劉艷環(huán)，馬國棟

●研究報道Short Comunications

耐力訓練下調的HDMCP表達對非酒精性脂肪肝線粒體活性氧生成的影響

劉艷環(huán)，馬國棟

目的：研究耐力訓練對非酒精性脂肪肝HDMCP表達的影響及與活性氧生成的關系。方法：以西方膳食誘導的脂肪肝小鼠為模型，跑臺運動為訓練手段，測定肝臟HDMCP及MnSOD表達，順烏頭酸酶和MnSOD活性，MDA、OH·-含量的變化。結果：非酒精性脂肪肝小鼠模型組肝臟MnSOD與HDMCP表達顯著升高，順烏頭酸酶活性顯著下降，MnSOD活性顯著升高，MDA和OH·-含量顯著升高；耐力訓練后MnSOD表達進一步升高，而HDMCP表達顯著降低，順烏頭酸酶活性得到明顯恢復，MDA和OH·-含量顯著降低，MnSOD活性進一步升高。結論：HDMCP在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中可能作為一種應激蛋白，調控線粒體活性的生成，但其調控作用不能夠完全代替抗氧化系統(tǒng)的作用，只是起輔助作用，抗氧化系統(tǒng)才是真正的抗氧化主體；耐力訓練后，抗氧化系統(tǒng)能力進一步增強，HDMCP表達降低，從而提高線粒體偶聯(lián)程度，增強線粒體ATP合成能力。

耐力訓練；非酒精性脂肪肝；活性氧；肝細胞癌下調的線粒體轉運蛋白

耐力訓練對非酒精性脂肪肝（NAFLD）有良好的預防/與治療作用[1]，但其機理尚未完全清楚。線粒體作為細胞能量和活性氧產(chǎn)生的中心，與非酒精性脂肪肝發(fā)病關系密切。細胞ATP的產(chǎn)生與活性氧形成之間的平衡是維持細胞功能的重要保證。在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中，線粒體產(chǎn)生大量的活性氧，對細胞造成氧化損傷。為盡量避免這種氧化損傷，細胞會發(fā)生一系列的適應性反應，如細胞內(nèi)抗氧化酶的改變[2]。除了抗氧化酶的改變外，早期認為解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）也發(fā)揮著重要作用，通過解偶聯(lián)的方式減少線粒體活性氧的生成。但有一些研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD的動物和細胞模型中UCP2得到了表達，但其僅僅是mRNA的表達，而未檢測到蛋白質的存在[3]。最近的研究也表明在UCP2基因敲除鼠和正常鼠之間，其脂肪肝病變程度未見顯著性差異[4]。因此，肝細胞癌下調的線粒體轉運蛋白（HCC-down-regulated mitochondrial carrier protein，HDMCP）的發(fā)現(xiàn)可能為此帶來了曙光。Tan MG等[5]在肝細胞癌中克隆出一個新的基因，其蛋白命名為肝細胞癌下調的線粒體轉運蛋白，他們還發(fā)現(xiàn)，HDMCP過度表達能夠明顯引起線粒體質子漏加強，膜電位降低，導致細胞內(nèi)ATP含量顯著降低，因此作者認為，HDMCP具有解偶聯(lián)的功能，是一種新的解偶聯(lián)蛋白質。

非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中線粒體活性氧的產(chǎn)生是導致肝臟進一步惡化的重要原因。那么HDMCP與線粒體活性氧產(chǎn)生關系如何？耐力訓練對HDMCP表達有何影響？這種表達的變化對線粒體活性氧產(chǎn)生如何？這方面尚未發(fā)現(xiàn)報道。因此本研究以西方膳食誘導的非酒精性脂肪肝模型，探討耐力訓練對非酒精性脂肪肝肝臟HDMCP表達的影響及與非酒精性脂肪肝關系進行研究，以期為耐力訓練預防非酒精性脂肪肝的機理提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

雄性8周齡ApoE基因敲除小鼠（C57BL/6J）48只，體重20～22 g，購自北京大學醫(yī)科部實驗動物中心。實驗動物隨機分為4組，每組12只：（1）普通膳食14周對照組（C）；（2）14周西方膳食組（模型組M）；（3）繼續(xù)西方膳食＋12周跑臺運動組（ME）；（4）繼續(xù)西方膳食12周組（MM）。西方膳食為（21%脂肪，0．15%膽固醇）[6]。跑臺運動方案：0°坡度，小鼠第1～2周由10m/min，30m in，逐漸增加至13m/min，60min，自第3周開始為13m/ m in，60min，共運動12周。每天上午9:00至10:00進行運動，每周5次。每一組在實驗結束，禁食12 h處死，取肝臟，部分用于測定線粒體呼吸，部分－70℃保存，用于測定基因表達。每天光照均為12 h，自由飲水。

