張洪俠2，劉善云李寧馮紅王洪濤王敏徐新女，王金環(huán)

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耐力運動對ApoE基因敲除小鼠一氧化氮系統(tǒng)的影響及其對AS形成的干預作用

張洪俠1，2，劉善云1，李寧1，馮紅1，王洪濤1，王敏1，徐新女3，王金環(huán)3

目的：以ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠為動脈粥樣硬化（AS）模型，觀察耐力訓練對ApoE-/-小鼠AS形成的干預作用及NO系統(tǒng)的影響，以探討耐力運動抗AS的可能機制。方法：將24只8周齡ApoE-/-小鼠隨機分為AS模型組和運動干預組，每組12只，運動組在活動跑臺上進行耐力訓練，實驗持續(xù)14周后，測定兩組小鼠主動脈斑塊面積及病理變化、血清NO和血脂水平以及主動脈iNOS和eNOS蛋白表達。結果：運動組小鼠主動脈斑塊面積顯著小于對照組（P＜0.01），血管壁及內膜損傷程度較對照組減輕，血清NO濃度和主動脈eNOS蛋白表達顯著高于對照組（P＜0.01），i-NOS蛋白表達顯著低于對照組（P＜0.05），血脂水平兩組間無顯著差異。結論：耐力運動通過增加eNOS蛋白表達、抑制iNOS蛋白表達和提高血中NO水平而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

耐力運動；ApoE基因敲除小鼠；動脈粥樣硬化；一氧化氮；一氧化氮合酶

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是嚴重危害人類健康的疾病之一。一般認為，AS的發(fā)生發(fā)展是多種遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結果。近年研究顯示，AS是血管內皮損傷后的一種慢性炎癥反應過程，而一氧化氮（NO）功能低下與血管內皮損傷及慢性炎癥反應有著密切的關系[1]，因而成為AS發(fā)病機制中一個新的研究熱點。許多研究表明，NO合成不足或其利用率降低與AS的形成、發(fā)展及其并發(fā)癥的發(fā)生密切相關[1-2]。

運動鍛煉是防治動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的有效措施。已有研究發(fā)現(xiàn)，運動能有效地調節(jié)NO合成及一氧化氮合酶（NOS）的表達、增強NOS活性等[3-6]，提示運動通過改善NO/NOS系統(tǒng)機能而對動脈粥樣硬化防治產生有益的影響。本研究以ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠為研究對象，在復制實驗動物AS模型的基礎上，深入探討耐力運動對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的干預效果及對機體NO/NOS系統(tǒng)的影響，以闡明耐力運動對動脈粥樣硬化影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)

選取8周齡ApoE-/-小鼠24只，雄性，體重20～22 g，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，飼以“西方類型”膳食（膽固醇0．15%，脂肪21%），二級條件飼養(yǎng)。將各組小鼠分別在層流架中分籠飼養(yǎng)，每籠3～5只，自由進食進水。實驗室環(huán)境溫度保持在22～24℃，相對濕度為50%，光照時間12 h/天。

1.2 動物分組及訓練方案

將實驗動物隨機分為AS模型組（安靜對照組）和運動組，每組12只。運動組在活動跑臺上適應性訓練一周后，于每日上午9～10時進行耐力訓練，依據(jù)加拿大學者Fernando等[7]的研究資料，確定小鼠運動強度范圍，跑臺速度為13 m/m in，5天/周，1 h/天。實驗持續(xù)14周。

1.3 取材及組織處理

實驗周期結束將所有小鼠處死，禁食過夜（運動組停止運動24 h，以消除最后一次運動的急性效果）。采取眼球摘除法取血，離心分離血清，置-20℃保存。取血后迅速打開胸腔，暴露心臟和主動脈，從心尖部用注射器注入DEPC水進行沖洗，剪開右心耳以便流出沖洗液，慢速注入。取出全心臟（包括主動脈弓），以制備主動脈冰凍切片。

1.4 各指標測定與方法

1.4.1 血脂的測定甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）采用酶比色法測定；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）采用沉淀法測定。血脂測試試劑盒購自北京中生生物工程公司。

