汪永紅，吳剛珂

(荊州市中心醫(yī)院檢驗科，湖北 荊州 434020)

顏承農

(長江大學化學與環(huán)境工程學院；長江大學工程技術學院，湖北 荊州 434023)

茜素紫與牛血清白蛋白相互作用特征研究

汪永紅，吳剛珂

(荊州市中心醫(yī)院檢驗科，湖北 荊州 434020)

顏承農

(長江大學化學與環(huán)境工程學院；長江大學工程技術學院，湖北 荊州 434023)

在不同溫度下，用熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外可見吸收光譜法研究了茜素紫(Alizarin-Violet,ALV)與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)相互作用特征。分別用Stern-Volmer方程、Lineweaver-Burk雙倒數方程和熱力學方程等處理試驗數據，得到相互作用常數的平均值為1.078×105L/mol，相互作用的ΔHθ、ΔGθ和ΔSθ的平均值分別為-8.030kJ/mol、-29.19kJ/mol和69.80J/K，作用位置為2.38nm，作用位點數為1.173。證實了在試驗濃度和溫度范圍內，ALV與BSA可相互作用形成具有一定結構的復合物，其熒光猝滅作用更符合靜態(tài)猝滅作用特征，為研究ALV的生態(tài)環(huán)境效應、生物學效應和對蛋白質構象的影響以及ALV的染色機理等提供了重要信息。

茜素紫；牛血清白蛋白；熒光猝滅光譜；三維熒光光譜；吸收光譜；熱力學參數

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，它能與許多內源性和外源性物質相互作用。研究小分子和血清白蛋白相互作用的熱力學特征，可以在分子水平上認識它們相互作用的作用力性質和作用機理，從而為生命科學及藥物的研究提供有用的信息。小分子染料可以與蛋白質結合，引起染料或蛋白質光譜特性的變化，因此小分子染料作為測定蛋白質的熒光探針得到了廣泛應用[1,2]。茜素紫(Alizarin-Violet，ALV)是一種常用的有機顯色劑，常用于食品中微量錫的光譜分析和羥自由基的光度分析[3,4]。在生產和應用ALV時，流散于水土中的ALV有可能通過食物鏈進入生物體內，對生態(tài)環(huán)境和生物體產生一定的影響。筆者在模擬人體生理條件下，用熒光光譜、熒光猝滅光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見吸收光譜法研究了ALV與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)相互作用的光譜行為。

1 試驗部分

1.1儀器與試劑

1)儀器 LS-55型熒光分光光度計(美國PE公司)；TU-1901型可見分光光度計(上海普析通用儀器有限責任公司)；AY120電子天平(日本島津公司)；恒溫水浴SYC-15型(南京桑力電子設備廠)。

2)試劑 ALV (上海試劑三廠提供，分子式C20H12O7，分子量為364.3)儲備液：5.490×10-5mol/L；BSA(上海生物化學制劑廠)溶液：1.0×10-5mol/L；NaCl溶液：0.5mol/L；Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.40)。所用試劑均為分析純，試驗用水為二次去離子水，經檢測無熒光雜質。

1.2試驗方法

在10ml比色管中依次加入2.0ml(0.5mol/L)NaCl溶液、2.0ml Tris-HCL緩沖溶液(pH=7.40)、 2.0ml BSA溶液及一定量的ALV溶液，以二次去離子水定容為10.0ml，在λex=285nm以及狹縫寬度為15∶2.5時，在250～480nm范圍內掃描BSA的熒光光譜及BSA在ALV作用下的熒光猝滅光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜。

2 結果與討論

2.1ALV作用BSA的熒光猝滅光譜

曲線1～8：cALV = 0、2.745×10-6、5.490×10- 6、8.235×10-6、1.098×10-5、1.372×10- 5、1.647×10-5、1.921×10- 5mol/L；cBSA=2.0×10-6mol/L；cNaCl=0.1 mol/L。圖1 BSA的熒光光譜和AVL對BSA作用的熒光猝滅光譜