1.2 肝臟線粒體的提取

斷頭處死迅速取出肝臟約2 g，用冷生理鹽水沖洗凈血污，剔除結締組織、剪碎，加10 mL預冷生理鹽水，電動勻漿1 150轉/min，上下一次。0～4℃離心，600 g離心10m in。棄沉淀，上清于10 000 g離心10 min。沉淀用5 mL預冷生理鹽水懸浮，Teflon手動勻漿器勻漿。加入5mL冷生理鹽水中。10 000 g離心10min。沉淀懸浮在約2mL冷生理鹽水中。

1.3 指標測定

1.3.1 肝臟細胞脂肪變程度的光鏡觀察每一階段實驗動物處死后，取肝臟并浸入生理鹽水中洗掉血污，立即放入液氮冷卻，然后放入-70℃恒溫冰箱保存，以備光鏡觀察。光鏡觀察采用冰凍切片，H．E染色，光鏡下觀察脂肪病變程度。

1.3.2 肝臟線粒體順烏頭酸酶活性、MDA、羥自由基（OH·-）和MnSOD活性測定按文獻[7]方法，測定順烏頭酸酶活性；根據(jù)過氧化脂質降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，測定MDA含量；二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應時能產(chǎn)生一種黃色化合物，可進行比色測定谷光甘肽含量；根據(jù)Fenton反應，給予電子受體，用gress試劑顯色，形成紅色物質，其呈色與OH·-成正比，從而計算出OH·-的含量。通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生O2-·，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現(xiàn)紫紅色，當被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，根據(jù)抑制率的高低計算出Mn-SOD活性。

1.3.3 肝臟HDMCP與M nSODm RNA的表達以上述的肝臟組織，用Trizol Reagent試劑盒（Mrcgene產(chǎn)品）抽提總RNA，總RNA定性定量檢測后用逆轉錄試劑盒（Ferment產(chǎn)品）參照說明書進行逆轉錄反應，以備用于HDMCP、UCP2的擴增。引物序列為[8]：HDMCP上游5'-GCCACTCCTTTGCCACCTAC-3'，下游：5'-CACAGCCTCATAAGCCACGA-3';MnSOD:上游：5'-GCACATTAACGCGCAGATCA-3'下游：5'-AGCCTCCAGCA ACTCTCCTT-3';β-actin上游：5'-TTGTAACCAACTGGGA CGAT-3'，下游：5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。由北京博雅生物有限公司合成。

用半定量法測定HDMCP和UCP2mRNA，反應參數(shù)為：95℃預變性5min，然后進行如下5個循環(huán)，94℃30 s，45℃45 s 72℃45 s，然后進行25個循環(huán)，變性溫度與延伸溫度不變，終末延伸72℃7min，退火溫度分別為：53℃，55．5℃和56．5℃。

1.4 統(tǒng)計與分析

通過SPSS統(tǒng)計軟件（SPSS11．5 for Windows）處理，計算均值和標準差（）。采用方差分析進行比較。顯著性定為：P＜0．05。

2 結果

2.1 光鏡觀察肝臟脂肪肝病變程度

小鼠在經(jīng)過14周西方膳食后，肝臟組織中出現(xiàn)了明顯的脂肪滴，說明脂肪肝模型已經(jīng)建立成功（見圖1），26周組脂肪滴明顯（見圖2）；耐力訓練組脂肪滴明顯減少（見圖3）；對照組未見明顯的脂肪滴（見圖4）。

