鄭天慧，宋 波，姜自芹，刁桂珠，曾 蕊，吳 帥，拓 云，劉珊珊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué))

大豆花瓣蛋白雙向電泳分析技術(shù)體系的優(yōu)化*

鄭天慧，宋 波，姜自芹，刁桂珠，曾 蕊，吳 帥，拓 云，劉珊珊＊＊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué))

雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提和基礎(chǔ).本文針對大豆花瓣含有大量色素和酚等干擾物質(zhì)的現(xiàn)象，比較6種蛋白提取方法和2種蛋白裂解液配方，優(yōu)化膠條范圍和等電聚焦程序.結(jié)果表明:pH為4～7 IPG膠條適于大豆全花蛋白分離;TCA/丙酮+2D Clean Up試劑盒法去除雜質(zhì)充分，提取的蛋白含量高、純度好、分離效果佳、耗時(shí)短;蛋白裂解液采用5 mol/L尿素，2 M硫脲，2%CHAPS，2%SB3-10，5 mmol/L TCEP，20 mmol/L DTT，0.5%IPG Buffer為好;增加離心轉(zhuǎn)速、時(shí)間和丙酮清洗次數(shù)能促進(jìn)蛋白溶解，增加蛋白純度，初步建立了一套適合大豆全花蛋白雙向電泳分析的技術(shù)體系.

大豆花瓣;雙向電泳;技術(shù)體系;優(yōu)化

0 引言

花器官的正常發(fā)育是植物賴以繁衍的基礎(chǔ)［1］，20世紀(jì)80年代以來，隨著分子遺傳學(xué)手段的運(yùn)用，借助于現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合模式植物擬南芥和金魚草的花發(fā)育突變體，花發(fā)育研究在短短十幾年內(nèi)獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展.目前，關(guān)于豆科植物花型的研究表明:金魚草TCP domain基因家族的Cyc和Dich基因的主要功能是控制金魚草花的不對稱性發(fā)育和花器官的對稱性.當(dāng)Cyc和Dich基因雙突變時(shí)，金魚草花由兩側(cè)對稱轉(zhuǎn)變?yōu)檩椛鋵ΨQ，其背部和側(cè)部花瓣的形狀也發(fā)生改變.另有報(bào)道，在豆科模式植物百脈根中TCP domain基因家族的Ljcyc2基因不僅參與了百脈根花背腹極性的建立，而且還參與了花序的發(fā)育，與花序的結(jié)構(gòu)有關(guān)［2，3］.以上結(jié)果表明，通過遺傳學(xué)的手段調(diào)整豆科植物花器的形狀和大小是完全有可能的［4］.

大豆是一種嚴(yán)格的自花授粉作物，花器小，花多，花粉粘重，花朵開放前翼瓣和龍骨瓣緊緊包住雄蕊和柱頭，花藥和柱頭不外露，異花間的昆蟲傳粉及風(fēng)媒傳粉難以進(jìn)行，且易落花落莢，大田中大豆的異花授粉率不足1%，致使大規(guī)模的雜交育種需要大量的人力物力，極大的限制了大豆雜交育種的發(fā)展和雜種優(yōu)勢的利用［4-7］.探索大豆花型形成的分子基礎(chǔ)，可以幫助我們明晰大豆花型發(fā)育的分子機(jī)制，從而能動(dòng)的調(diào)控大豆花型的大小與結(jié)構(gòu)，對提高大豆產(chǎn)量有重要的理論與實(shí)踐指導(dǎo)意義.

蛋白質(zhì)組學(xué)分析是目前分離、鑒定蛋白表達(dá)差異最為有效的研究手段，該技術(shù)不僅在人類以及越來越多的微生物中廣泛研究，在植物中也越來越受關(guān)注［8-12］.雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，本文針對大豆花瓣含有大量色素和酚等干擾物質(zhì)的現(xiàn)象，比較6種蛋白提取方法和2種蛋白裂解液配方，優(yōu)化蛋膠條范圍和等電聚焦程序，初步建立了一套適合大豆全花蛋白雙向電泳分析的技術(shù)體系，為進(jìn)一步深入開展大豆花型發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為2008、2009年種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆育種試驗(yàn)田的常規(guī)大豆品種:東農(nóng)53，開花盛期取大豆全花浸入液氮中，-80℃保存用于雙向電泳分析.