1)熒光猝滅光譜 BSA是內源性熒光物質，分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基能夠發(fā)射熒光。

當激發(fā)光波長為285nm時，BSA熒光發(fā)射峰位置在347nm附近。按試驗方法分別掃描了25、31、37、43℃等溫度下BSA和BSA-ALV體系的熒光猝滅光譜，25℃的BSA的熒光光譜和在ALV作用下BSA的熒光猝滅光譜見圖1。由圖1可以看出，隨著ALV濃度的增大，BSA的熒光強度依次有規(guī)律的降低，表明ALV對BSA具有明顯的作用。

2)熒光猝滅作用性質的描述和判斷 熒光猝滅作用可分為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉移猝滅等。在一般情況下，動態(tài)猝滅作用和靜態(tài)猝滅作用主要以其猝滅常數隨溫度的變化關系加以區(qū)分。對于動態(tài)猝滅作用，升高溫度將增加分子間的有效碰撞并加劇電子的轉移過程，熒光猝滅常數隨著溫度的升高而增大；對于靜態(tài)猝滅作用，升高溫度將降低復合物的穩(wěn)定性，熒光猝滅常數隨著溫度的升高而減小。動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅作用還可以分別用Stern-Volmer[2]:

(1)

和Lineweaver-Burk方程[3]:

(2)

2.2線性回歸方程和熱力學參數

圖2 Stern-Volmer 曲線和Lineweaver-Burk曲線

溫度/℃Stern?Volmer方 程RLineweaver?Burk方 程R18I0F/IF=08098+1961×105cALV09935(I0F-IF)-1×10-3=5200×10-3+4263×10-8c-1ALV0999924I0F/IF=07707+2015×105cALV09917(I0F-IF)-1×10-3=5400×10-3+4710×10-8c-1ALV0999530I0F/IF=07962+1843×105cALV09919(I0F-IF)-1×10-3=5602×10-3+5201×10-8c-1ALV0999836I0F/IF=07990+1745×105cALV09894(I0F-IF)-1×10-3=6160×10-3+6116×10-8c-1ALV0999742I0F/IF=08039+1759×105cALV09917(I0F-IF)-1×10-3=6601×10-3+6521×10-8c-1ALV09999

圖3 lnKLB ～1/T圖

2.3ALV與BSA之間的作用力

根據反應前后熱力學焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷小分子與生物大分子之間的主要作用力類型[7]：ΔHgt;0、ΔSgt;0為疏水作用力；ΔSlt;0、ΔHlt;0為氫鍵和范德華力；ΔHlt; 0、ΔSgt;0為靜電引力。當溫度變化不大時，ALV與BSA作用的焓變ΔH可看成一個常數，當溶液比較稀時，KSV可視為相互作用的標準平衡常數[8]，根據式(1)和式(2)可以求得相互作用的KSV、Kq和KLB，由Van’t Hoff等壓方程[8]的不定積分式：

lnK=-(ΔH/R) ·(1/T)+A

作圖(見圖3)可以求得ΔH，由方程[9]：

ΔGθ=-RTlnKθΔG=ΔH-T·ΔS

可求ΔGθ和ΔSθ等，見表2。由表2所列參數可以確定，ALV與BSA之間的作用力可能主要是靜電作用力。由于ALV分子中含有一個羧酸基，顯負電性，BSA分子中氨基酸殘基均帶一定量的正電荷，容易依靠靜電力相互作用生成ALV-BSA復合物。溫度升高可使靜電作用力減小，ALV-BSA復合物的穩(wěn)定性降低，靜態(tài)猝滅作用常數減小，與試驗結果相符。

表2 結合常數和熱力學參數

2.4作用位點數和作用距離

在靜態(tài)猝滅作用中，生物大分子與小分子之間相互作用的位點數n[10]可用：

化學作用必然伴隨能量變化或者能量轉移現象，通過能量轉移效率的研究可以得到很多重要信息，如可以測定大分子中某些基團之間的距離等。根據偶極-偶極非輻射能量轉移理論，當給能體分子本身能發(fā)射熒光，且其熒光發(fā)射光譜與受能體的紫外-可見吸收光譜有相當程度的重疊，給能體與受能體之間的距離靠近約在7nm以內，即有可能發(fā)生能量轉移現象。能量轉移效率是發(fā)生能量轉移的2個基團之間距離的函數[11]:

其中，E為能量轉移效率；r為供能體和受能體之間的結合距離；R0為臨界能量轉移距離；K為生物大分子與小分子之間相互作用的結合常數；φ為供能體熒光量子產率；J為供能體的熒光發(fā)射光譜與受能體吸收光譜的重疊積分[9,10]。試驗測得BSA的熒光發(fā)射光譜和ALV的紫外-可見吸收光譜有較大程度的重疊，如圖5所示。由函數關系式求得BSA與ALV之間的結合距離約為2.38nm。

曲線1:cBSA= 2.0×10-6mol/L曲線2:cALV=2.0×10-6mol/L 圖圖5 BSA的熒光發(fā)射光譜(1)和關系曲線ALV的紫外吸收光譜(2)

2.5ALV對BSA構象的影響

同步熒光光譜、三維熒光光譜的技術和方法在研究微環(huán)境變化對蛋白質的構象和生物活性影響方面有著廣闊的前景[11]。在波長差Δλ= 15nm時的同步熒光光譜主要反映酪氨酸殘基(Trp)的熒光光譜特征，波長差Δλ= 60nm時則主要反映色氨酸殘基(Try)的熒光光譜特征[12]。因蛋白質中氨基酸殘基的相對熒光強度及其峰波長的變化與其所處環(huán)境的改變密切相關，故由相對熒光強度及其峰波長的變化可判斷蛋白質分子所處微環(huán)境的變化。固定BSA濃度，改變ALV濃度，在Δλ分別為15nm和60nm時，掃描BSA和BSA-ALV體系的同步熒光光譜(見圖6)。由圖6可以看出，BSA中Trp和Try殘基的熒光強度隨著ALV濃度增大相應減弱；Trp的熒光光譜峰波長幾乎沒有發(fā)生位移，由283.6nm移至284.2nm，表明在試驗條件下ALV改變了Try殘基所處微環(huán)境，使其極性有所增加，疏水性減小。

曲線1～8：cALV/10-6mol·L-1：0，2.745，5.490，8.235，1.098，1.372，1.647，1.921；cBSA=2.0×10-6mol/L；cNaCl=0.1mol/L。圖6 BSA和BSA-ACET體系的同步圖譜

按照試驗方法掃描了BSA和BSA-ALV體系的三維熒光光譜(見圖7)，繪制了等熒光強度圖(見圖8)。由圖7、圖8，可比較ALV作用BSA前后三維熒光光譜的變化，探討ALV對BSA構象和微環(huán)境的影響。

由圖7和圖8可知，當BSA的濃度為5.0 ×10-6mol/L時，有2個熒光峰，峰1、峰2的峰頂熒光強度和峰頂坐標(IF；λex/λem)分別為(151.8；280.0/350.0)和(158.8；230.0/350.0)，當加入ALV后，峰1、峰2的峰頂熒光強度和峰頂坐標(IF；λex/λem)分別為(59.52；280.0/351.5)和(72.94；225.0/355.0)，熒光強度分別降低了92.28和85.86，峰1的激發(fā)波長基本未變，發(fā)射波長紅移了1.5nm，峰2的激發(fā)波長藍移了5nm，發(fā)射波長紅移了5nm。說明ALV與BSA作用后，Trp所處微環(huán)境的極性有所增強，疏水性減小，BSA的肽鏈可能不同程度地伸展，構成α-螺旋結構的氫鍵斷裂后實現氫鍵的重組，α-螺旋結構部分或者大部轉變?yōu)棣?折疊結構，形成了一種新的無序結構[13,14]。

圖7 BSA和BSA-ALV體系的三維熒光光譜

圖8 BSA和BSA-ALV體系的等熒光強度圖

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[編輯] 洪云飛

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1673-1409(2009)04-N025-05