圖1 14周西方膳食后肝臟光鏡照片（×100倍），可見明顯的脂肪小泡。Figure 1 14week western dietgroup（×100）

圖2 26周西方膳食后肝臟光鏡照片（×100倍），脂肪小泡明顯。Figure 2 26 week western diet group（×100）

圖3 運動組肝臟光鏡照片（× 100倍），脂肪小泡明顯減少。Figure 3 Endurance trainingg roup（×100）

圖4 對照組（×100倍），未見明顯的脂肪小泡。Figure 4 Control（×100）

2.2 肝臟線粒體順烏頭酸酶活性、MnSOD酶活性及MDA和羥自由基（OH·-）含量

與C組比較，M、MM、ME組順烏頭酸酶活性均顯著降低；MDA水平M和MM組均顯著升高，與ME組未見顯著性改變；OH．-水平M與MM組顯著升高，ME組顯著下降；MnSOD酶活性M、MM和ME組均顯著升高。與M組比較，順MM組烏頭酸酶活性顯著下降，ME組顯著升高；MDA水平MM組顯著升高，ME組顯著下降；OH·-水平MM組顯著升高，ME組顯著下降；MnSOD酶活性MM組未見顯著性改變，ME組顯著升高。與MM組比較，順ME組烏頭酸酶活性顯著升高；MDA水平ME組顯著下降；OH．-水平ME組顯著下降；MnSOD酶活性ME組顯著升高（見表1）。

2.3 肝臟MnSOD和HDMCPm RNA的表達

與C組比較，M、MM和ME組MnSOD與HDMCPmRNA表達均顯著升高；與M組比較，MM組MnSOD與HDMCPmRNA表達均無顯著性改變，ME組MnSOD顯著升高，而HDMCP顯著下降；與MM組比較，ME組MnSOD表達顯著升高，而HDMCP顯著下降（見表2）。

表1 耐力訓練對肝臟線粒體順烏頭酸酶活性、MnSOD活性與MDA和OH·-含量的影響Table 1 The effec ts of endurance training on aconitase activity，MnSOD activity and the contents ofMDA and OH·-

表2 耐力訓練對肝臟MnSOD和HDMCPmRNA表達的影響Table 2 The effects ofendurance training on MnSOD and HDMCPm RNA expression

3 討論

非酒精性脂肪肝形成與肝臟細胞中脂肪攝入與氧化平衡打破有關，當大量脂肪在肝臟細胞中積累時，增加了甘油三酯合成，從而降低了脂肪酸的氧化和甘油三酯的分泌，導致大量脂肪在肝臟細胞中積累，形成脂肪肝。線粒體是細胞的產(chǎn)能中心，為機體提供大約90%的ATP，但它同時也是細胞中O2·-的主要來源，細胞95%以上O2·-產(chǎn)生于線粒體[3]。線粒體異常是導致脂肪在肝臟細胞中積累的主要原因（所謂“第一次打擊”），而線粒體異常導致的活性氧生成增加，進一步引起脂質過氧化（所謂“第二次打擊”）[9]。線粒體呼吸鏈異常直接導致活性氧的產(chǎn)生[10]，ob/ ob小鼠肝臟線粒體活性氧生成的速率顯著高于正常鼠[11]，活性氧引起的mtDNA缺失會顯著地降低線粒體的數(shù)量和功能，從而導致肝臟脂肪病變和肝臟損傷[12]。這種損傷還會導致線粒體復合體I、III、IV和V合成受損，因為mtDNA編碼13種線粒體復合體多肽。在非酒精性脂肪肝患者種發(fā)現(xiàn)氧化損傷的存在[13]。在ob/ob小鼠中發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈活性降低，而當用MnTBAP（一種MnSOD類似物）處理肥胖鼠時，線粒體呼吸鏈復合體活性增加，其活性可以增加30%～50%[14]。因此，活性氧與非酒精性脂肪肝關系重大。本研究發(fā)現(xiàn)在模型組MDA、OH·-均顯著升高，而順烏頭酸酶活性顯著降低，順烏頭酸酶存在于線粒體中，其活性的抑制被認為是線粒體超氧陰離子產(chǎn)生的可靠標記[15]，其活性的高低可以反映線粒體活性氧產(chǎn)生的多少。減少線粒體活性氧對機體的氧化損傷主要有兩種途徑，一方面是提高抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力（包括提高抗氧化酶的活性和含量，增加非酶物質的水平），清除更多的活性氧；另一方面是通過降低線粒體膜電位即解偶聯(lián)的方式，減少活性氧生成。在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中，這兩種方式可能均存在。本研究發(fā)現(xiàn)在模型組MnSOD酶活性及mRNA表達顯著升高說明了第一個方面的存在；同時發(fā)現(xiàn)模型組HDMCP表達顯著升高，HDMCP作為具有解偶聯(lián)功能的蛋白質[5]可能通過解偶聯(lián)的方式減少線粒體活性氧的生成。盡管模型組線粒體活性氧的生成增加似乎不能解釋HDMCP的解偶聯(lián)功能，這其實并不矛盾，因為雖然HDMCP通過解偶聯(lián)的方式減少了活性氧的生成，但不足以對抗活性氧的產(chǎn)生，結果導致肝臟線粒體活性氧生成的增加。