1.2 蛋白提取方法與蛋白定量

1.2.1 蛋白的提取

TCA/丙酮法:參照 Damerval［13］等方法略做改進(jìn);苯酚法:參照Sarma［14］等方法，采用的蛋白提取液為 1 mM EDTA，2 mM AEBSF，2%PVPP;TCA/丙酮/酚法:在TCA/丙酮法基礎(chǔ)上獲得的蛋白沉淀再采用苯酚法進(jìn)一步抽提;Mg/NP-40抽提液結(jié)合TCA/丙酮法:參照梁書劍［15］等方法略做改進(jìn);Mg/NP-40抽提液結(jié)合 TCA/丙酮/酚法:在Mg/NP-40抽提液結(jié)合TCA/丙酮法的基礎(chǔ)上獲得的蛋白沉淀再采用苯酚法進(jìn)一步抽提.

1.2.2 蛋白質(zhì)溶解

將花瓣蛋白干粉從-80℃中取出，加入蛋白裂解液，32℃孵育 1.5 h.20℃ 13000 g離心30 min，取上清即為蛋白溶液.用TCA/丙酮+2D Clean Up試劑盒法提取的花瓣蛋白樣品，采用蛋白裂解液Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行溶解，用于蛋白溶解性的分析.蛋白裂解液Ⅰ和蛋白裂解液Ⅱ分別參照BIO-RAD雙向電泳實(shí)驗(yàn)手冊中的裂解液Ⅱ和Ⅲ.

1.2.3 蛋白質(zhì)定量

參照Bradford法［16］定量蛋白，在紫外分光光度計(jì)595 nm波長下測定光密度OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品蛋白濃度.

1.2.4 單向SDS-PAGE 參照劉珊珊［17］等方法.

1.2.5 雙向凝膠電泳

第一項(xiàng)聚焦(IEF)使用18 cm線性IPG干膠條，按照GE雙向電泳操作手冊操作，蛋白上樣量250 μg，上樣體積 400 μL，每膠條限流 50 mA，進(jìn)行等電聚焦，IEF參數(shù):設(shè)定見表2.等電聚焦結(jié)束后，取出膠條立即進(jìn)行平衡，膠條依次在平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ中分別平衡14 min和15 min.第二向電泳使用 GE電泳系統(tǒng)，20 mA/膠條 30 min，40 mA/膠條直至溴酚藍(lán)前沿抵達(dá)凝膠底部為止.電泳結(jié)束后將凝膠立即放入固定液中，固定15 min×2次，敏化30 min，去離子水漂洗15 min×3次，0.25%硝酸銀染色20 min，去離子水漂洗1 min×2次，顯色至條帶清晰，1.46%EDTA 終止10 min，去離子水漂洗5 min×3次.凝膠以反射模式掃描，分辨率為300 dpi.使用ImageMasterTM2D Platinum 6.0軟件分析蛋白凝膠.

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆花瓣蛋白雙向電泳分析蛋白提取方法的比較

在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，樣品制備是至關(guān)重要的第一步，樣品制備的成功與否決定了雙向電泳的成?。?8-20］.與DNA樣品有幾種相對固定的通用制備方法不同，雙向電泳尚沒有一種通用的蛋白樣品提取方法，因此找出適合大豆花瓣蛋白質(zhì)組學(xué)分析的蛋白提取方法至關(guān)重要［21，22］.

取相同鮮重花瓣樣品，分別用苯酚法、TCA/丙酮法、TCA/丙酮/酚法、Mg/NP40-TCA/丙酮法、Mg/NP40-TCA/丙酮/酚法和 TCA/丙酮 +2D Clean Up試劑盒法提取大豆全花蛋白，結(jié)果如表1所示.從表1中可以看出，前5種方法所提取的蛋白中，TCA/丙酮/酚法和TCA/丙酮法的蛋白產(chǎn)量最高，分別為800.0μg，777.0μg，它們的蛋白提取率也是最高的，分別為15.54%，16.00%.但是，TCA/丙酮/酚法提取蛋白所需的時(shí)間12 h，是最長的，而TCA/丙酮法所需時(shí)間6h，耗時(shí)最短.TCA/丙酮-2D Clean Up試劑盒法提取蛋白的產(chǎn)量為915.0μg，提取率為 18.30%，是所有提取方法中最高的，而此方法提取蛋白所需要的時(shí)間為6.5 h，也相對較短.以上結(jié)果表明在相同鮮重花瓣樣品的條件下，TCA/丙酮-2D Clean Up試劑盒法所提取的蛋白產(chǎn)量最多，蛋白提取量最高，所需時(shí)間較短且操作簡單.

