[摘要] 目的 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測大鼠骨骼肌挫傷后肌鈣蛋白I mRNA（sTnI mRNA）表達(dá)情況，分析其與挫傷的關(guān)系。方法 建立大鼠骨骼肌挫傷模型，分別在挫傷后0.5h，1h，6h，12h，18h取材。提取挫傷肌肉中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，以cDNA作為模板，通過特異性上下游引物熒光定量PCR檢測cDNA的拷貝數(shù)，選取管家基因核糖體蛋白L32為參比基因，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行相對定量分析。結(jié)果 大鼠骨骼肌挫傷后0.5h、1h、6h、12h、18h 的sTnI mRNA表達(dá)量分別為正常組的66.7%、46.6%、31.9%、18.5%和15.3%，呈時(shí)序性表達(dá)下調(diào)趨勢。結(jié)論 大鼠骨骼肌挫傷后0.5h內(nèi)sTnI mRNA的表達(dá)即開始下調(diào)，18h內(nèi)sTnI mRNA的表達(dá)有一定的時(shí)間規(guī)律性，可望作為臨床診斷骨骼肌損傷的指標(biāo)之一。

[關(guān)鍵詞] 骨骼肌損傷； 骨骼肌肌鈣蛋白I； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

[中圖分類號] R642 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2009）13-40-03

Expression of sTnI mRNA in Rat Skeletal Muscle after Contusion

ZHANG Lei SUN Junhong LU Jian WANG Yafang WANG Yingyuan

Department of Forensic Pathology，Shanxi Medical University School of Forensic Medicine，Taiyuan 030001

[Abstract] ObjectiveTo investigate the expression of skeletal troponin I mRNA（sTnI mRNA）changes induced by contusion in rat skeletal muscle using Real Time PCR，aimed to provide some help for forensic estimation of wound age. MethodsThe 36 rats were divided into two groups randomly：contusion group（5 subgroups） and control group，the contusion was performed on the right posterior limb of rat. The samples were extractd respectively at 0.5h，1h，6h，12h，18h after contusion. Total RNA were isolated from skeletal muscle of two groups，and reverse transcription polymerase chain reaction was conducted to synthesize the 1-st strand cDNA. With the use of sequence-specific primers，the expression level of sTnI mRNA was studied by Real Time PCR. ResultsOur results normalized by Ribosomal Protein L32（rpL32） showed that mRNA levels of sTnI were 66.7%，46.6%，31.9%，18.5% and 15.3% in contusion groups compared to control group respectively at 0.5h，1h， 6h，12h，18h，which present down-regulated after contusion within 18hs time-orderly. ConclusionThe time-order expression of sTnI mRNA after contusion was potentially indicative for diagnosis of early muscle injury.

[Key Words]Muscle injury； sTnI mRNA； Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction

骨骼肌損傷以及骨骼肌疾病在臨床上頗為常見，進(jìn)行快速準(zhǔn)確的診斷十分重要。傳統(tǒng)酶學(xué)指標(biāo)如CK、CK-MB等并非骨骼肌所特有，且缺乏敏感性和特異性，加之劇烈運(yùn)動后也可導(dǎo)致血中CK、CK-MB的輕微升高，給骨骼肌損傷，特別是輕微損傷、多發(fā)性損傷的早期診斷帶來了不小的困難。sTnI與cTnI相似的特性，給骨骼肌損傷以及疾病的診斷提供了新的思路。

本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大鼠骨骼肌挫傷模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time PCR）檢測大鼠骨骼肌挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)骨骼肌肌鈣蛋白I mRNA（Skeletal troponin-I mRNA，sTnI mRNA）的表達(dá)量，探尋其時(shí)序性變化規(guī)律，旨在為骨骼肌損傷以及疾病的診斷提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要儀器

總RNA提取試劑盒（SV Total RNA Isolation System）購自美國Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT-PCR Kit）及實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）購自大連寶生物工程有限公司；美國Stratagene公司Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；美國SIGMA公司低溫高速離心機(jī)2-16PK型。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康成年清潔級Sprague-Dawley大鼠36只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。雌雄不限，體重（300±15）g，隨機(jī)分成6組，每組6只，包括5個(gè)損傷組（0.5h，1h，6h，12h，18h）和1個(gè)正常對照組。

1.3 動物模型制作及取材

1.3.1 動物模型制作 經(jīng)口鼻乙醚麻醉大鼠，選取大鼠右后肢股四頭肌作為挫傷著力點(diǎn)，用本室自制的褪毛劑褪凈著力點(diǎn)附近約2.5cm×2.5cm區(qū)域的鼠毛，仰臥位固定于鼠板上，充分暴露打擊區(qū)域。利用改進(jìn)的Marmarou自由落體裝置，250g重力錘自150cm高度垂直自由落下，造成大鼠右后肢股四頭肌處肌肉挫傷（解剖證實(shí)損傷率達(dá)100%）。