1.4.2 血清一氧化氮的測定采用硝酸還原酶法測定一氧化氮（NO）。使用722分光光度計，在550nm波長處測定樣品反應后的吸光度，計算NO含量。NO測試試劑盒購自南京建成生物技術有限公司；一氧化氮合酶（iNOS、eNOS）抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.4.3 主動脈斑塊面積評估（油紅O染色）及組織形態(tài)學觀察（HE染色）主動脈根部冰凍切片的制作：取出小鼠心臟連同主動脈，剝離血管外附著組織進行固定后用O．C．T包埋，連續(xù)切片，切片厚度7μm/張，在顯微鏡下選擇切片，選取主動脈橫斷面出現(xiàn)三個主動脈瓣膜時起至瓣膜消失。每間隔10張取一張，共5張參與斑塊面積評估，采用油紅O染色，利用計算機圖像分析Leica Qwin V3系統(tǒng)對主動脈斑塊面積進行估算，參照Suzuki等[8]方法，主動脈斑塊以斑塊面積/管腔總面積的比值來表示。另取12張切片進行HE染色，顯微鏡下觀察主動脈病理變化。

1.4.4 主動脈iNOS、eNOS蛋白表達的檢測主動脈iNOS、eNOS蛋白表達采用免疫組化PV法進行測定，表達強度用組織學評分表示。每組切片隨機選取5個視野（400×），計數(shù)陽性染色細胞所占視野內總細胞百分比作為iNOS、eNOS的表達強度。棕黃色顆粒為目的蛋白表達陽性著色部位，藍色為蘇木素復染細胞核著色，陽性部位主要在胞槳。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均由SPSS統(tǒng)計軟件（SPSS11．5）處理，結果以均值±標準差（）表示，采用獨立T檢驗，顯著性水平為0．05和0．01。

2 結果

2.1 ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積的變化

8周齡ApoE-/-小鼠經14周“西方類型”膳食飼養(yǎng)至22周齡時，主動脈切片經油紅O染色在顯微鏡下觀察可見，AS模型組和運動組小鼠主動脈均有不同程度的被染成紅色的脂質斑塊。與模型組相比，運動組小鼠主動脈斑塊面積顯著低于模型組（P＜0．01），見表1、圖1。表明在本實驗中耐力運動延緩了實驗動物動脈粥樣硬化的形成。

表1 ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積（）Table 1 The square ofaorta plaque in ApoE-deficientm ice（）

表1 ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積（）Table 1 The square ofaorta plaque in ApoE-deficientm ice（）

注：**與模型組相比P＜0.01（下同）。

/只斑塊面積/μm2管腔總面積/μm2斑塊面積/管腔總面積/%模型組12 288 267.00±組別樣本數(shù)68 654.61 691 238.70± 128 603.31 41.79±6.93運動組12 131 678.90± 39 061.29 467 816.60± 132 568.37 25.07±7.04**

2.2 ApoE-/-小鼠主動脈病理形態(tài)學變化

22周齡ApoE-/-小鼠主動脈冰凍切片經HE染色顯微鏡下觀察顯示，AS模型組小鼠主動脈內膜明顯增厚，可見大量泡沫細胞形成的脂紋期病變和纖維期病變，并有炎性細胞浸潤。結果提示，模型組小鼠已發(fā)生明顯的AS病變。與AS模型組相比，運動組小鼠主動脈病變相對較輕，多為脂紋期病變。提示，耐力運動能有效地抑制或減輕ApoE-/-小鼠AS病變程度。

圖1 兩組小鼠主動脈冰凍切片油紅O染色的比較（放大倍數(shù)：40、100倍）Figu re 1 The com parison ofaortic change w ith OilRed O staining using frozen section between m ice of two groups

2.3 ApoE-/-小鼠血脂的變化

由表2可見，經14周耐力運動干預后，血清TC、TG、HDLC和LDL-C等指標兩組間均無顯著性差異。提示耐力運動對ApoE-/-小鼠血脂水平未產生明顯影響。

表2 ApoE-/-小鼠血脂的變化（）Table 2 The change ofblood lipid in ApoE-deficientm ice（）

表2 ApoE-/-小鼠血脂的變化（）Table 2 The change ofblood lipid in ApoE-deficientm ice（）

HDL-C /mmo·/L-1模型組10 16.79±3.73 1.51±0.30 15.12±2.82 0.98±0.29運動組10 16.87±3.89 1.25±0.25 15.49±3.64 0.79±0.20組別樣本數(shù)TC/mmol·L-1 TG/mmol·L-1 LDL-C /mmol·L-1

2.4 ApoE-/-小鼠血清NO的變化

由表3可見，經14周耐力運動干預后，運動組小鼠血清NO水平顯著高于模型組（P＜0．05）。提示運動可以改善血管內皮功能，提高NO水平。

表3 ApoE-/-小鼠血清NO的變化（）Table 3 The change ofserum NO in ApoE-deficientm ice（）

表3 ApoE-/-小鼠血清NO的變化（）Table 3 The change ofserum NO in ApoE-deficientm ice（）

注：*與模型組相比P＜0.05。

組別樣本數(shù)/只血清NO/μm·L-1模型組10 53.39±5.87運動組10 63．79±7．58*

2.5 ApoE-/-小鼠主動脈iNOS、eNOS蛋白表達的變化

經14周耐力運動干預后，運動組小鼠主動脈iNOS蛋白表達顯著低于模型組（P＜0．01）；而eNOS蛋白表達顯著高于模型組（P＜0．01），見表4、圖2、圖3。

表4 ApoE-/-小鼠主動脈iNOS和eNOS蛋白表達（）Table 4 The protein expression ofaortic iNOS and eNOS in ApoE-deficientmice（）