表1 不同蛋白提取方法提取效率的比較

2.2 不同蛋白提取方法單向SDS-PAGE凝膠圖譜分辨率的比較

應(yīng)用不同蛋白提取方法，提取相同重量的大豆盛花期全花蛋白，然后以相同的蛋白上樣量進(jìn)行單向電泳，其單向聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同方法提取大豆花瓣蛋白的單向電泳SDS-PAGE圖譜

從圖1中可以看出，TCA/丙酮法(第1泳道)在相對分子量200.0～14.3 kDa范圍內(nèi)提取的蛋白最全面;苯酚法(第2泳道)在分子質(zhì)量97.2 kDa附近蛋白條帶較少.TCA/丙酮/酚法(第3泳道)提取的蛋白在分子量87.0 kDa附近條帶少.Mg/NP40-TCA/丙酮法(第4泳道)提取的蛋白在相對分子量97.2 kDa附近和44.3 kDa以下蛋白條帶少.Mg/NP 40-TCA/丙酮/酚法(第 5泳道)提取的蛋白在分子量44.3 kDa以下范圍，較TCA/丙酮法(第1泳道)、苯酚法(第2泳道)、TCA/丙酮/酚法(第3泳道)蛋白條帶少.幾種方法提取蛋白的單向SDS-PAGE表明，苯酚法，TCA/丙酮/酚法，Mg/NP40-TCA/丙酮法以及Mg/NP40-TCA/丙酮/酚法在蛋白提取方面均不充分，存在一定的缺陷，選擇TCA/丙酮法提取的蛋白最全面.

2.3 不同蛋白提取方法雙向電泳分析分辨率的比較

為了更清楚地分析幾種蛋白提取方法的優(yōu)劣，將 TCA/丙酮、TCA/丙酮/酚、Mg/NP40-TCA/丙酮、Mg/NP40-TCA/丙酮/酚、TCA/丙酮+2D Clean Up試劑盒法提取的蛋白分別進(jìn)行雙向電泳分析.凝膠經(jīng)過銀染后，可以看出這5種提取方法所提取的蛋白均能分離出幾百個(gè)蛋白點(diǎn)，但效果有明顯差異(圖2).經(jīng)過TCA/丙酮法(圖2-A)提取的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)密集，但酸性端聚焦不好.而TCA/丙酮經(jīng)過2D Clean Up試劑盒法(圖2-E)處理過的蛋白樣品分離效果好，圖像清晰，尤其是能改變酸性端聚焦不好的效果，且多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)性、敏感性、清晰度均良好，所以采用TCA/丙酮+2D Clean Up試劑盒法提取大豆花瓣蛋白是最佳的選擇.

圖2 不同蛋白提取法的雙向電泳圖譜

2.4 蛋白裂解液的比較

采用兩種不同的蛋白裂解液(裂解液I和裂解液II)處理用TCA/丙酮+2D Clean Up試劑盒法提取的蛋白樣品，然后進(jìn)行雙向電泳分析，結(jié)果如圖3.可以看出，對于相同的蛋白樣品，不同裂解液的溶解性及分辨率差異顯著，裂解液Ⅱ(如圖3-A)對蛋白的溶解能力比裂解液I(如圖3-B)的溶解力強(qiáng).應(yīng)用ImageMasterTM2D Platinum 6.0軟件對雙向電泳圖譜進(jìn)行分析處理，識(shí)別出相同區(qū)域裂解液Ⅱ(如圖3-C)蛋白點(diǎn)數(shù)為28個(gè)，裂解液Ⅰ(如圖3-D)蛋白點(diǎn)數(shù)僅為10個(gè).由此可見，對于TCA/丙酮+2D Clean Up試劑盒法提取的蛋白樣品，裂解液II的溶解性更強(qiáng)，分辨率更高.

圖3 不同裂解液溶解性及分辨率局部放大比較圖

2.5 大豆花瓣雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化確定

2.5.1 膠條范圍的確定

因?yàn)闆]有前人做過大豆花瓣雙向電泳的相關(guān)研究，所以我們先用寬pH范圍的3～10、線性梯度膠條觀察大豆花瓣蛋白的整體分布，結(jié)果如圖4.從圖中可以看出，大豆花瓣蛋白的等電點(diǎn)多數(shù)集中分布于pH 4～7范圍內(nèi)，所以，確定大豆花瓣雙向電泳分析選用18 cm pH 4～7范圍、線性梯度的膠條.