1.3.2 取材 大鼠存活至預(yù)定時(shí)間后迅速脫頸處死。打擊區(qū)域常規(guī)手術(shù)消毒后，無菌手術(shù)剪剪開皮膚及淺層肌肉，暴露股四頭肌損傷處，取材并嚴(yán)格稱重40mg，將檢材包裹好后迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA的提取及檢測

1.4.1 總RNA的提取 嚴(yán)格按照SV Total RNA Isolation System試劑盒說明進(jìn)行操作。提取完畢后，取4μL進(jìn)行紫外分光光度測定，5μL上樣電泳檢測完整性。

1.4.2 總RNA純度及完整性的檢測 紫外分光光度儀測定OD260/ OD280值在1.9～2.0之間，總RNA濃度約為230ng/μL；1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，可見清晰較亮的28s、18s兩條帶，28s寬度約為18s的兩倍，說明總RNA的完整性較好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求，如圖1。

1.5 反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件

模板總RNA進(jìn)行65℃水浴5min變性后迅速冰上放置，同時(shí)按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明冰上配制反應(yīng)混合液如下：5×PrimeScript Buffer 2μL，RT Enzyme Mix 0.5μL，Oligo dT Primer（50μM）0.5μL，Random 6mers（100μM）0.5μL，總RNA模板500ng，用Nuclease-Free水補(bǔ)足10μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：37℃反應(yīng)15mins，85℃滅活5s，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用SYBR Green I 熒光嵌合法進(jìn)行Real Time PCR。按照實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）操作說明冰上配制反應(yīng)混合液如下：SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，F(xiàn)orward Primer（10μM）0.5μL，Reverse Primer（10μM）0.5μL，cDNA模板2.0μL， Nuclease-Free水9.5μL。選取內(nèi)源性管家基因（House Keeping Gene）核糖體蛋白L32（Ribosomal Protein L32，rpL32）作為參比基因，反應(yīng)體系同上。每組樣本均設(shè)空白對照及復(fù)管。目的基因與參比基因均按以下反應(yīng)程序：第一階段：95℃，預(yù)變性，10min，1個(gè)循環(huán)；第二階段：95℃，變性，30s；60℃，退火、延伸20s，40個(gè)循環(huán)；第三階段為融解曲線繪制階段：95℃，1min；55℃，30s；95℃，30s。

目的基因及參比基因擴(kuò)增所用上下游引物序列均引自GeneBank，由本室研究人員通過專業(yè)Primer5.0軟件設(shè)計(jì)優(yōu)化，經(jīng)BLAST檢索確認(rèn)特異性，委托上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

1.7 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

反應(yīng)結(jié)束后，由StratageneMxPro QPCR軟件自動分析并輸出熒光定量結(jié)果。采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間均數(shù)比較、Student-Newman- Keuls（SNK）法兩兩比較，P值小于0.05被認(rèn)為兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1sTnI mRNA擴(kuò)增曲線

各組樣本PCR過程基本都在第12個(gè)循環(huán)開始起峰，曲線拐點(diǎn)清楚，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)象；指數(shù)期曲線斜率為1.05，表明擴(kuò)增效率較高；各管的擴(kuò)增曲線平行性好，表明擴(kuò)增效率相近，如圖2。

2.2 sTnI mRNA融解曲線

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)在55℃～95℃范圍內(nèi)自動進(jìn)行融解曲線的繪制。如圖3所示：各樣本融解溫度集中在88℃，融解曲線均為單一峰型，基底窄而峰高，表明并無引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生。

2.3 sTnI mRNA相對定量結(jié)果

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示組內(nèi)各樣本間兩兩比較的P值> 0.05，說明損傷后各樣本sTn I mRNA表達(dá)量的變化與個(gè)體因素?zé)o關(guān)；各取材時(shí)間sTn I mRNA相對含量各組間比較的P值< 0.05，各組間兩兩比較的P值< 0.05，說明大鼠骨骼肌挫傷后sTnI mRNA的表達(dá)量隨損傷時(shí)間的延長（18h內(nèi)）逐漸下調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而18h和12h兩組相比較其P值> 0.05，說明sTnI mRNA隨著損傷時(shí)間的延長，已經(jīng)趨于一個(gè)低水平穩(wěn)態(tài)的表達(dá)，見表2。