表4 ApoE-/-小鼠主動脈iNOS和eNOS蛋白表達（）Table 4 The protein expression ofaortic iNOS and eNOS in ApoE-deficientmice（）

組別樣本數(shù)/只iNOS/%eNOS/%模型組12 48.29±2.33 34.93±7.63運動組12 27.98±3.25**56．98±6．84**

圖2 兩組小鼠主動脈iNOS蛋白表達的比較Figure 2 The com parison of protein exp ression ofaortic iNOS betweenmice of two groups

圖3 兩組小鼠主動脈eNOS蛋白表達的比較Figure 3 The com parison of protein exp ression ofaortic eNOS betweenm ice of two groups

3 討論

近年來，有關動脈粥樣硬化干預手段及其機制的研究日益受到關注。本研究對運動干預ApoE基因敲除小鼠AS形成及作用機制方面進行了深入探索，并獲得了一些有益的結果。

3.1 耐力運動對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積及病理變化的影響

采用基因敲除技術培育成功的ApoE基因敲除小鼠是目前AS研究領域中應用最為廣泛的基因工程動物，已成為探討AS發(fā)生發(fā)展機制和治療措施等理想的實驗動物模型[9]。本研究顯示，8周齡ApoE-/-小鼠經14周“西方類型”膳食飼養(yǎng)至22周齡時，AS模型組（安靜對照組）小鼠主動脈內膜脂質沉積廣泛，主動脈斑塊面積占管腔面積的比例達（41．79±6．93）%；主動脈切片HE染色顯示，模型組血管內膜損傷嚴重，可見大量由泡沫細胞形成的脂紋期和纖維斑塊期病變。結果表明，22周齡ApoE-/ -小鼠已形成動脈粥樣硬化。

通過14周耐力運動干預顯著抑制了ApoE-/-小鼠AS斑塊的進展，運動組小鼠主動脈斑塊面積顯著低于對照組，并且主動脈內膜損傷較輕。表明耐力運動延緩了ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成和病變程度，為耐力運動能有效地預防AS發(fā)生提供了實驗依據(jù)。

3.2 耐力運動對ApoE-/-小鼠血脂的影響

本實驗顯示，經過14周耐力運動干預后，運動組小鼠血清TC、TG、LDL、HDL水平與模型組之間無顯著性差異，表明14周中等強度的耐力運動干預對ApoE-/-小鼠血脂未產生明顯影響，這與近年來一些研究報道相一致[10-12]。我們認為，ApoE的缺失可能是造成運動對ApoE-/-小鼠血脂影響不顯著的原因之一。研究結果提示，耐力運動對ApoE-/-小鼠AS的影響可能存在著血脂之外的其它機制。

3.3 耐力運動對ApoE-/-小鼠NO/NOS系統(tǒng)的影響及其在抗AS中的作用

近年來，NO在AS發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視。內皮細胞功能障礙是AS的一個早期特征，表現(xiàn)為血管源性的NO產生減少及炎性細胞粘附分子表達增加。NO由L-精氨酸（L-Arg）在一氧化氮合酶（NOS）的催化下生成。NOS有三種亞型：神經元型NOS（nNOS）、內皮型NOS（eNOS）、誘導型NOS（iNOS）。內皮細胞表達的eNOS參與產生少量的NO，具有抗血小板聚集及抑制白細胞粘附等多種功能；iNOS可被某些炎癥介質誘導產生大量的NO，加重炎癥反應對機體造成的損害。研究表明，動脈粥樣硬化時NO合成減少，其生物學作用下降，eNOS表達下降、活性降低，而iNOS表達增強[1-2]。提示血管內皮細胞產生NO減少導致的血管功能不良是AS形成的原因之一。