2.5.2 水化

等電聚焦前的膠條水化分為主動(dòng)水化和被動(dòng)水化.主動(dòng)水化是給膠條兩端加上一個(gè)較低的電壓，可以促進(jìn)大相對分子質(zhì)量(200.0～97.2 kDa附近范圍)的蛋白進(jìn)入膠條，但同時(shí)會(huì)損失一部分小相對分子質(zhì)量蛋白.被動(dòng)水化則是不加電壓，可避免因主動(dòng)水化而損失小分子量蛋白，一般室溫20℃左右，多采用被動(dòng)水化.雙向電泳檢測(圖4)結(jié)果表明:大豆花瓣蛋白在分子量97.2～200.0 kDa附近幾乎沒有蛋白，所以本試驗(yàn)IPG膠條水化時(shí)選擇被動(dòng)水化，水化16 h.水化后的膠條大約0.5 mm厚，水化盤中幾乎沒有樣品，說明樣品已經(jīng)完全被膠條吸收.

圖4 大豆花瓣蛋白雙向電泳圖譜(pH 3～10膠條)

2.5.3 等電聚焦程序

大豆花瓣中的干擾物質(zhì)較多，提取的蛋白質(zhì)溶液中仍會(huì)存在一些鹽類的干擾物質(zhì).為了充分除鹽，將聚焦開始的低壓除鹽的時(shí)間選擇了加倍.由于該實(shí)驗(yàn)樣品的前期處理良好，第四步聚焦的電壓能上升至10000 V，因此為了提高聚焦效果，將第四步驟電壓調(diào)整到10000 V.適合大豆花瓣雙向電泳分析的等電聚焦程序如表2.

表2 適合大豆花瓣雙向電泳分析的等電聚焦程序

2.5.4 SDS-PAGE

第二向在Ettan DALTsix GE Healthcare垂直板電泳儀上進(jìn)行，SDS-PAGE凝膠終濃度(T)為12.5%，凝膠面積20 ×20 cm2，厚度1 mm。采用Laemmli 12%T分離膠濃度的系統(tǒng)，用0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖密封液固定膠條，首先設(shè)置20 mA/gel的恒流條件，1 h后待溴酚藍(lán)條帶完全移入聚丙烯酰胺凝膠后調(diào)至40 mA/gel，至溴酚藍(lán)前沿接近凝膠底部時(shí)電泳結(jié)束.由此確定大豆花瓣雙向電泳分析中，第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳的程序和時(shí)間為 20 mA 1 h，40 mA 8 h.

2.5.5 染色

雙向電泳分離蛋白質(zhì)常規(guī)檢測和定量的染色方法是考馬斯亮藍(lán)和硝酸銀染色法，通過實(shí)驗(yàn)確定，滿足一次雙向電泳分析，采用銀染顯色，大豆花瓣蛋白上樣量最少需要200 μg.采用膠體考染，蛋白上樣量最需要250 μg.實(shí)驗(yàn)表明，考馬斯亮藍(lán)和質(zhì)譜技術(shù)兼容性好，然而考馬斯亮藍(lán)染色的靈敏度要比銀染低2～3個(gè)數(shù)量級;Oakley等的銀染方法雖已被廣泛使用，且靈敏度很高，但由于銀染過程中醛類與緩沖液中的甘氨酸發(fā)生特異反應(yīng)，影響后續(xù)的質(zhì)譜操作，一些經(jīng)過改進(jìn)與質(zhì)譜兼容的銀染方法也由于質(zhì)譜圖噪音信號太強(qiáng)而影響鑒定結(jié)果.由于大豆花瓣小，蛋白質(zhì)含量低，取樣困難，因此在大豆花瓣的蛋白質(zhì)組研究中我們選用銀染方法進(jìn)行2-DE凝膠的分析，而加大蛋白質(zhì)樣品上樣量后，用考馬斯亮藍(lán)染色方法進(jìn)行蛋白點(diǎn)切取以備質(zhì)譜鑒定.