前期工作證實，耐力訓練可以有效地提高抗肝臟抗氧化能力，降低UCP2表達，從而改善線粒體的功能，達到預防/治療非酒精性脂肪肝的效果[1]。然而有一些研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD的動物和細胞模型中UCP2得到了表達，但其僅僅是mRNA的表達，而未檢測到蛋白質的存在[3]。最近的研究表明在UCP2基因敲除鼠和正常鼠之間，其脂肪肝病變程度未見顯著性差異[4]。因此，UCP2對線粒體功能有一定的影響，但起作用可能有限。進一步研究發(fā)現(xiàn)，UCP2在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中其解偶聯(lián)的功能較低（UCP2相關呼吸控制確實較低，未發(fā)表），可能更為重要的是HDMCP。在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中，HDMCP可能作為一種應激蛋白發(fā)揮作用，通過解偶聯(lián)的方式，以損失一部分能量作為代價，減少線粒體活性氧的生成。那么耐力訓練對HDMCP有何影響？本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過12周的跑臺運動后，肝臟HDMCP表達顯著降低，其意義可能在于減少線粒體質子漏，增加線粒體ATP合成能力[16]。而氧化損傷如何解決呢？在進化的過程中機體總會以最為經(jīng)濟有效的方式來解決遇到的問題。HDMCP的降低可能就是一個很好的例子。本研究發(fā)現(xiàn)，耐力訓練后，MnSOD活性、mRNA表達顯著升高，說明肝臟抗氧化能力增強；同時線粒體順烏頭酸酶活性顯著升高，MDA和OH·-均顯著降低，說明肝臟線粒體功能改善，活性氧生成減少。在這種情況之下，肝臟細胞無需再通過解偶聯(lián)的方式，以損失能量為代價，減少線粒體活性氧的生成。通過本研究認為：HDMCP在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中可能作為一種應激蛋白，調控線粒體活性的生成，但其調控作用不能夠完全代替抗氧化系統(tǒng)的作用，只是起輔助作用，抗氧化系統(tǒng)才是真正的抗氧化主體；耐力訓練后，抗氧化系統(tǒng)能力進一步增強，HDMCP表達降低，從而提高線粒體偶聯(lián)程度，增強線粒體ATP合成能力。

4 結論

HDMCP在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中可能作為一種應激蛋白，調控線粒體活性的生成，但其調控作用不能夠完全代替抗氧化系統(tǒng)的作用，只是起輔助作用，抗氧化系統(tǒng)才是真正的抗氧化主體；耐力訓練后，抗氧化系統(tǒng)能力進一步增強，HDMCP表達降低，從而提高線粒體偶聯(lián)程度，增強線粒體ATP合成能力。

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The Effect of Endurance Training Induced Downregulation of HDMCP on M itochondrial Reactive Oxygen Species Production in NAFLD M ice

LIU Yanhuan,MA Guodong
（School of PE,Shandong University of Technology,Zibo 255049,China）

Objective:To investigate the effect of endurance training on HDMCP expression and its impact on mitochondrial reactive oxygen species production in NAFLD.Methods:Itanalysised the expression of HDMCP and MnSOD and the changes of aconitase activity,MnSOD activity,contents of MDA and OH.-in liver in western diet-induced NAFLD of apoE knockoutmice after 12 week treadmill endurance training.Results:Western diet significantly increased expression of HDMCP and MnSOD in liver.Aconitase activity decreased significantly,however,MnSOD activity increased remarkably,and the contents of MDA and OH-augment significantly in model group.After 12 week endurance training,expression of HDMCP decreased significantly,nevertheless,expression and activity of MnSODmore significantly increased,aconitase activity restored markedly and contents of MDA and OH.-significantly lowered.Conclusion:In NAFLD,HDMCP expression increased,which enhanced the inhibition ofmitochondrial reactive oxygen species production,however, endurance training induced downregulation of HDMCP attenuated the inhibition ofmitochondrial reactive oxygen species production and increased the capability of ATP synthesis ofmitochondria.

endurance training;non-alcoholic fatty liver disease;reactive oxygen species;HCC-down-regulated mitochondrial carrier protein

G 804.2

A

1005-0000（2010）02-0154-04

2009-11-19；

2010-01-18；錄用日期：2010-01-20

山東理工大學博士啟動基金資助項目（項目編號：406049）

劉艷環(huán)（1971-），女，吉林白城人，山東理工大學講師。

山東理工大學體育學院，淄博255049。