已有研究報道，運動能有效地調節(jié)NO合成及NOS表達，運動可明顯升高NO水平，促進血管壁NOS表達，并增強NOS的活性[3]。Hambreoht等研究發(fā)現(xiàn)，慢性心臟病患者進行6個月體育鍛煉后，使內皮NO生成增加[4]。殷松樓將Wistar大鼠分為對照組和運動組，發(fā)現(xiàn)游泳運動組（1．5 h/d，5 d/w，共4周）主動脈NOS活性較對照組明顯增強[11]。本研究顯示，14周耐力運動干預使ApoE-/-小鼠血中NO和主動脈壁eNOS蛋白表達增加，iNOS蛋白表達降低，并有效地延緩主動脈AS的發(fā)生，表明運動對一氧化氮系統(tǒng)的調控作用可能是運動減輕動脈粥樣硬化的機制之一。

耐力運動通過改善NO/NOS系統(tǒng)機能而發(fā)揮抗AS的作用，可能與以下兩個機制有關：其一，在動脈粥樣硬化斑塊中，大量的iNOS被誘導和激活，高速、持續(xù)地產生大量NO，它與過氧化物結合生成一種氧化性更強的過氧亞硝酸鹽化合物，可使LDL發(fā)生氧化，促進AS的發(fā)展。通過耐力運動可以有效地抑制iNOS激活和表達，從而產生較少的過氧亞硝酸鹽化合物，使得運動組比模型組iNOS蛋白表達降低，AS病變減輕。其二，耐力運動促進eNOS蛋白表達和提高血中NO水平可能與運動加快血流速度、增加血管壁切應力有關。Shen W等報道，運動時心輸出量增加，血液發(fā)生重新分配，肌肉及冠狀動脈循環(huán)的血流量增多，血流加速，使血管壁剪切力增大，促使eNOS催化的NO增多[14]。由此認為，耐力運動通過促進主動脈eNOS蛋白表達、提高血中NO水平和改善血管內皮功能等而發(fā)揮抗AS的作用，這可能是獨立于血脂調節(jié)作用以外的抗動脈粥樣硬化機制。

4 結論

（1）14周耐力運動干預使ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積減少、病變減輕，從而延緩了AS的形成。（2）14周耐力運動能有效地增加ApoE-/-小鼠eNOS蛋白表達和提高生物活性形式的NO水平，并抑制iNOS蛋白表達，這可能是獨立于血脂調節(jié)作用以外的另一抗動脈粥樣硬化機制。

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The Effect of Endurance Exercise on Nitric Oxide System in Apoe-Deficient M ice and Its Intervention from A therosclerotisis

ZHANG Hongxia1,2,LIU Shanyun1,LINing1,FENGHong1,WANGHongtao1,WANGMin1,XU Xinnv3,WANG Jinhuan3
（1．Tianjin University of Sport,Tianjin 300381,China;2．Dept．of Clinical Training,Tianjin University of Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3．Key Lab of Emergence Medicine ofMOH,Tianjin First Center Hospital,Tianjin 300192,China）

Objective:The influence of endurance exercise on the function of preventing from atherosclerosis formation and effects of endurance exercise on NO system in ApoE-deficientmicewere investigated to probe possiblemechanisms of anti-atherosclerosis by endurance exercise．Methods:Twenty-four 8-week old ApoE-deficientmice were selected and divided into atherosclerosismodel group and exercise group randomly．There were twelvemice in each group．Mice of exercise group were trained on treadmill for fourteen weeks．Followings were detected:1)the square of atherosclerotic plaque and pathological change;2)the serum NO and the blood lipid;3)the protein expression of thoracic aortic iNOS and eNOS．Results:The square of aorta plaque was significantly smaller in ApoE-deficientmice of exercise group than that in mice of control group(P＜0．01)．The degree of lesion in aorta wall and tunica intima was lighter in ApoE-deficientmice with endurance exercise．The concentration of serum NO and protein expression of aorta eNOS were significantly increased(P＜0．01)in ApoE-deficientmicewith endurance exercise．The protein expression of aorta iNOSwas significantly decreased(P＜0．05)in ApoE-deficientmice with endurance exercise．There was no change on the blood lipid．Conclusions:The present study demonstrated that endurance exercisemay contribute to its anti-atherosclerosis function by significantly increasing eNOS protein expression and blood NO level aswell as inhibiting iNOS protein expression．

endurance exercise;ApoE-deficientmice;atherosclerosis;nitric oxide;nitric oxide synthase

G 804．23

A

1005-0000（2010）02-0122-03

2010-01-06；

2010-03-03；錄用日期：2010-03-06

天津市科技計劃項目（項目編號：08JCYBJC06000）

張洪俠（1978-），女，安徽宿州人，天津中醫(yī)藥大學助理實驗師。通訊作者：劉善云（1958-），女，天津市人，博士，天津體育學院教授。

1.天津體育學院，天津300381；2.天津中醫(yī)藥大學臨床實訓教學部，天津300193；3.天津市第一中心醫(yī)院衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學重點實驗室，天津300192。