3 討論

蛋白樣品的制備是雙向電泳技術(shù)最基礎(chǔ)、最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，合理的樣品制備是保證獲得分辨率高和重復(fù)性好的雙向電泳圖譜的前提.這一處理的好壞直接影響到雙向電泳的結(jié)果.大豆花瓣組織由于本身特有的成分，其蛋白質(zhì)提取比動(dòng)物、微生物及一些植物葉片更為復(fù)雜.除了采用優(yōu)化的技術(shù)體系，在操作過程中還應(yīng)盡量減少蛋白提取過程中的降解和丟失，以提高分辨率;為提高大豆花瓣高、低分子量全蛋白的抽提效率，應(yīng)盡量簡化樣品處理步驟.

要得到大豆花瓣總蛋白，除對大豆花瓣組織細(xì)胞進(jìn)行有效的破碎外，利用變性劑、表面活性劑、兩性電解質(zhì)、還原劑等成分可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的有效裂解.本實(shí)驗(yàn)對兩種裂解液進(jìn)行對比分析，結(jié)果表明蛋白蛋白裂解液Ⅱ(含有尿素、硫脲、CHAPS及TCEP)的溶解性比裂解液Ⅰ(含有尿素、硫脲及CHAPS)更強(qiáng)，分辨率更高.可見由高濃度的尿素和硫脲以及SB3-10的聯(lián)用，可以強(qiáng)烈破壞蛋白分子間形成的氫鍵，從而防止由氫鍵引起的蛋白質(zhì)聚集及蛋白遷移中二級結(jié)構(gòu)的形成.去污劑和表面活性劑CHAPS和SB3-10可以減少脂類污染.破壞蛋白之間的疏水性互作，增加疏水性蛋白的溶解.

因?yàn)榇蠖够ò杲M織中的干擾成分較復(fù)雜，根據(jù)GE公司推薦的雙向電泳聚焦參數(shù)及二向電泳參數(shù)，該實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行優(yōu)化，將低壓除鹽的時(shí)間加大了一倍，使其除鹽充分，減少了雙向電泳過程中因?yàn)橐恍}離子及雜質(zhì)的干擾而產(chǎn)生的橫縱條紋.

4 結(jié)論

TCA/丙酮-2D Clean Up試劑盒法可初步解決大豆花瓣中多糖、脂類、色素等雙向電泳嚴(yán)重干擾的問題;由5 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%CHAPS，2%SB3-10，5 mmol/L TCEP，20 mmol/L DTT，0.5%IPG Buffer配制的裂解液是一種高強(qiáng)度的有效的裂解大豆花瓣蛋白的裂解液;結(jié)合TCA/丙酮-2D Clean Up試劑盒法可以獲得分辨率更高的雙向電泳圖譜;采用pH4-7范圍的線性膠條，同時(shí)結(jié)合高伏時(shí)、長時(shí)間的等電聚焦可以獲得高分辨率、重復(fù)性好的大豆花瓣蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜.

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Optimization of Two-Dimensional Gel Electrophoresis for Proteome of Soybean(Glycine Max L.Merril)Floret

Zheng Tianhui，Song Bo，Jiang Ziqin，Diao Guizhu，Zeng Rui，Wu Shuai，Tuo Yun，Liu Shanshan
(Northeast Agricultural University)

Protein extraction methods and electrophoresis conditions are the key of two dimensional electrophoresis technologies in proteomics research.A two dimensional electrophoresis technology system for soybean full flower protein is established.There are many pigments，phenol and other interfering substances in the soybean petals，so six protein extraction methods and two protein analysis buffer are compared to improve protein extraction methods，and the range of IPG strip and isoelectric focusing procedure are optimized.The results show that TCA/acetone+2 D Clean Up kit remove most impurities，yield the high protein content，good separation and short time-consuming;The analysis buffer containing 5 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，2%CHAPS，2%SB3-10，5 mmol/L TCEP，20 mmol/L DTT，0.5%IPG Buffer has good dissolving ability.Increasing the centrifugation speed，time，and the times of acetone washing can promote the dissolving of protein and increase protein purity.pH 4 ～7 IPG strip is suitable for separation of soybean full flower protein.A two dimensional electrophoresis proteome analysis technology system for soybean full flower proteins is established.

Soybean;Two dimensional electrophoresis;Technology system;Optimization

2010-09-28

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071440);黑龍江省普通高等學(xué)校青年骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(1155G12);博士后研究人員落戶黑龍江科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2009HB009);轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)子任務(wù):抗病蟲轉(zhuǎn)基因大豆新品種培育資助項(xiàng)目(2008ZX08004-004)

＊＊通訊作者

(責(zé)任編輯:李佳云)