]。另外，無血清培養(yǎng)條件T24細胞均具有一定的增殖能力，這可能依賴于腫瘤細胞本身分泌的IGF-1的刺激作用。上述結果將會對姜黃素抗腫瘤作用機制方面做一定的貢獻。

[參考文獻]

[1] Bustin SA，Dorudi S，Phillips SM，et al. Local expression of insulin-like growth factor-1 affects angiogenesis in colorectal cancer[J]. Tumour Biol，2002，23（3）：130-138.

[2] Su CC，Lin JG，Li TM，et al. Curcumin-induced apoptosis of human colon cancer colo 205 cells through the production of ROS，Ca2+ and the activation of caspase-3[J]. Anticancer Res，2006，26（6B）：4379-4389.

[3] Xia Y，Jin L，Zhang B，et al. The potentiation of curcumin on insulin-like growth factor-1 action in MCF-7 human breast carcinoma cells[J]. Life Sciences，2007，80（23）：2161-2169.

[4] Patel BB，Sengupta R，Qazi S，et al. Curcumin enhances the effects of 5-fluorouracil and oxaliplatin in mediating growth inhibition of colon cancer cells by modulating EGFR and IGF-1R[J]. Int J Cancer，2008， 122（2）：267-273.

[5] Sachdev D，Yee D. Inhibitors of insulin-like growth factor signaling：a therapeutic approach for breast cancer[J]. Journal of Mammary Gland Biology Neplasia，2006，11（1）：27-39.

[6] Shariat SF，Kim J，Nguyen C，et al. Correlation of preoperative levels of IGF-1 and IGFBP-3 with pathologic parameters and clinical outcome in patients with bladder cancer[J]. Urology，2003，61（2）：359-364.

（收稿日期：2009-01-17）