2.4 大鼠肌肉挫傷后18h內(nèi)sTnI mRNA表達(dá)量變化

大鼠肌肉挫傷后18h內(nèi)sTnI mRNA表達(dá)量變化趨勢見圖4。

3 討論

骨骼肌肌鈣蛋白（Skeletal Troponin，sTn）是由C、T、I 3個(gè)亞單位組成的復(fù)合體，TnI亞基為單一多肽鏈，是肌肉收縮的分子開關(guān)，通過抑制細(xì)絲中的肌動球蛋白（Actomyosin）的ATP酶活性，抑制肌球蛋白（Myosin）與肌動蛋白的結(jié)合，進(jìn)而阻止肌肉的收縮[1]。生理情況下極少有sTnI 釋放到血液中，只有當(dāng)骨骼肌損傷、病變發(fā)生后，sTnI才會大量出現(xiàn)在循環(huán)系統(tǒng)中。研究證實(shí)sTnI的釋放與骨骼肌損傷類型及程度有密切關(guān)系，嚴(yán)重外傷會導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞骨架網(wǎng)（Cytoskeletal network）和收縮裝置結(jié)構(gòu)（Contractile apparatus）的迅速崩解，TnI與肌原纖維分離，結(jié)合部分以固定形式存在的sTnI從肌纖維不斷崩解破壞而釋放，其本身及酶解片段進(jìn)入血循環(huán)，造成血中sTnI濃度迅速升高[2-4]近年來，骨骼肌損傷的臨床診斷研究取得了一定的進(jìn)展：Kiely[5]等利用酶免疫測定法對16例多發(fā)性肌炎（Polymyositis）和皮肌炎（Dermatomyositis）患者血清中sTnI、cTnI、CK、及CK-MB的濃度進(jìn)行了測定。與對照組相比，sTnI、CK及CK-MB均顯著升高，而cTnI并未達(dá)到可檢出限濃度（0.03μg/L）。結(jié)果表明CK與CK-MB具有相關(guān)性（Spearman r = 0.99，P < 0.0001），同時(shí)sTnI與CK-MB間有相關(guān)性（Spearman r = 0.98，P < 0.0001），說明在骨骼肌炎性病變時(shí)，sTnI、CK及CK-MB均會大量釋放入血，但考慮到上述指標(biāo)組織特異性時(shí)，認(rèn)為sTnI較CK及CK-MB更具有診斷意義。Onuoha[6]等同樣利用酶免疫測定法（Immunoenzymometric assay）對16例骨折病人（包括脛腓骨、股骨、顱骨骨折等）和20例軟組織損傷病人（挫傷、扭傷、韌帶撕裂傷等）血漿中sTnI、CK-MB及彈性蛋白酶（Elastase）進(jìn)行定量測定（患者無心臟疾病，且尚未進(jìn)行外科治療），設(shè)對照組17例。結(jié)果表明骨折病人和軟組織損傷病人血漿中sTnI含量明顯升高，分別為（15.25±2.4）ng/mL及（10.41±1.8）ng/mL，明顯高于對照組（2.5±0.9）ng/mL水平且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MB、Elastase濃度與對照組比較并無顯著性差異，同時(shí)，損傷組和對照組均未檢出cTnI。表明sTnI對骨骼肌損傷有診斷意義，且敏感性和特異性均優(yōu)越于CK-MB、Elastase等指標(biāo)，并認(rèn)為sTnI含量與損傷程度呈相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠骨骼肌挫傷后0.5h、1h、6h、12h、18h 的sTnI mRNA表達(dá)量分別為正常組的66.7%、46.6%、31.9%、18.5%和15.3%，呈時(shí)序性表達(dá)下調(diào)趨勢。其機(jī)制目前尚不清楚，作者推測在損傷早期以組織出血、水腫、壞死為主要改變時(shí)，機(jī)體啟動主動防御機(jī)制使sTnI mRNA的表達(dá)量下調(diào)，有利于受損的肌纖維保持收縮狀態(tài)，在一定程度上固定了損傷的范圍，避免了損傷的加重；也有可能在損傷早期，大量的炎性因子直接抑制了sTnI基因的表達(dá)。

急性嚴(yán)重創(chuàng)傷可直接造成患者骨骼肌變性及壞死，肌紅蛋白、酸性代謝產(chǎn)物、血管活性物質(zhì)和組織毒素等大量釋放入血，而骨骼肌損傷誘發(fā)急性腎功能衰竭占創(chuàng)傷后急性腎功能衰竭的33.8%[7]，是導(dǎo)致急性腎功能衰竭的重要因素。本實(shí)驗(yàn)利用Real Time PCR檢測到大鼠骨骼肌挫傷后早在0.5h內(nèi)sTnI mRNA的表達(dá)即開始下調(diào)，18h內(nèi)sTnI mRNA的表達(dá)有一定的時(shí)間規(guī)律性，對于臨床診斷骨骼肌損傷、推斷損傷時(shí)間，以便及時(shí)治療并預(yù)防骨骼肌損傷導(dǎo)致的急性腎功能衰竭有重要意義。

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（收稿日期：2009-01-02）